Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

Summary

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Abstract

Células ciliar são células mecanosensoriais que mediam o sentido de audição. Essas células não se regeneram após danos em humanos, mas são naturalmente reabastecidas em vertebrados não-mamíferos, como o zebrafish. O sistema de linha lateral zebrafish é um modelo útil para caracterizar a regeneração celular sensorial. A linha lateral é composta por órgãos contendo células ciliar chamadas neuromass, que são ligados por uma série de células interneuromast (INMCs). Os INMCs atuam como células progenitoras que dão origem a novos neuromass durante o desenvolvimento. Os INMCs podem reparar lacunas no sistema de linha lateral criado por morte celular. Um método é descrito aqui para ablação seletiva do INMC usando um microscópio confocal convencional de varredura a laser e peixes transgênicos que expressam proteína fluorescente verde em INMCs. A microscopia de lapso de tempo é então usada para monitorar a regeneração do INMC e determinar a taxa de fechamento de lacunas. Isso representa um protocolo acessível para ablação celular que não requer equipamento especializado, como um laser ultravioleta pulsado de alta potência. O protocolo de ablação pode servir a interesses mais amplos, pois pode ser útil para a ablação de tipos de células adicionais, empregando um conjunto de ferramentas que já está disponível para muitos usuários. Essa técnica permitirá ainda a caracterização da regeneração do INMC em diferentes condições e de diferentes origens genéticas, o que avançará na compreensão da regeneração celular progenitora sensorial.

Introduction

No cerne da perda auditiva mais progressiva está a destruição de células ciliares sensoriais, que transduzim estímulos auditivos extrínsecos em impulsos nervosos detectáveis pelo cérebro. A morte da célula ciliar coclear causa perda auditiva permanente, já que os mamíferos adultos não têm a capacidade de regenerar essas células após danos. Por outro lado, vertebrados não-mamíferos, como o zebrafish, podem regenerar células ciliares perdidas por trauma acústico ou insulto otoxico. A linha lateral mecanosensrial de zebrafish é um sistema de órgãos simples e facilmente manipulado que pode ser usado para estudar a regeneração das células ciliar^1,2,3.

A linha lateral consiste em pequenas manchas sensoriais chamadas neuromass, que são conectadas durante o desenvolvimento por uma cadeia de células alongadas conhecidas como células interneuromast (INMCs). Dada a sua capacidade proliferativa como células-tronco aparentes que dão origem a novos órgãos contendo células ciliares, o comportamento dos INMCs é de grande interesse para a comunidade^4,5. Grande parte das pesquisas relativas aos INMCs caracterizou a supressão de sua proliferação por células schwann próximas que envolvem o nervo da linha lateral, provavelmente através de um inibidor de sinalização Wnt/β-catenin. ^6,7,8. Embora a regulação da proliferação e diferenciação do INMC em novos neuromass tenha sido bem descrita, os mecanismos que regem o recrescimento do INMC após a ablação não foram elucidados. Este protocolo serve como um meio de ablação de INMCs individuais e análise de seu comportamento regenerativo subsequente.

Uma variedade de métodos para destruir células ciliar, células de apoio e neuromass inteiros foram publicados, juntamente com metodologias para monitorar a recuperação. A ablação química funciona bem para as células ciliadas, mas doses de produtos químicos tóxicos como o CuSO₄ devem ser significativamente aumentadas para remover outros tipos de células de linha lateral⁹. Embora a eletroapiação sob microscopia de fluorescência seja um meio eficaz e simples de destruir INMCs para estudar a regeneração, é difícil atingir de forma restrita e, portanto, é provável que produza danos colaterais significativos. Como resultado, isso pode mascarar aspectos de comportamentos específicos do INMC^10,11. Protocolos de ablação a laser foram empregados, mas exigem o uso de equipamentos especializados não necessariamente presentes no laboratório médio ou instalação de imagem (ou seja, lasers UV pulsados de alta potência¹²). O método descrito aqui pode ser realizado com qualquer microscópio confocal de varredura a laser equipado com o laser comum de 405 nm, geralmente usado para imagem DAPI e outros fluoroforos azuis. Uma vantagem deste método é que a imagem confocal pode ser realizada imediatamente antes e depois do dano celular sem envolver nenhum sistema adicional de controle de laser ou transferir para outro microscópio equipado com um laser pulsado.

Um método semelhante foi descrito para ablação de neurônios na medula^{espinhal zebrafish 13}. No entanto, o método anterior requer um módulo FRAP para ablação celular, o que não é um requisito para este protocolo. Além disso, dadas as distintas propriedades de diferentes tipos de células (ou seja, brilho da fluorescência transgênica, profundidade dentro do corpo e forma celular), é provável que modificações significativas sejam necessárias dependendo do tipo de célula utilizada. O protocolo detalhado aqui é mais provável que seja eficaz para células mais superficiais, como apoiado por uma demonstração de ablação de células ciliadas sensoriais usando o mesmo método. Também está delineado um ensaio de regeneração para avaliar as taxas de recuperação do INMC após a ablação, o que não foi uma característica do estudo acima mencionado.

O protocolo de ablação celular baseado em laser aqui detalhado captura a capacidade regenerativa dos INMCs através da otimização de condições de laser, imagens pré e pós-ablação e microscopia de lapso de tempo. Esses elementos se unem para retratar de forma abrangente o crescimento e o fechamento de lacunas da INMC em sua totalidade. Embora este protocolo seja usado aqui para destruir INMCs, ele pode ser aplicado a outros trabalhos que exigem avaliação confiável e eficaz da ablação celular. É também uma tecnologia acessível, uma vez que pode ser conduzida em qualquer microscópio confocal equipado com um laser de 405 nm.

Protocol

Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Pace, sob o protocolo 2018-1.

1. Preparação de larvas de zebrafish

1. Configurado acasalamento 3-5 dias antes de realizar o experimento, de tal forma que as larvas serão de 2 dias após a fertilização (dpf) a 4 dpf em idade quando montadas para ablação a laser.
   NOTA: A linha de armadilhas de aprimoramento et(krt4:EGFP)sqEt20 (abreviada como ET20), na qual as células interneuromast são claramente rotuladas com proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP), permite a identificação celular relativamente fácil e ablação^11,14. Para confirmação da especificidade e flexibilidade da ablação a laser, os peixes ET20 são criados com peixes Tg (neuroD:tdTomato),nos quais o nervo da linha lateral é rotulado com proteína fluorescente vermelha ou com Tg (myo6b:βactin-GFP) para rotular células ciliadas sensoriais com GFP^15,16.
2. Após a coleta de embriões no dia seguinte, incubar embriões a 28,5 °C em meio E3 contendo 0,0001% azul de metileno até estar pronto para anestesiar e montar.

2. Preparação de soluções de baixa gelagem agarose e tricaine

1. Para um frasco de vidro Erlenmeyer de vidro de 250 mL, adicione 48 mL de 1x E3 médio, 2 mL de 15 mM tricaine stock solution e 0,5 g de agarose de baixo derretimento.
2. Micro-ondas a solução em alta para 30 s e redemoinho (usando luvas de proteção térmica) para dissolver a agarose. Repita os ciclos de aquecimento de 30 s até que a garose esteja totalmente dissolvida.
3. Armazene a agarose em uma incubadora aquecida a 42 °C até estar pronta para uso.

3. Anesthetização de larvas de zebrafish

1. Para um tubo cônico de 50 mL, adicione 24 mL de 1x E3 médio e 1 mL de solução de estoque tricaine (15 mM) a uma concentração final de 600 μM. Redemoinho para misturar.
2. Carregue um dos seis poços de uma placa de cultura celular de fundo plano com 8 mL de E3 contendo 600 μM tricaine.
3. Use uma pipeta de transferência para mover larvas de zebrafish em uma inserção de transferência com fundo de malha de 74 μm.
4. Transfira a inserção com fundo de malha para o poço da placa de seis poços contendo a solução E3 + tricaine. Deixe as larvas permanecerem no poço por um mínimo de 3 minutos ou até serem anestesiadas. Teste anestesia tocando na pastilha. Larvas não devem assustar e nadar em resposta à torneira.

4. Triagem fluorescente de larvas de zebrafish anestesiadas

1. Pipeta uma larva anestesiada por poço em 12 lâminas bem revestidas de hidrofóbicas para triagem. Certifique-se de que há curvatura mínima do menisco formado em cada poço do slide para reduzir a distorção óptica durante a triagem. Isso pode ser feito removendo um pequeno volume de E3 de cada poço depois de colocar as larvas.
2. Sob um objetivo de 10x em um microscópio vertical (equipado com uma lâmpada de arco de mercúrio, lâmpada de metal-halido, ou fonte de luz LED e um cubo de filtro apropriado), tela para larvas que expressam eGFP nos neuromasts e células interneuromast do sistema de linha lateral.
   1. Selecione larvas com expressão mais forte resultando em eGFP mais brilhante, que presumivelmente são homozigosas para o transgene.
      NOTA: Na linha ET20, o eGFP é expresso em um anel de células de manto ao redor de cada neuromast, bem como na estreita faixa de células interneuromast que conectam esses órgãos. A expressão eGFP mais forte (fluorescência mais brilhante) contribui para uma ablação mais eficaz.
   2. Para examinar a especificidade da ablação, utilize larvas transgênicas duplas com transgênicos ET20 e Tg (neuroD:tdTomato). Se a triagem para portadores de Tg (neuroD:tdTomato), use o conjunto de cubos de filtro RFP para identificar um patch vermelho brilhante apenas posterior ao ouvido representando o gânglio posterior da linha lateral.
   3. Para ablatar células ciliares nos neuromass da linha lateral, use a linha transgênica Tg(myo6b:βactin-GFP) e tela para localização de GFP no centro de cada neuromasto.
3. Selecione larvas com espaçamento estereotipado dos neuromass. Diferenças no espaçamento entre neuromass podem indicar deposição neuromaste anormal durante o desenvolvimento, sugerindo comportamento migratório defeituoso ou proliferação celular na linha lateral primordium¹⁷. Tais defeitos também podem afetar o comportamento migratório ou regenerativo dos INMCs após a ablação.
   NOTA: Defeitos comuns no espaçamento incluem uma distância extraordinariamente grande entre o neuromast anterior mais depositado pelo primeiro primordium migratório (prim1L1) e o segundo neuromast depositado pelo mesmo primordium (prim1L2), frequentemente associado à aglomeração dos neuromasts mais posteriores.

5. Montagem de larvas para ablação a laser e imagem

1. Pipeta 3 - 4 larvas anestesiadas em uma pequena gota de solução E3/tricaine no centro de um prato com fundo de deslizamento de cobertura (prato de 35 mm com um deslizamento de cobertura de 14 mm número 1.5). Remova o excesso de solução para que as larvas permaneçam em uma pequena gota, apenas grande o suficiente para contê-las.
2. Transfira o prato para o estágio de um microscópio estéreo binóculo e manipule o zoom e o foco para que todas as larvas estejam no campo de visão.
3. Remova o frasco de Erlenmeyer contendo o ponto de fusão baixo da incubadora aquecida. Use uma pipeta de transferência para transferir a solução agarose para o slide de cobertura para produzir uma camada fina. Desenhe o excesso de agarose até que o líquido apenas encha o poço na parte inferior do prato, tomando cuidado para não aspirar nenhuma larva.
4. Organize rapidamente as larvas na solução agarose usando uma faca de cabelo ou laço de cabelo para que elas estejam alinhadas umas com as outras e orientadas com rostral para a esquerda.
5. Pressione suavemente as larvas contra o vidro com a faca de cabelo, de tal forma que elas se deitem no perfil com os lados direito para baixo. Larvas com mais de 3 dpf tendem a flutuar devido às suas bexigas de natação infladas, por isso podem precisar ser repetidamente pressionadas contra o vidro até que a agarose comece a gelar.
6. Depois de cerca de 60 s, a agarose começará a se solidificar, e as larvas não poderão ser reorientadas. Deixe aproximadamente 5 minutos em temperatura ambiente para que a agarose no deslizamento da tampa se solidifique completamente. Uma vez que a agarose tenha solidificado, use uma pipeta de transferência para encher o prato no meio do caminho com E3 contendo 1x tricaine.

6. Localização de alvos prospectivos e imagens de pré-ablação

1. Ligue a energia para o sistema de microscopia confocal de varredura a laser e inicialize através do software de imagem integrado. Selecione o objetivo de imersão do óleo Plan-Apochromat 63x (abertura numérica 1,40) ou similar. Aplique óleo de imersão e fixe o prato em um estágio circular insira tal forma que as larvas encarrem com seu aspecto rostral à esquerda.
2. Sob iluminação de contraste de campo brilhante ou interferência diferencial, selecione uma das larvas montadas para imagem. Ajuste o foco com o botão de foco de modo que a pele na lateral do peixe mais próximo do deslizamento de tampa esteja em foco, reconhecível pelo padrão de impressão digital das células periderm.
3. Uma vez em foco, mude para iluminação epifluorescente no canal GFP. Localize a linha lateral posterior pela expressão GFP ao longo do myoseptum horizontal. Anéis de células fluorescentes indicam células de manto neuromass, e fios alongados de células são células interneuromast.
4. Começando com o neuromast primIL1, geralmente localizado apenas dorsal para a gema, use o joystick de controle de palco ou outro controle de movimento de palco para digitalizar visualmente caudally ao longo do myoseptum horizontal.
   1. Siga a cadeia de células interneuromast até chegar à região entre os neuromasts primIL3e primIL4 (L3 e L4).
      NOTA: Outras regiões também podem ser alvo, mas esta seção do tronco e da cauda tende a ser mais próxima do vidro de cobertura e, portanto, mais agradável à ablação.
   2. Se a imagem de várias larvas, defina a posição do primeiro estágio e, em seguida, inative a opção de posições de vários estágios, desmarcando a caixa de seleção apropriada.
   3. Repetição de passos 6.4.1-6.4.2. para cada posição de estágio desejada (cada larva).
5. Após a identificação de corpos celulares na região L3-L4, mude para o modo de aquisição.
   1. Ative uma faixa de imagem GFP usando o laser de 488 nm ou 491 nm.
   2. Adicione um canal de luz transmitida (tubo fotomultiplier de luz transmitido ou T-PMT) à faixa laser ativada de 488 nm ativada ativando a caixa de seleção T-PMT sob o menu suspenso "Configuração de imagem".
   3. Ajuste a potência do laser para 6%, tamanho do pinhole para 1 unidade arejada equivalente e ganho digital para 750 para imagens de larvas ET20. O ganho exato e a potência do laser podem variar para qualquer larva, dependendo da proximidade com o deslizamento da tampa e do brilho da fluorescência. Ajuste o ganho de tal forma que os corpos celulares estão saturados para capturar projeções fracas e filipodia.
   4. Ajuste os parâmetros para um tamanho de quadro de 1024 pixels x 1024 pixels, zoom digital de 0,7 (145,2 μm x 145,2 μm de tamanho de imagem). Defina a média de 2 para melhorar a qualidade da imagem.
6. Verifique a caixa z-stack para trazer o menu suspenso de posição z. Enquanto estiver em rápida varredura, concentre-se até que as células interneuromast estejam fora de foco. Defina a primeira fatia e, em seguida, concentre-se através da amostra até que as células interneuromast estejam novamente fora de foco. Coloque a última fatia. Certifique-se de que engloba uma pilha z de aproximadamente 25 μm. Defina o intervalo de imagem para 1 μm.
7. Inicie o experimento para capturar uma pilha z de pré-ablação(Figura 1B). Se as posições do estágio tiverem sido adicionadas, inativar a opção de posições para que apenas a posição atual seja visualizada. Salve o arquivo assim que for capturado.

7. Ablação a laser de corpos celulares

1. Clique em "Mostrar todas as ferramentas". Esta opção está localizada no topo da interface de aquisição.
2. Clique no menu suspenso para "Imaging Set Up". Em "Imaging Set up", clique em " Adicionar uma novafaixa" (representada como "+").
3. Em "Imaging Set Up", clique no menu suspenso para "Dye". Selecione DAPI como corante.
4. Clique no menu suspenso para "Canais" e desmarque todas as outras faixas deslaculando suas respectivas caixas de seleção. Certifique-se de que apenas a faixa DAPI esteja selecionada.
5. Na faixa DAPI, clique em 405 para aconfiguração" Laser ". Aumente a potência laser para 75%. Desprese o canal DAPI para desligar o laser enquanto procura corpos de células candidatos para ablação.
6. Com o corpo de uma célula interneuromast centrada no campo de visão, amplie o quadro de varredura para 20x-22x. A posição do quadro pode precisar ser ajustada para manter o corpo celular no centro à medida que o zoom é aplicado. Pare de digitalizar ao vivo assim que o corpo da célula preencher o campo de visão.
   NOTA: O corpo celular deve ocupar todo o campo de visão. Neste nível de zoom, o GFP irá branquear rapidamente. Minimize o tempo de exposição ao laser trabalhando rapidamente. Use zoom em vez de selecionar uma região de interesse para aumentar a distribuição de energia a laser sobre uma pequena área.
7. Verifique a caixa do obturador a laser de 405 nm para ativar a pista. Ajuste a potência do laser para 75%. Defina um temporizador para 45 s. Ative a varredura contínua e inicie o temporizador. Pare de digitalizar imediatamente aos 45 s.

8. Imagem pós-ablação e microscopia de lapso de tempo para estudar regeneração

1. Clique no menu suspenso para "Canais". Nos canais, desprese a faixa "DAPI" para inativar o laser de ablação. Clique no menu suspenso para "Modo aquisição".
2. No modo de aquisição, clique em "Zoom".
3. Diminua o zoom para 0,7 usando o controle deslizante ou digitando em "0,7".
   1. Para garantir a ablação celular bem sucedida, aumente o ganho para 900 e escaneie rapidamente o campo de visão.
      NOTA: Nenhum GFP deve ser visível dentro da célula ou células alvo. Se a fluorescência ainda for observada, retorne aos passos 7.1-7.3.
   2. Usando as mesmas configurações ou similares descritas para imagens de pré-ablação, capture e salve uma imagem pós-ablação(Figura 1C). Se a imagem revelar remanescentes de células fluorescentes ou corpos celulares adicionais que precisam ser removidos, repita os passos de ablação a laser para criar uma lacuna visível na cadeia de células interneuromast.
   3. Inspecione a imagem do canal T-PMT para confirmar ainda mais os danos celulares. As células danificadas terão uma aparência granular, e frequentemente os núcleos incharão ou se tornarão irregulares de forma(Figura 2).
4. Depois de capturar uma imagem de pré-ablação, ablando as células conforme necessário e capturando uma imagem pós-ablação para cada posição de estágio individual, configure a microscopia de lapso de tempo ativando as opções de posição do estágio e de tempo para captura de imagens. Defina os parâmetros de tempo para 24h ou outro ponto final desejado e intervalos de 15 minutos. Inicie o experimento para adquirir imagens e salve o arquivo resultante quando concluído (no dia seguinte).
5. Se as larvas forem mais estudadas ou levantadas, remova-as cuidadosamente da agarose usando fórceps finos, transfira para o meio E3 sem tricaine para recuperação. Se eles não forem usados mais adiante, eutanize de acordo com o protocolo animal aprovado (a imersão rápida e sustentada em um banho de gelo é um método comum) e elimine-os conforme exigido pela instituição.

9. Análise de imagem

1. Abra um arquivo z-stack pós-ablação no software de processamento de imagem preferido(Tabela de Materiais). Divida os canais de tal forma que cada canal esteja em um painel de visualização separado.
2. Na janela do canal GFP, use a ferramenta de linha para desenhar uma linha reta entre as pontas dos INMCs restantes. Isso pode ser auxiliado por rolar para cima e para baixo através da pilha z ou realizando uma projeção de intensidade máxima antes de desenhar a linha.
3. Use a ferramenta "Medida" para obter a distância entre as extremidades INMC nos x-e y-planes.
4. Role as fatias z na pilha z original para determinar a distância entre OSS no z-plane.
5. Calcule a distância total entre as extremidades do INMC utilizando o teorema pitagórico (a² + b² = c²). A hipotenusa é a distância total (ou tamanho de lacuna).
6. Digite a medição de distância resultante em um aplicativo de planilha para análise de dados.
7. Revise os arquivos de microscopia de lapso de tempo coletados na etapa 8.2-8.3 usando o software de imagem integrado no sistema confocal ou software de análise de imagem livremente disponível. Identifique o ponto de tempo em que a lacuna entre as células interneuromast foi preenchida por projeções celulares. Isso pode ser auxiliado pelo exame de múltiplas fatias z para confirmar o fechamento da lacuna em todas as dimensões.
8. Para obter a medição mais precisa do tempo para o fechamento de lacunas, use o carimbo de tempo de imagem pós-ablação (visível no Finder ou no File Explorer) como o ponto de tempo zero; medir o tempo desde o início da pilha de imagens de lapso de tempo pode resultar em subestimar o tempo para o fechamento, dependendo de quanto tempo passou enquanto ablava posições adicionais de estágio, etc.
9. Derivar a taxa de fechamento simplesmente dividindo o tamanho original da lacuna (μm) pelas horas ou minutos necessários para o fechamento completo da lacuna.

Representative Results

Para ablatar INMCs e registrar a regeneração, as larvas de zebrafish expressas em GFP da linha transgênica ET20 foram montadas a 2 ou 3 dias após a ablação para ablação, conforme descrito na etapa 5.4. Vários peixes podem ser montados simultaneamente para que vários lapsos de tempo possam ser capturados em um único experimento. A região da linha lateral localizada entre os neuromass primIL3 e primIL4 foi identificada, e imagens de pré-ablação foram capturadas conforme descrito nas etapas 6.5-6.7 (Figura 1A,B).

Três corpos celulares foram alvo de ablação a laser para criar uma lacuna na sequência INMC de aproximadamente 40 μm. A varredura pós-ablação com alto ganho e imagem subsequente confirmou que nenhum corpo celular permaneceu na região ablada, deixando uma lacuna entre projeções alongadas dos INMCs adjacentes(Figura 1C). A morte celular foi demonstrada pelo exame do canal T-PMT após a ablação. As células danificadas e moribundas foram marcadas por núcleos inchados e de forma irregular, bem como uma aparência granular(Figura 2, delineada). Em alguns casos, as imagens de lapso de tempo também revelaram o recrutamento de grandes células amepilóides que eram provavelmente macrófagos(Figura 2, asterisco). Áreas escuras ao redor dos INMCs ablados indicaram fotobleaching em células periderm excessivamente. Essas células não pareciam estar danificadas ou destruídas pela irradiação a laser nesses experimentos; em vez disso, sua fluorescência foi temporariamente reduzida. A microscopia de lapso de tempo revela que essas células normalmente se recuperam após a ablação e não mudam de forma ou aparecem danificadas (resultados inéditos, Volpe et al.).

Para suportar a especificidade da destruição do INMC, as ablações foram realizadas em larvas ET20 e Tg (neuroD:tdTomato) nas quais o nervo da linha lateral (que corre apenas mícrons abaixo das células interneuromast) é rotulado com proteína fluorescente vermelha. As ablações de várias células que criaram lacunas consideráveis na corda INMC tiveram pouco ou nenhum efeito no nervo da linha lateral com base na fluorescência vermelha(Figura 3). A flexibilidade da técnica para ablação de células superficialmente localizadas foi demonstrada pela destruição seletiva de células ciliadas sensoriais individuais dentro de neuromastes da linha lateral. Usando essencialmente o mesmo protocolo detalhado acima (seções 7 e 8), as células ciliadas únicas em larvas transgênicas Tg (myo6b:βactin-GFP) foram destruídas sem danos aparentes às células adjacentes(Figura 4). As células ciliadas abladas não recuperaram a fluorescência após microscopia de lapso de tempo, e seus núcleos foram visivelmente granulares e disformes após a exposição ao laser(Figura 4B). Semelhante às ablações do INMC, macrófagos aparentes eram frequentemente recrutados para o local de exposição a laser (resultados inéditos, Volpe et al.).

Após a ablação a laser e captura de imagem pós-ablação, o tamanho da lacuna foi medido usando software de análise de imagem livremente disponível. A ferramenta de medida demonstrou tamanhos de lacunas que variam de apenas alguns mícrons até 100 mícrons, dependendo da largura dos INMCs individuais e quantas células foram escolhidas para ablação(Figura 5). A microscopia timelapse foi empregada para registrar comportamentos do INMC durante a regeneração. Em 50 ensaios, 15 lacunas (30%) foram fechados por regeneração dentro de um período de 24h. Na maioria dos casos, os INMCs que foram capazes de se recuperar o fizeram nas primeiras horas de imagem. A recuperação foi definida como o ponto de tempo em que as projeções das células vizinhas entraram em contato, o que ocorreu 16h após ablação para uma lacuna de aproximadamente 40 μm(Filme 1). As pilhas Z foram cuidadosamente examinadas para garantir que o contato celular ocorreu dentro de um único plano Z, evitando possíveis artefatos devido às projeções z. A análise de regressão logística revelou que a probabilidade de fechamento de lacunas correlacionava-se com o tamanho da lacuna (p = 0,0453), com lacunas menores sendo mais propensas a cicatrizar. Uma diferença de 55,5 μm rendeu uma probabilidade de fechamento de 50%(Figura 5).

Em 70% dos casos, os INMCs não conseguiram fechar completamente a lacuna criada pela ablação. No entanto, mesmo nesses casos conseguimos monitorar a formação de longas projeções de INMCs vizinhos, que se assemelham em alguns aspectos a estender cones de crescimento neuronal(Filme 2). Assim, esses experimentos também podem fornecer insights sobre os comportamentos dos INMCs após danos.

Figura 1: Ablação seletiva de células interneuromast por irradiação a laser. (A) Células interneuromast entre neuromasstos primIL3 e primIL4 foram selecionadas para ablação. Essas células exibem uma forma de fuso característico com projeções alongadas sobrepondo corpos celulares adjacentes. (B) Imagens pré-ablação identificaram corpos celulares que poderiam ser ablados para produzir uma lacuna. (C) A imagem pós-ablação confirma a ablação bem sucedida, conforme indicado pela ausência de corpos celulares na região da lacuna. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A imagem pós-ablação demonstra morte celular em resposta à exposição a laser em células interneuromast rotuladas por GFP. A imagem fotomultiplier de luz transmitida (T-PMT) indica a presença de uma célula necrosada com aparência granular (cercada), bem como o recrutamento de células de forma irregular que são provavelmente macrófagos (*). A fusão dos canais GFP e T-PMT confirma que a morte celular e a atividade macrófago ocorreram no local da ablação. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Especificidade da ablação interneuromast. (A) Células interneuromast rotuladas por GFP (verde) e tdTomato (vermelho) em um Tg(ET20) duplo transgênico; Larva neuroD:tdTomato. Corpos celulares próximos ao nervo da linha lateral foram alvo de ablação. (B) A imagem pós-ablação demonstra ablação de corpos celulares alvos com um nervo de linha lateral intacto. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ablação de células ciliares sensoriais usando microscopia confocal. (A) A imagem pré-ablação identificou uma célula ciliada sensorial (*) rotulada por GFP para ablação em tg (ET20; myo6b:βactin-GFP). A imagem do tubo fotomultiplier de luz transmitida (T-PMT) revela a morfologia normal das células ciliadas, com uma seção transversal redonda. (B) A imagem pós-ablação confirma a ablação bem sucedida da célula ciliada alvo. Uma imagem T-PMT indica irregularidade na forma da célula ciliada e aumento da granularidade após a exposição ao laser, sugerindo morte celular em vez de fotobleaching. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A regressão logística modela a probabilidade de fechamento de lacunas em função da largura de lacuna (em μm). Uma pontuação de 0 representa o fechamento completo da lacuna, enquanto uma pontuação de 1 representa o fechamento incompleto da lacuna. Os resultados indicam que o efeito da largura de gap sobre a capacidade das células interneuromast de fechar as respectivas lacunas é estatisticamente significativo (p = 0,0453, n = 24 total; n = 12 lacunas fechadas, n = 12 lacunas incompletamente fechadas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1: Microscopia de lapso de tempo demonstrando fechamento de lacunas (~40 μm) após 16 h. As imagens foram capturadas a cada 15 minutos, e uma projeção z de intensidade máxima foi feita para todos os pontos de tempo. Clique aqui para baixar este vídeo.

Filme 2: Microscopia de lapso de tempo de uma lacuna INMC que não fechou. As projeções alongadas e ramificadas dos INMCs restantes são mostradas. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussion

O protocolo descreve um método versátil para ablação de células laser que pode ser realizado em qualquer microscópio confocal equipado com um laser quase ultravioleta (comprimento de onda de 405 nm). Este protocolo aborda limitações de métodos previamente empregados, como eletroablação (que causa danos mais generalizados¹¹) e ablação uv-laser pulsada (que requer equipamento especializado adicional¹²). Imagens confocal pré e pós-ablação fornecem feedback rápido sobre o sucesso do experimento. A microscopia de lapso de tempo subsequente oferece um ensaio simples para regeneração em um tipo de célula crítico para o desenvolvimento do sistema sensorial.

É de vital importância pré-tela para zebrafish transgênicos que expressam fortemente gfp em neuromasts e INMCs. Larvas com fluorescência brilhante e aproximadamente espaçamento dos neuromass derivados primI são candidatos ideais para ablação a laser. Mesmo nestes peixes, ocasionalmente há INMCs mais dimmer que podem, a princípio, escapar da detecção. Essas células podem ficar para trás após a ablação a laser, impedindo a formação de uma verdadeira lacuna entre os INMCs. O ganho digital deve ser ajustado para revelar essas células dimmer durante a imagem pré-ablação de tal forma que elas também podem ser direcionadas com o laser de 405 nm (passo 8.2).

Da mesma forma, o alvo a laser às vezes não destruirá totalmente uma célula; em vez disso, vai branquear a fluorescência, resultando em uma falha em criar uma lacuna real. Essas células geralmente aumentarão a fluorescência durante a microscopia timelapse. Ajuste de ganho na etapa de imagem pós-ablação, juntamente com a imagem T-PMT(Figura 2) ajudam a garantir que todas as células visadas tenham sido efetivamente removidas. Ele frequentemente requer duas ou três ablações de células individuais para produzir uma lacuna na sequência INMC. A morte celular pode ser detectada por blebbing ou uma aparência granular nas células alvo; embora, isso pode exigir um breve período de espera após o alvo do laser (e, em alguns casos, figuras aparentes apoptóticas ou necrosas são observadas pouco tempo depois).

Uma limitação deste procedimento é que ele pode exigir vários ensaios experimentais antes que as condições de laser sejam otimizadas e a regeneração do INMC seja bem sucedida. A potência do laser e o tempo total de consumo do laser podem exigir um pequeno ajuste para diferentes amostras. Verificou-se que a aplicação excessiva de laser pode prejudicar a capacidade da linha lateral de se reparar. Isso inclui tanto a superexposição de células individuais à irradiação a laser, presumivelmente causando danos adicionais aos tecidos circundantes, bem como 2) a ablação de muitas células na corda, levando a uma lacuna maior. Os usuários devem alcançar um equilíbrio entre células suficientemente irradiadas para garantir sua destruição e não expor demais as células, o que pode retardar ou impedir a regeneração. Com as configurações apropriadas, verificou-se que os INMCs podem ser removidos sem danos visíveis ao nervo da linha lateral posterior, indicando que os danos colaterais são minimizados com este protocolo ao contrário da eletroablação¹¹. Em nenhum caso foram observados novos neuromass na lacuna observada, presumivelmente porque o nervo da linha lateral permanece intacto e as células gliais subjacentes permanecem e inibem a proliferação dos INMCs^6,7,8,11.

Demonstra-se que esse método de ablação a laser confocal pode ser aplicado a outros tipos de células também, particularmente naqueles superficialmente localizados dentro do animal, incluindo células ciliadas sensoriais(Figura 4). Um protocolo semelhante pode ser usado para ablatar células da pele para examinar reparação de feridas ou neurônios para estudos de regeneração axonal, como descrito anteriormente¹³. Espera-se que essa técnica se torne uma adição útil ao repertório experimental de laboratórios que possuem um microscópio confocal, mas nenhum outro equipamento especializado para ablação a laser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well PTFE Printed Slides	Electron Microscopy Sciences	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricaine in reverse osmosis water
1X E3 + 600 µM Tricaine			Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media
1X E3 media			Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L)
60 X E3 media	All components purchased from Sigma-Aldrich		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water
Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence	Olympus
LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers	Carl Zeiss Microscopy, LLC		A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40
FIJI/ImageJ Image processing software	Multiple contributors		Downloadable at https://fiji.sc/
Dissecting needle modified into hair knife	Fisher Scientific	19010	An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle
Microsoft Excel software	Microsoft Corp.		Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel
Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm petri dish, 20 mm glass window
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Low Gelling Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Downloadable at https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereo microscope	Motic
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC