Summary
Laserablasjon er en allment anvendelig teknologi for å studere regenerering i biologiske systemer. Den presenterte protokollen beskriver bruk av et standard laserskanning konfokal mikroskop for laserablasjon og påfølgende tidsforløp av avbildning av regenererende interneuromastceller i sebrafisk lateral linje.
Abstract
Hårceller er mekanofsensoriske celler som megle følelsen av hørsel. Disse cellene regenererer ikke etter skade hos mennesker, men de etterfylles naturlig i ikke-pattedyrvirveldyr som sebrafisk. Sebrafisk lateral linje systemet er en nyttig modell for karakterisere sensorisk hår celle regenerering. Den laterale linjen består av hårcelleholdige organer som kalles nevromamater, som er knyttet sammen av en rekke interneuromastceller (INMCer). INMCer fungerer som stamceller som gir opphav til nye nevromamaer under utviklingen. INMCer kan reparere hull i sidelinjesystemet som er opprettet av celledød. En metode er beskrevet her for selektiv INMC-ablasjon ved hjelp av et konvensjonelt laserskanningkonokalt mikroskop og transgen fisk som uttrykker grønt fluorescerende protein i INMC- er. Time-lapse mikroskopi brukes deretter til å overvåke INMC regenerering og bestemme frekvensen av gap nedleggelse. Dette representerer en tilgjengelig protokoll for celleablasjon som ikke krever spesialisert utstyr, for eksempel en kraftig pulserende ultrafiolett laser. Ablasjonsprotokollen kan tjene bredere interesser, da det kan være nyttig for ablasjon av flere celletyper, ved hjelp av et verktøysett som allerede er tilgjengelig for mange brukere. Denne teknikken vil videre muliggjøre karakterisering av INMC regenerering under forskjellige forhold og fra ulike genetiske bakgrunner, som vil fremme forståelsen av sensorisk stamcelleregenerering.
Introduction
Kjernen i det mest progressive hørselstapet ligger ødeleggelsen av sensoriske hårceller, som transduserer ekstriniske auditive stimuli til nerveimpulser som kan oppdages av hjernen. Cochlear hårcelledød forårsaker permanent hørselstap, da voksne pattedyr mangler evnen til å regenerere disse cellene etter skade. Omvendt kan ikke-pattedyrvirveldyr som sebrafisk regenerere hårceller tapt til akustisk traumer eller ototoksisk fornærmelse. Sebrafiskmekanosensorisk lateral linje er et enkelt og lett manipulert organsystem som kan brukes til å studere hårcelleregenerering1,2,3.
Sidelinjen består av små sensoriske flekker kalt nevromatter, som er forbundet under utvikling av en rekke langstrakte celler kjent som interneuromastceller (INMCer). Gitt deres proliferative kapasitet som tilsynelatende stamceller som gir opphav til nye hårcelleholdige organer, er oppførselen til INMCer av stor interesse for samfunnet4,5. Mye av forskningen knyttet til INMCs har preget undertrykkelse av deres spredning av nærliggende Schwann-celler som vikler seg rundt sidelinjenerven, sannsynligvis gjennom en hemmer av Wnt / β-catenin signalering. 6,7,8. Mens reguleringen av INMC-spredning og differensiering til nye nevromamasjoner har blitt godt beskrevet, er mekanismene som styrer INMC gjenvekst etter ablasjon ikke blitt belyst. Denne protokollen fungerer som et middel til å ablating individuelle INMCer og analysere deres påfølgende regenererende atferd.
En rekke metoder for å ødelegge hårceller, støtteceller og hele nevromamaer har blitt publisert, sammen med metoder for overvåking av utvinning. Kjemisk ablasjon fungerer bra for hårceller, men doser av giftige kjemikalier som CuSO4 må økes betydelig for å fjerne andre laterale linjecelletyper9. Mens elektroablasjon under fluorescensmikroskopi er et effektivt og enkelt middel for å ødelegge INMCer for å studere regenerering, er det vanskelig å målrette smalt og derfor sannsynligvis produsere betydeligsikkerhetsskade. Som et resultat kan dette maskere aspekter av INMC-spesifikk atferd10,11. Laser ablasjon protokoller har blitt ansatt, men de krever bruk av spesialisert utstyr ikke nødvendigvis til stede i den gjennomsnittlige laboratoriet eller bildebehandling anlegget (det vil si høy-drevet pulserende UV lasere12). Metoden som er beskrevet her kan utføres med noen laser-skanning confocal mikroskop utstyrt med felles 405 nm laser, vanligvis brukes for avbildning DAPI og andre blå fluoroforer. En fordel med denne metoden er at konfokal avbildning kan utføres umiddelbart før og etter celleskade uten å engasjere noen ekstra laserkontrollsystemer eller overføre til et annet mikroskop utstyrt med en pulserende laser.
En lignende metode har blitt beskrevet for ablerende nevroner i sebrafisk ryggmargen13. Den forrige metoden krever imidlertid en FRAP-modul for celleablasjon, som ikke er et krav for denne protokollen. Videre, gitt de distinkte egenskapene til forskjellige celletyper (det vil si lysstyrken på transgenfluorescens, dybde i kroppen og celleform), er det sannsynlig at det vil være nødvendig med betydelige endringer avhengig av celletypen som brukes. Protokollen som er beskrevet her, er mer sannsynlig å være effektiv for mer overfladiske celler, som støttes av en demonstrasjon av sensorisk hårcelleablasjon ved hjelp av samme metode. Også skissert er en regenereringsanalyse for å vurdere INMC utvinning priser etter ablasjon, som ikke var et trekk ved den nevnte studien.
Den laserbaserte celleablasjonsprotokollen som er beskrevet her, fanger opp den regenerative kapasiteten til INMCer gjennom optimalisering av laserforhold, pre- og post-ablasjonsavbildning og time-lapse mikroskopi. Disse elementene kommer sammen for å fullstendig skildre INMC gjenvekst og gap nedleggelse i sin helhet. Selv om denne protokollen brukes her til å ødelegge INMCer, kan den brukes på annet arbeid som krever pålitelig og effektiv vurdering av cellulær ablasjon. Det er også en tilgjengelig teknologi, siden det kan utføres på ethvert konfokalt mikroskop utstyrt med en 405 nm laser.
Protocol
Alt dyrearbeid ble godkjent av Pace University Institutional Animal Care and Use Committee under protokoll 2018-1.
1. Fremstilling av sebrafisk larver
- Sett opp parring 3-5 dager før du gjennomfører eksperimentet, slik at larver vil være 2 dager etter befruktning (dpf) til 4 dpf i alder når montert for laserablasjon.
MERK: Et(krt4:EGFP)sqEt20 (forkortet som ET20) forsterkerfellelinje, der interneuromastceller er tydelig merket med forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), gir relativt enkel celleidentifikasjon og ablasjon11,14. For bekreftelse av laserablasjonspesifisitet og fleksibilitet, avles ET20 fisk med Tg (neuroD:tdTomato) fisk, der sidelinjenerven er merket med rødt fluorescerende protein eller med Tg (myo6b: βactin-GFP) for å merke sensoriske hårceller med GFP15,16. - Etter embryosamling neste dag inkuber embryoer ved 28,5 °C i E3-medium som inneholder 0,0001 % metylenblå til de er klare til bedøvelse og montering.
2. Tilberedning av lave gelling agarose og trikain løsninger
- Til en 250 ml glass Erlenmeyer kolbe, tilsett 48 ml 1x E3 medium, 2 ml 15 mM trikain lagerløsning, og 0,5 g lavsmeltende agarose.
- Mikrobølgeovn oppløsningen på høy for 30 s og virvel (iført varmebeskyttende hansker) for å oppløse agarose. Gjenta de 30 s varmesyklusene til agarose er fullstendig oppløst.
- Oppbevar agarose i en inkubator oppvarmet til 42 °C til den er klar til bruk.
3. Bedøvelse av sebrafisk larver
- Til et konisk rør på 50 ml legger du til 24 ml 1x E3 medium og 1 ml trikainlagerløsning (15 mM) til en endelig konsentrasjon på 600 μM. Virvler for å blande.
- Legg i en av de seks brønnene i en flatbunnet cellekulturplate med 8 ml E3 som inneholder 600 μM trikain.
- Bruk en overføringpipette til å flytte sebrafisk larver inn i en 74 μm mesh-bunnet overføringsinnsats.
- Overfør den nettingbunnede innsatsen til brønnen på seksbrønnsplaten som inneholder E3 + trikainoppløsningen. La larvene forbli i brønnen i minst 3 min eller til de er fullstendig bedøvet. Test anestesi ved å trykke på innsatsen. Larver bør ikke oppsiktsvekkende og svømme som svar på kranen.
4. Fluorescerende screening av bedøvet sebrafisk larver
- Pipette en bedøvet larve per brønn på 12 godt hydrofobe belagte lysbilder for screening. Sørg for at det er minimal krumning av menisken dannet i hver brønn av lysbildet for å redusere optisk forvrengning ved screening. Dette kan gjøres ved å fjerne et lite volum E3 fra hver brønn etter å ha plassert larver.
- Under et 10x mål på et oppreist mikroskop (utstyrt med en kvikksølvbuelampe, metallhalogenlampe eller LED-lyskilde og en passende filterkube), skjerm for larver som uttrykker eGFP i nevromastene og interneuromastcellene i sidelinjesystemet.
- Velg larver med sterkere uttrykk som resulterer i lysere eGFP, som antagelig er homozygous for transgene.
MERK: I ET20-linjen uttrykkes eGFP i en ring av mantelceller rundt hver nevromast, samt den smale stripen av interneuromastceller som forbinder disse organene. Sterkere eGFP-uttrykk (lysere fluorescens) bidrar til mer effektiv ablasjon. - For å undersøke spesifisiteten av ablasjon, bruk dobbelttransgene larver med både ET20- og Tg(neuroD:tdTomato) transgener. Hvis screening for Tg(neuroD:tdTomato) bærere, bruk RFP filter kube satt til å identifisere en lys rød patch bare bakre til øret som representerer bakre lateral linje ganglion.
- For å ablate hårceller i lateral linje nevromasser, bruk Tg (myo6b: βactin-GFP) transgen linje og skjerm for GFP lokalisering i midten av hver neuromast.
- Velg larver med sterkere uttrykk som resulterer i lysere eGFP, som antagelig er homozygous for transgene.
- Velg larver med stereotypisk avstand av nevromastene. Forskjeller i avstanden mellom nevromamater kan indikere unormal nevromast deponering under utvikling, noe som tyder på defekt trekkatferd eller cellespredning i sidelinjen primordium17. Slike defekter kan også påvirke migrerende eller regenerativ atferd av INMCs etter ablasjon.
MERK: Vanlige defekter i avstand inkluderer en uvanlig stor avstand mellom den fremre mest neuromast deponert av den første migrerende primordium (prim1L1) og den andre nevromast avset av samme primordium (prim1L2), ofte forbundet med trengsel av de mer bakre nevromassene.
5. Montering av larver for laserablasjon og bildebehandling
- Pipette 3 - 4 bedøvet larver i en liten dråpe E3 /trikainløsning i midten av en deksel slip-bottomed parabolen (35 mm tallerken med en 14 mm nummer 1,5 coverslip). Fjern overflødig løsning slik at larvene forblir i en liten dråpe, akkurat stor nok til å inneholde dem.
- Overfør parabolen til scenen av et kikkert stereomikroskop og manipulere zoom og fokus slik at alle larver er i synsfeltet.
- Fjern Erlenmeyerkolben som inneholder det lave smeltepunktet oppsto fra den oppvarmede inkubatoren. Bruk en overføringspipette til å overføre agaroseløsning på dekselets lysbilde for å produsere et tynt lag. Trekk av overflødig agarose til væsken bare fyller brønnen nederst på parabolen, og ta vare på å ikke aspirere noen larver.
- Ordne raskt larver i agaroseløsningen ved hjelp av en hårkniv eller hårløkke slik at de er på linje med hverandre og orientert med rostral til venstre.
- Trykk forsiktig larvene ned mot glasset med hårkniven, slik at de ligger i profil med sine høyre sider ned. Larver eldre enn 3 dpf har en tendens til å flyte på grunn av deres oppblåste svømmeblærer, så de må kanskje gjentatte ganger trykkes ned mot glasset til agarose begynner å gele.
- Etter ca 60 s vil agarose begynne å stivne, og larvene vil ikke kunne reorientert. La ca. 5 minutter ved romtemperatur for at agarose på dekselet sklir helt for å stivne. Når agarose har størknet, bruk en overføring pipette for å fylle parabolen halvveis med E3 som inneholder 1x trikain.
6. Finne potensielle mål og forhåndsavbildning
- Slå på strømmen til det konfokale mikroskopisystemet for laserskanning og initialiser gjennom den integrerte bildeprogramvaren. Velg 63x Plan-Apochromat olje nedsenking mål (numerisk blenderåpning 1,40) eller lignende. Påfør nedsenking olje og fest parabolen i et sirkulært stadium innsats slik at larvene ansikt med deres rostral aspekt til venstre.
- Under lysfelt eller differensial interferenskontrastbelysning velger du en av de monterte larver for avbildning. Juster fokuset med fokusknappen slik at huden på siden av fisken nærmest dekkslippen er i fokus, gjenkjennelig av det fingeravtrykkslignende mønsteret av peridermceller.
- Når du er i fokus, bytt til epifluorescerende belysning i GFP-kanalen. Finn den bakre sidelinjen ved GFP-uttrykk langs det horisontale myoseptumet. Ringer av fluorescerende celler indikerer nevromast mantelceller, og langstrakte tråder av celler er interneuromastceller.
- Fra og med primIL1 neuromast, vanligvis plassert bare dorsal til eggeplommen, bruk scenen kontroll joystick eller annen scenebevegelseskontroll for å visuelt skanne caudally langs det horisontale myoseptumet.
- Følg strengen av interneuromastceller til du når regionen mellom primIL3 og primIL4 (L3 og L4) nevromamater (figur 1A).
MERK: Andre regioner kan også målrettes, men denne delen av stammen og halen har en tendens til å være nærmest dekkglasset, og derfor mest mottagelig for ablasjon. - Hvis du avbilder flere larver, angir du den første trinnsposisjonen, og deretter inaktiverer du alternativet for flere trinns posisjoner ved å fjerne merket for den aktuelle avmerkingsboksen.
- Gjenta trinn 6.4.1–6.4.2. for hver ønskede trinnposisjon (hver larve).
- Følg strengen av interneuromastceller til du når regionen mellom primIL3 og primIL4 (L3 og L4) nevromamater (figur 1A).
- Når cellelegemer i L3–L4-regionen er identifisert, bytter du til anskaffelsesmodus.
- Aktiver et GFP-bildespor ved hjelp av 488 nm- eller 491 nm-laseren.
- Legg til et overført lys (overført lys photomultiplier tube eller T-PMT) kanal til aktivert 488 nm laserspor ved å aktivere T-PMT avkrysningsruten under rullegardinmenyen "Imaging Setup".
- Sett laserkraften til 6 %, pinhole-størrelse til 1 Airy-enhetekvivalent, og digital gevinst til 750 for bildebehandling AV ET20 larver. Nøyaktig forsterkning og laserkraft kan variere for en gitt larve, avhengig av hvor nær dekselet slip de er montert og lysstyrken på fluorescens. Juster gevinsten slik at cellelegemer er mettet for å fange ellers dim projeksjoner og filipodia.
- Juster parametrene til en rammestørrelse på 1024 piksler x 1024 piksler, digital zoom på 0,7 (145,2 μm x 145,2 μm bildestørrelse). Sett snitt til 2 for å forbedre bildekvaliteten.
- Merk av i z-stakkboksen for å få opp rullegardinmenyen for z-posisjon. Mens rask skanning, fokuser ut til de interneuromastcellene er bare ute av fokus. Sett den første skiven, og fokuser deretter gjennom prøven til de interneuromastcellene igjen er ute av fokus. Angi den siste biten. Sørg for at den omfatter en z-stabel på ca. 25 μm. Sett bildeintervallet til 1 μm.
- Start eksperimentet for å fange en forhåndsblasjon z-stack (Figur 1B). Hvis trinnposisjoner er lagt til, deaktiverer du posisjoner-alternativet slik at bare gjeldende posisjon blir avbildet. Lagre filen når den er tatt.
7. Laserablasjon av cellelegemer
- Klikk på "Vis alle verktøy". Dette alternativet er plassert øverst i oppkjøpsgrensesnittet.
- Klikk på rullegardinmenyen for "Imaging Set Up". I "Imaging Set up", klikk på " Legg til et nyttspor" (representert som "+").
- I "Imaging Set Up", klikk på rullegardinmenyen for "Fargestoff". Velg DAPI som fargestoff.
- Klikk på rullegardinmenyen for"Kanaler"og fjern merket for alle andre spor ved å fjerne de respektive avmerkingsboksene. Kontroller at bare DAPI-sporet er valgt.
- I DAPI-sporet klikker du på 405 for "Laserinnstillingen". Øk laserkraften til 75%. Løsne DAPI-kanalen for å slå av laseren mens du søker etter kandidatcellelegemer for ablasjon.
- Med brødteksten i en internuromastcelle sentrert i synsfeltet zoomer du inn skannerammen til 20x–22x. Rammeposisjonen må kanskje justeres for å holde cellelegemet i midten når zoomen påføres. Stopp live skanning så snart cellekroppen fyller synsfeltet.
MERK: Cellelegemet skal oppta hele synsfeltet. På dette zoomnivået vil GFP bleke raskt. Minimer lasereksponeringstiden ved å arbeide raskt. Bruk zoom i stedet for å velge en interesseregion for å øke laserstrømfordelingen over et lite område. - Kontroller 405 nm laserlukkerboksen for å aktivere sporet. Juster lasereffekten til 75 %. Still inn en tidtaker for 45 s. Aktiver kontinuerlig skanning og start tidtakeren. Slutt å skanne umiddelbart ved 45 s.
8. Post-ablasjonsavbildning og time-lapse mikroskopi for å studere regenerering
- Klikk på rullegardinmenyen for "Kanaler". I kanaler, løsne "DAPI" spor for å inaktivere ablasjon laser. Klikk på rullegardinmenyen for "Oppkjøpsmodus".
- I oppkjøpsmodus klikker du på "Zoom".
- Reduser zoomen til 0,7 enten ved hjelp av glidebryteren eller ved å skrive inn "0,7."
- For å sikre vellykket celleablasjon, øk gevinsten til 900 og skann raskt synsfeltet.
MERK: Ingen GFP skal være synlig i den målrettede cellen eller cellene. Hvis fluorescens fortsatt observeres, går du tilbake til trinn 7.1–7.3. - Ved hjelp av de samme eller lignende innstillingene som de som er beskrevet for forhåndsavbildning, ta opp og lagre et post-ablasjonsbilde (figur 1C). Hvis bildet avslører rester av fluorescerende celler eller flere cellelegemer som må fjernes, gjentar du laserablasjonstrinnene for å skape et synlig gap i strengen av interneuromastceller.
- Inspiser T-PMT-kanalbildet for å bekrefte mobilskade ytterligere. Skadede celler vil ha et detaljert utseende, og ofte vil kjernene hovne opp eller bli uregelmessige i form (figur 2).
- For å sikre vellykket celleablasjon, øk gevinsten til 900 og skann raskt synsfeltet.
- Etter å ha tatt et forhåndsblasjonsbilde, ablating cellene etter behov, og fange et post-ablasjonsbilde for hver enkelt faseposisjon, sett opp time-lapse mikroskopi ved å aktivere både sceneposisjon og tidsalternativer for bildeopptak. Sett tidsparametrene til 24 timer eller et annet ønsket endepunkt og 15 min intervaller. Start eksperimentet for å hente bilder og lagre den resulterende filen når den er fullført (neste dag).
- Hvis larver skal studeres eller heves videre, fjern dem forsiktig fra agarose ved hjelp av fine tang, og overfør deretter til E3-medium uten trikain for gjenoppretting. Hvis de ikke skal brukes videre, euthanize i henhold til godkjent dyr protokollen (rask og vedvarende nedsenking i et isbad er en vanlig metode) og avhende dem som kreves av institusjonen.
9. Bildeanalyse
- Åpne en post-ablation z-stack fil i den foretrukne bildebehandling programvare (Table of Materials). Del kanalene slik at hver kanal er i en egen visningsrute.
- I kanalvinduet for GFP bruker du linjeverktøyet til å tegne en rett linje mellom tuppene til de gjenværende INMCene. Dette kan hjelpes ved å rulle opp og ned gjennom z-stakken eller ved å utføre en maksimal intensitetprojeksjon før du tegner linjen.
- Bruk verktøyet "Measure" for å få avstanden mellom INMC-endene i x- og y-planene.
- Bla gjennom z-stykkene i den opprinnelige z-stakken for å bestemme avstanden mellom INMCer i z-planet.
- Beregn den totale avstanden mellom INMC-endene ved hjelp av pythagoras teoremet (a2 + b2 = c2). Hypotenus er den totale avstanden (eller gapstørrelsen).
- Angi den resulterende avstandsmålingen i et regnearkprogram for dataanalyse.
- Se gjennom tidsforløpsmikroskopifilene som er samlet inn i trinn 8.2–8.3 ved hjelp av enten den integrerte bildeprogramvaren på konfokalsystemet eller fritt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare. Identifiser tidspunktet der gapet mellom interneuromastceller ble fylt ut av celleprojeksjoner. Dette kan hjelpes ved undersøkelse av flere z-skiver for å bekrefte nedleggelse av gapet i alle dimensjoner.
- For å oppnå den mest nøyaktige målingen av tid til å lukke gapet, bruk tidsstempelet etter ablasjon (synlig i Finder eller Filutforsker) som nulltidspunkt. måletiden fra begynnelsen av bildestakken for tidsforløp kan føre til å undervurdere tiden til nedleggelse, avhengig av hvor mye tid som er gått mens du ablating ekstra trinn posisjoner, etc.
- Utlede frekvensen av nedleggelse ved ganske enkelt å dele den opprinnelige gapstørrelsen (μm) med timer eller minutter som kreves for fullstendig gaplukking.
Representative Results
For å ablate INMCs og registrere regenerering, ble screenet GFP-uttrykkende sebrafisk larver av ET20 transgen linje montert ved 2- eller 3-dagers etterbefruktning for ablasjon som beskrevet i trinn 5.4. Flere fisk kan monteres samtidig slik at flere tidsforløp kan fanges i et enkelt eksperiment. Regionen av sidelinjen som ligger mellom primIL3 og primIL4 nevromasser ble identifisert, og pre-ablasjon bilder ble tatt som beskrevet i trinn 6.5-6.7 (Figur 1A, B).
Tre cellelegemer var rettet mot laserablasjon for å skape et gap i INMC-strengen på ca. 40 μm. Etter ablasjonsskanning med høy forsterkning og påfølgende bildebehandling bekreftet at ingen cellelegemer forble i det ablerte området, og etterlot et gap mellom langstrakte projeksjoner av de tilstøtende INMC -ene (figur 1C). Celledød ble ytterligere demonstrert ved å undersøke T-PMT-kanalen etter ablasjon. Skadede og døende celler var preget av hovne og uregelmessig formede kjerner samt et detaljert utseende (figur 2, skissert). I noen tilfeller avslørte time-lapse imaging også rekruttering av store amoeboidceller som sannsynligvis var makrofager (figur 2, stjerne). Mørke områder rundt de ablerte INMCene indikerte fotobleaching i overliggende peridermceller. Disse cellene syntes ikke å være skadet eller ødelagt av laser bestråling i disse eksperimentene; Snarere ble deres fluorescens midlertidig redusert. Time-lapse mikroskopi avslører at disse cellene normalt gjenopprette etter ablasjon og ikke endre form eller på annen måte vises skadet (upubliserte resultater, Volpe et al.).
For å støtte spesifisiteten av INMC-ødeleggelse, ble ablasjoner utført i dobbelttransgene ET20- og Tg(neuroD:tdTomato) larver der sidelinjenerven (som bare går mikron under de interneuromastcellene) er merket med rødt fluorescerende protein. Ablasjoner av flere celler som skapte store hull i INMC-strengen hadde liten eller ingen effekt på sidelinjenerven basert på rød fluorescens (figur 3). Fleksibiliteten til teknikken for ablerende overfladisk lokaliserte celler ble demonstrert ved selektiv ødeleggelse av individuelle sensoriske hårceller i nevromamater av sidelinjen. Ved hjelp av i hovedsak den samme protokollen beskrevet ovenfor (avsnitt 7 og 8), ble enkelthårceller i transgene Tg (myo6b: βactin-GFP) larver ødelagt uten tilsynelatende skade på tilstøtende celler (figur 4). De ablerte hårcellene gjenopprettet ikke fluorescens etter time-lapse mikroskopi, og deres kjerner var merkbart granulære og misformet etter lasereksponering (figur 4B). I likhet med INMC-ablasjoner ble tilsynelatende makrofager ofte rekruttert til lasereksponeringsstedet (upubliserte resultater, Volpe et al.).
Etter laserablasjon og post-ablasjon bildeopptak, gap størrelse ble målt ved hjelp av fritt tilgjengelig bildeanalyse programvare. Måleverktøyet demonstrerte gapstørrelser fra bare noen få mikrometer opptil 100 mikron, avhengig av bredden på individuelle INMCer og hvor mange celler som ble valgt for ablasjon (figur 5). Timelapsmikroskopi ble brukt til å registrere INMC-atferd under regenerering. I 50 studier var 15 hull (30 %) ble stengt ved regenerering innen en 24-timersperiode. I de fleste tilfeller gjorde INMCer som var i stand til å gjenopprette det i løpet av de første timene etter bildebehandling. Gjenoppretting ble definert som tidspunktet da projeksjoner fra nærliggende celler kom i kontakt, som skjedde 16 timer etter ablasjon for et gap på ca. 40 μm (Film 1). Z-stabler ble nøye undersøkt for å sikre at cellecellekontakt oppstod i et enkelt z-plan, og unngikk mulige artefakter på grunn av z-projeksjoner. Logistisk regresjonsanalyse viste at sannsynligheten for gaplukking korrelerte med gapstørrelse (p = 0,0453), med mindre hull som er mer sannsynlig å helbrede. Et gap på 55,5 μm ga en lukkingssannsynlighet på 50 % (figur 5).
I 70 % av tilfellene kunne ikke INMCer helt lukke gapet som ble skapt av ablasjon. Men selv i disse tilfellene var vi i stand til å overvåke dannelsen av lange projeksjoner fra nærliggende INMCer, som ligner på noen måter som utvider nevronalevekstkjegler( Film 2 ). Dermed kan disse eksperimentene også gi innsikt i atferden til INMCer etter skade.
Figur 1: Selektiv ablasjon av interneuromastceller ved laser bestråling. (A) Interneuromastceller mellom nevromasser primIL3 og primIL4 ble valgt for ablasjon. Disse cellene viser en karakteristisk spindelform med langstrakte projeksjoner overlappende tilstøtende cellelegemer. (B)Pre-ablasjon imaging identifisertcellelegemer som kan være ablated å produsere et gap. (C) Etter ablasjonsavbildning bekrefter vellykket ablasjon som indikert av fravær av cellelegemer i gapområdet. Skala barer = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Etter ablasjonsavbildning demonstrerer celledød som svar på lasereksponering i GFP-merkede interneuromastceller. Overført lys photomultiplier imaging (T-PMT) indikerer tilstedeværelsen av en nekrotisk celle med et detaljert utseende (omkranset) samt rekruttering av uregelmessig formede celler som sannsynligvis er makrofager (*). Sammenslåing av GFP- og T-PMT-kanaler bekrefter at celledød og makrofagaktivitet oppstod på ablasjonsstedet. Skala barer = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Spesifisitet av internuromast ablasjon. (A)Pre-ablasjon GFP-merkede interneuromastceller (grønn) og tdTomato-merket lateral linje nerve (rød) i en dobbelttransgen Tg (ET20; NeuroD:tdTomato) larve. Cellelegemer i nærheten av sidelinjenerven var rettet mot ablasjon. (B)Post-ablasjonsavbildning viser ablasjon av målrettede cellelegemer med en intakt sidelinjenerve. Vektstenger = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ablasjon av sensoriske hårceller ved hjelp av konfokal mikroskopi. (A) Pre-ablasjon avbildning identifisert en GFP merket sensorisk hårcelle (*) rettet mot ablasjon i dobbelttransgen tg (ET20; myo6b:βactin-GFP) sebrafisk. Overført lys photomultiplier tube (T-PMT) avbildning avslører normal hårcellemorfologi, med et rundt tverrsnitt. (B)Etter ablasjonsavbildning bekrefter vellykket ablasjon av den målrettede hårcellen. Et T-PMT-bilde indikerer uregelmessighet i hårcelleform og økt detaljnivå etter lasereksponering, noe som tyder på celledød i stedet for fotobleaching. Vektstenger = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Logistiske regresjonsmodeller sannsynligheten for gaplukking som en funksjon av gapbredde (i μm). En poengsum på 0 representerer fullstendig gaplukking, mens en poengsum på 1 representerer ufullstendig gaplukking. Resultatene indikerer at effekten av gapbredde på evnen til interneuromastceller til å lukke respektive hull er statistisk signifikant (p = 0,0453, n = 24 totalt; n = 12 lukkede hull, n = 12 ufullstendig lukkede hull). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Time-lapse mikroskopi som viser gaplukking (~ 40 μm) etter 16 timer. Bilder ble tatt hver 15 min, og en maksimal intensitet z-projeksjon ble laget for alle timepoints. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Film 2: Time-lapse mikroskopi av en INMC gap som ikke lukkes. De langstrakte og forgreningsprojeksjonene til de gjenværende INMCene vises. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Protokollen beskriver en allsidig metode for lasercelleablasjon som kan utføres på et konfokalt mikroskop utstyrt med en nesten ultrafiolett laser (405 nm bølgelengde). Denne protokollen tar for seg begrensninger av tidligere brukte metoder som elektroablasjon (som forårsaker mer utbredt skade11) og pulserende UV-laserablasjon (som krever ekstra spesialisert utstyr12). Pre- og post-ablasjon confocal imaging gir rask tilbakemelding om suksess av eksperimentet. Påfølgende time-lapse mikroskopi tilbyr en enkel analyse for regenerering i en celletype kritisk for sensorisk systemutvikling.
Det er av avgjørende betydning å forhåndsscreene for transgen sebrafisk som uttrykker GFP sterkt i nevromammer og INMCer. Larver med lys fluorescens og omtrent jevn avstand av primI-avledede nevromasser er ideelle kandidater for laserablasjon. Selv i disse fiskene er det av og til dimmer INMCer som ved første rømningsdeteksjon. Disse cellene kan forbli bak etter laserablasjon, og forhindrer dannelsen av et ekte gap mellom INMCer. Den digitale gevinsten bør justeres for å avsløre disse dimmercellene under pre-ablasjonsavbildning slik at de også kan målrettes med 405 nm laser (trinn 8.2).
På samme måte vil lasermålretting noen ganger ikke helt ødelegge en celle; Snarere vil det bleke fluorescens, noe som resulterer i en unnlatelse av å skape et reelt gap. Disse cellene vil generelt øke i fluorescens under timelapsmikroskopi. Få justering i bildetrinnet etter ablasjon sammen med T-PMT-bildebehandling (figur 2) bidrar til å sikre at alle celler som er målrettet, er fjernet effektivt. Det krever ofte to eller tre individuelle celleablasjoner for å produsere et gap i INMC-strengen. Celledød kan oppdages ved blebbing eller et detaljert utseende i de målrettede cellene; Selv om dette kan kreve en kort ventetid etter laser målretting (og i noen tilfeller observeres tilsynelatende apoptotiske eller nekrotiske tall kort tid etterpå).
En begrensning av denne prosedyren er at det kan kreve flere eksperimentelle studier før laserforholdene er optimalisert og INMC regenerering er vellykket. Laserkraften og den totale oppholdstiden til laseren kan hver kreve liten justering for ulike prøver. Det har blitt funnet at overdreven laser applikasjon kan svekke evnen til sidelinjen til å reparere seg selv. Dette inkluderer både 1) overeksponering av individuelle celler til laserbestråling, antagelig forårsaker ytterligere skade på omkringliggende vev, samt 2) ablasjon av for mange celler i strengen, fører til et større gap. Brukere må oppnå en balanse mellom tilstrekkelig bestrålende celler for å sikre ødeleggelse og ikke overeksponere cellene, noe som kan bremse eller forhindre regenerering. Med de riktige innstillingene har det blitt funnet at INMCene kan fjernes uten synlig skade på bakre lateral linjenerve, noe som indikerer at sikkerhetsskader minimeres med denne protokollen i motsetning til elektroablasjon11. I ingen tilfeller var nye nevromasser som dannes i gapet observert, antagelig fordi sidelinjenerven forblir intakt og underliggende glialceller forblir og hemmer spredningen av INMCer6,7,8,11.
Det er vist at denne metoden for konfokal laserablasjon kan brukes på andre celletyper også, spesielt hos de overfladisk plassert i dyret, inkludert sensoriske hårceller (figur 4). En lignende protokoll kan brukes til å ablate hudceller for å undersøke sårreparasjon eller nevroner for aksonale regenereringsstudier, som tidligere beskrevet13. Det forventes at denne teknikken vil bli et nyttig tillegg til det eksperimentelle repertoaret av laboratorier som har et konfokalt mikroskop, men ingen annet spesialisert utstyr for laserablasjon.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH R15 stipend 1R15DC015352-01A1 og Pace University interne finansieringskilder. Fiskelinjer var gjengitt med tillatelse fra Vladimir Korzh14, Katie Kindt15,16, og laboratoriet til A. James Hudspeth. Vi vil gjerne takke A. James Hudspeth og medlemmer av hans gruppe for tilbakemeldinger på disse eksperimentene, og kolleger ved Pace University for deres støtte. Logistisk regresjonsanalyse i RStudio ble spesielt hjulpet av vår kollega Matthew Aiello-Lammens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C.
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
