Laserablasjon er en allment anvendelig teknologi for å studere regenerering i biologiske systemer. Den presenterte protokollen beskriver bruk av et standard laserskanning konfokal mikroskop for laserablasjon og påfølgende tidsforløp av avbildning av regenererende interneuromastceller i sebrafisk lateral linje.
Hårceller er mekanofsensoriske celler som megle følelsen av hørsel. Disse cellene regenererer ikke etter skade hos mennesker, men de etterfylles naturlig i ikke-pattedyrvirveldyr som sebrafisk. Sebrafisk lateral linje systemet er en nyttig modell for karakterisere sensorisk hår celle regenerering. Den laterale linjen består av hårcelleholdige organer som kalles nevromamater, som er knyttet sammen av en rekke interneuromastceller (INMCer). INMCer fungerer som stamceller som gir opphav til nye nevromamaer under utviklingen. INMCer kan reparere hull i sidelinjesystemet som er opprettet av celledød. En metode er beskrevet her for selektiv INMC-ablasjon ved hjelp av et konvensjonelt laserskanningkonokalt mikroskop og transgen fisk som uttrykker grønt fluorescerende protein i INMC- er. Time-lapse mikroskopi brukes deretter til å overvåke INMC regenerering og bestemme frekvensen av gap nedleggelse. Dette representerer en tilgjengelig protokoll for celleablasjon som ikke krever spesialisert utstyr, for eksempel en kraftig pulserende ultrafiolett laser. Ablasjonsprotokollen kan tjene bredere interesser, da det kan være nyttig for ablasjon av flere celletyper, ved hjelp av et verktøysett som allerede er tilgjengelig for mange brukere. Denne teknikken vil videre muliggjøre karakterisering av INMC regenerering under forskjellige forhold og fra ulike genetiske bakgrunner, som vil fremme forståelsen av sensorisk stamcelleregenerering.
Kjernen i det mest progressive hørselstapet ligger ødeleggelsen av sensoriske hårceller, som transduserer ekstriniske auditive stimuli til nerveimpulser som kan oppdages av hjernen. Cochlear hårcelledød forårsaker permanent hørselstap, da voksne pattedyr mangler evnen til å regenerere disse cellene etter skade. Omvendt kan ikke-pattedyrvirveldyr som sebrafisk regenerere hårceller tapt til akustisk traumer eller ototoksisk fornærmelse. Sebrafiskmekanosensorisk lateral linje er et enkelt og lett manipulert organsystem som kan brukes til å studere hårcelleregenerering1,2,3.
Sidelinjen består av små sensoriske flekker kalt nevromatter, som er forbundet under utvikling av en rekke langstrakte celler kjent som interneuromastceller (INMCer). Gitt deres proliferative kapasitet som tilsynelatende stamceller som gir opphav til nye hårcelleholdige organer, er oppførselen til INMCer av stor interesse for samfunnet4,5. Mye av forskningen knyttet til INMCs har preget undertrykkelse av deres spredning av nærliggende Schwann-celler som vikler seg rundt sidelinjenerven, sannsynligvis gjennom en hemmer av Wnt / β-catenin signalering. 6,7,8. Mens reguleringen av INMC-spredning og differensiering til nye nevromamasjoner har blitt godt beskrevet, er mekanismene som styrer INMC gjenvekst etter ablasjon ikke blitt belyst. Denne protokollen fungerer som et middel til å ablating individuelle INMCer og analysere deres påfølgende regenererende atferd.
En rekke metoder for å ødelegge hårceller, støtteceller og hele nevromamaer har blitt publisert, sammen med metoder for overvåking av utvinning. Kjemisk ablasjon fungerer bra for hårceller, men doser av giftige kjemikalier som CuSO4 må økes betydelig for å fjerne andre laterale linjecelletyper9. Mens elektroablasjon under fluorescensmikroskopi er et effektivt og enkelt middel for å ødelegge INMCer for å studere regenerering, er det vanskelig å målrette smalt og derfor sannsynligvis produsere betydeligsikkerhetsskade. Som et resultat kan dette maskere aspekter av INMC-spesifikk atferd10,11. Laser ablasjon protokoller har blitt ansatt, men de krever bruk av spesialisert utstyr ikke nødvendigvis til stede i den gjennomsnittlige laboratoriet eller bildebehandling anlegget (det vil si høy-drevet pulserende UV lasere12). Metoden som er beskrevet her kan utføres med noen laser-skanning confocal mikroskop utstyrt med felles 405 nm laser, vanligvis brukes for avbildning DAPI og andre blå fluoroforer. En fordel med denne metoden er at konfokal avbildning kan utføres umiddelbart før og etter celleskade uten å engasjere noen ekstra laserkontrollsystemer eller overføre til et annet mikroskop utstyrt med en pulserende laser.
En lignende metode har blitt beskrevet for ablerende nevroner i sebrafisk ryggmargen13. Den forrige metoden krever imidlertid en FRAP-modul for celleablasjon, som ikke er et krav for denne protokollen. Videre, gitt de distinkte egenskapene til forskjellige celletyper (det vil si lysstyrken på transgenfluorescens, dybde i kroppen og celleform), er det sannsynlig at det vil være nødvendig med betydelige endringer avhengig av celletypen som brukes. Protokollen som er beskrevet her, er mer sannsynlig å være effektiv for mer overfladiske celler, som støttes av en demonstrasjon av sensorisk hårcelleablasjon ved hjelp av samme metode. Også skissert er en regenereringsanalyse for å vurdere INMC utvinning priser etter ablasjon, som ikke var et trekk ved den nevnte studien.
Den laserbaserte celleablasjonsprotokollen som er beskrevet her, fanger opp den regenerative kapasiteten til INMCer gjennom optimalisering av laserforhold, pre- og post-ablasjonsavbildning og time-lapse mikroskopi. Disse elementene kommer sammen for å fullstendig skildre INMC gjenvekst og gap nedleggelse i sin helhet. Selv om denne protokollen brukes her til å ødelegge INMCer, kan den brukes på annet arbeid som krever pålitelig og effektiv vurdering av cellulær ablasjon. Det er også en tilgjengelig teknologi, siden det kan utføres på ethvert konfokalt mikroskop utstyrt med en 405 nm laser.
Protokollen beskriver en allsidig metode for lasercelleablasjon som kan utføres på et konfokalt mikroskop utstyrt med en nesten ultrafiolett laser (405 nm bølgelengde). Denne protokollen tar for seg begrensninger av tidligere brukte metoder som elektroablasjon (som forårsaker mer utbredt skade11) og pulserende UV-laserablasjon (som krever ekstra spesialisert utstyr12). Pre- og post-ablasjon confocal imaging gir rask tilbakemelding om suksess av eksperimentet. Påfølgende time-lapse mikroskopi tilbyr en enkel analyse for regenerering i en celletype kritisk for sensorisk systemutvikling.
Det er av avgjørende betydning å forhåndsscreene for transgen sebrafisk som uttrykker GFP sterkt i nevromammer og INMCer. Larver med lys fluorescens og omtrent jevn avstand av primI-avledede nevromasser er ideelle kandidater for laserablasjon. Selv i disse fiskene er det av og til dimmer INMCer som ved første rømningsdeteksjon. Disse cellene kan forbli bak etter laserablasjon, og forhindrer dannelsen av et ekte gap mellom INMCer. Den digitale gevinsten bør justeres for å avsløre disse dimmercellene under pre-ablasjonsavbildning slik at de også kan målrettes med 405 nm laser (trinn 8.2).
På samme måte vil lasermålretting noen ganger ikke helt ødelegge en celle; Snarere vil det bleke fluorescens, noe som resulterer i en unnlatelse av å skape et reelt gap. Disse cellene vil generelt øke i fluorescens under timelapsmikroskopi. Få justering i bildetrinnet etter ablasjon sammen med T-PMT-bildebehandling (figur 2) bidrar til å sikre at alle celler som er målrettet, er fjernet effektivt. Det krever ofte to eller tre individuelle celleablasjoner for å produsere et gap i INMC-strengen. Celledød kan oppdages ved blebbing eller et detaljert utseende i de målrettede cellene; Selv om dette kan kreve en kort ventetid etter laser målretting (og i noen tilfeller observeres tilsynelatende apoptotiske eller nekrotiske tall kort tid etterpå).
En begrensning av denne prosedyren er at det kan kreve flere eksperimentelle studier før laserforholdene er optimalisert og INMC regenerering er vellykket. Laserkraften og den totale oppholdstiden til laseren kan hver kreve liten justering for ulike prøver. Det har blitt funnet at overdreven laser applikasjon kan svekke evnen til sidelinjen til å reparere seg selv. Dette inkluderer både 1) overeksponering av individuelle celler til laserbestråling, antagelig forårsaker ytterligere skade på omkringliggende vev, samt 2) ablasjon av for mange celler i strengen, fører til et større gap. Brukere må oppnå en balanse mellom tilstrekkelig bestrålende celler for å sikre ødeleggelse og ikke overeksponere cellene, noe som kan bremse eller forhindre regenerering. Med de riktige innstillingene har det blitt funnet at INMCene kan fjernes uten synlig skade på bakre lateral linjenerve, noe som indikerer at sikkerhetsskader minimeres med denne protokollen i motsetning til elektroablasjon11. I ingen tilfeller var nye nevromasser som dannes i gapet observert, antagelig fordi sidelinjenerven forblir intakt og underliggende glialceller forblir og hemmer spredningen av INMCer6,7,8,11.
Det er vist at denne metoden for konfokal laserablasjon kan brukes på andre celletyper også, spesielt hos de overfladisk plassert i dyret, inkludert sensoriske hårceller (figur 4). En lignende protokoll kan brukes til å ablate hudceller for å undersøke sårreparasjon eller nevroner for aksonale regenereringsstudier, som tidligere beskrevet13. Det forventes at denne teknikken vil bli et nyttig tillegg til det eksperimentelle repertoaret av laboratorier som har et konfokalt mikroskop, men ingen annet spesialisert utstyr for laserablasjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av NIH R15 stipend 1R15DC015352-01A1 og Pace University interne finansieringskilder. Fiskelinjer var gjengitt med tillatelse fra Vladimir Korzh14, Katie Kindt15,16, og laboratoriet til A. James Hudspeth. Vi vil gjerne takke A. James Hudspeth og medlemmer av hans gruppe for tilbakemeldinger på disse eksperimentene, og kolleger ved Pace University for deres støtte. Logistisk regresjonsanalyse i RStudio ble spesielt hjulpet av vår kollega Matthew Aiello-Lammens.
12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |