Summary
Лазерная абляция является широко применимой технологией для изучения регенерации в биологических системах. Представленный протокол описывает использование стандартного лазерного сканирования конфокального микроскопа для лазерной абляции и последующей замедленной визуализации регенерирующих межнейромастов в боковой линии зебры.
Abstract
Клетки волос являются механосензорными клетками, которые являются посредниками в чувстве слуха. Эти клетки не регенерируются после повреждения у людей, но они естественным образом пополняются у не млекопитающих позвоночных, таких как зебры. Система боковой линии зебры является полезной моделью для характеристики сенсорной регенерации волосяных клеток. Боковой линии состоит из волосковых клеток, содержащих органы, называемые нейромастами, которые связаны друг с другом строкой межнейромальных клеток (INMCs). INMCs действуют как клетки-предшественники, которые дают возможность новых нейромастов во время развития. INMCs может восстановить пробелы в боковой линии системы, созданной клеточной смерти. Метод описан здесь для селективной абляции INMC с использованием обычного лазерного сканирования конфокального микроскопа и трансгенных рыб, которые выражают зеленый флуоресцентный белок в INMCs. Затем промежуток времени микроскопия используется для мониторинга регенерации INMC и определения скорости закрытия разрыва. Это представляет собой доступный протокол для абляции клеток, который не требует специального оборудования, такого как мощный импульсный ультрафиолетовый лазер. Протокол абляции может служить более широким интересам, так как он может быть полезен для абляции дополнительных типов ячеев, используя набор инструментов, который уже доступен для многих пользователей. Этот метод также позволит характеристика регенерации INMC в различных условиях и из различных генетических фонов, которые будут способствовать пониманию сенсорного регенерации клеток прародителя.
Introduction
В основе наиболее прогрессивной потери слуха лежит разрушение сенсорных волосковых клеток, которые трансдуцируемые внешние слуховые стимулы в нервные импульсы, обнаруживаемые мозгом. Кохлеарная смерть волосковых клеток вызывает постоянную потерю слуха, так как взрослые млекопитающие не имеют возможности регенерировать эти клетки после повреждения. И наоборот, не млекопитающих позвоночных, таких как зебрафиш может регенерировать волосковые клетки потеряли из-за акустической травмы или ототоксического оскорбления. Зебрафиш механосенсорий боковой линии является простой и легко манипулировать органной системы, которые могут быть использованы для изучениярегенерации волосяных клеток 1,2,3.
Боковой линии состоит из небольших сенсорных патчей, называемых нейромастами, которые связаны во время развития строкой удлиненных клеток, известных как межнейромастовые клетки (INMCs). Учитывая их пролиферативную способность в качестве очевидных стволовых клеток, которые дают возможность новых волосковых клеток, содержащих органы, поведение INMCs представляетбольшой интерес для сообщества 4,5. Большая часть исследований, относящихся к INMCs характеризуется подавление их распространения близлежащих клеток Шванн, которые обернуть вокруг боковой линии нерва, вероятно, через ингибитор Wnt / β-катенин сигнализации. 6,7,8. Хотя регулирование распространения INMC и дифференциации на новые нейромасты было хорошо описано, механизмы, регулирующие отрастание INMC после абляции, не были выяснены. Этот протокол служит средством ablating отдельных INMCs и анализа их последующего регенеративного поведения.
Были опубликованы различные методы уничтожения волосковых клеток, поддерживающих клетки и целые нейромасты, а также методологии мониторинга восстановления. Химическая абляция хорошо работает для волосковых клеток, но дозы токсичных химическихвеществ, таких как CuSO 4 должны быть значительно увеличены, чтобы удалить другие боковой линииклеток типов 9. Хотя электроаблирование при микроскопии флуоресценции является эффективным и простым средством уничтожения МНК для изучения регенерации, трудно ориентироваться узко и, следовательно, может привести к значительному сопутствующему ущербу. В результате, это может замаскировать аспекты INMC-специфического поведения10,11. Протоколы лазерной абляции были использованы, но они требуют использования специализированного оборудования не обязательно присутствует в средней лаборатории или объекта визуализации (т.е. мощные импульсныеУФ-лазеры 12). Описанный здесь метод может быть выполнен с помощью любого лазерного сканирования конфокального микроскопа, оснащенного обычным 405-нм лазером, обычно используемым для визуализации DAPI и других синих флюорофоров. Преимущество этого метода заключается в том, что конфокальные изображения могут быть выполнены непосредственно до и после повреждения клеток без привлечения каких-либо дополнительных систем лазерного управления или передачи в другой микроскоп, оснащенный импульсным лазером.
Аналогичный метод был описан для аблятинг нейронов в спинном мозге зебры13. Однако предыдущий метод требует модуля FRAP для абляции клеток, что не является требованием для этого протокола. Кроме того, учитывая различные свойства различных типов клеток (т.е. яркость трансгенной флуоресценции, глубину тела и форму клеток), вполне вероятно, что значительные изменения будут необходимы в зависимости от используемого типа клетки. Протокол подробно здесь, скорее всего, будет эффективным для более поверхностных клеток, как это подтверждается демонстрацией сенсорной абляции клеток волос с использованием того же метода. Также изложен анализ регенерации для оценки темпов восстановления INMC после абляции, которая не была особенностью вышеупомянутого исследования.
Протокол абляции клеток на основе лазера, подробно описанный в настоящем, фиксирует регенеративную способность INMCs за счет оптимизации лазерных условий, пред- и постабляционной визуализации и замедленной микроскопии. Эти элементы объединяются для всестороннего изображения отрастания и закрытия пробелов INMC в полном объеме. Хотя этот протокол используется здесь для уничтожения INMCs, он может быть применен к другой работе, которая требует надежной и эффективной оценки клеточной абляции. Это также доступная технология, так как она может быть проведена на любом конфокальный микроскоп оснащен 405 нм лазера.
Protocol
Вся работа с животными была одобрена Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Пейс в соответствии с протоколом 2018-1.
1. Подготовка личинок зебры
- Настройка спаривания 3-5 дней до проведения эксперимента, таким образом, что личинки будут 2 дней после оплодотворения (dpf) до 4 dpf в возрасте, когда установлен для лазерной абляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Et (krt4:EGFP)sqEt20 (сокращенно ET20) линия ловушки усилителя, в которой межнейромаста клетки четко помечены расширенный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), позволяет относительно легко идентификации клетоки абляции 11,14. Для подтверждения специфики и гибкости лазерной абляции, ET20 рыбы разводят с Tg (neuroD:tdTomato) рыбы, в которых боковой нерв линии помечены красным флуоресцентным белком или с Tg (myo6b:qactin-GFP) для обозначения сенсорных волосковых клеток с GFP15,16. - После сбора эмбрионов на следующий день, инкубировать эмбрионы при 28,5 градусов по Цельсию в E3 среде, содержащей 0,0001% метиленовый синий до готовности к анестезии и горе.
2. Подготовка низкой гелеобразной агарозы и tricaine решений
- К 250 мл стекла Erlenmeyer колбы, добавить 48 мл 1x E3 среды, 2 мл 15 мм трикаин фондовый раствор, и 0,5 г низкоплавления агарозы.
- Микроволновая печь раствор на высоком для 30 с и вихрем (ношение теплозащитных перчаток), чтобы растворить агарозу. Повторите 30 циклов нагрева до полного растворения агарозы.
- Храните агарозу в инкубаторе с подогревом до 42 градусов по Цельсию до готовности к использованию.
3. Обезболить личинки зебры
- К конической трубке 50 мл добавьте 24 мл 1x E3 среднего и 1 мл раствора tricaine stock (15 мМ) в окончательную концентрацию 600 МКМ. Вихрь для смешивания.
- Загрузите одну из шести колодцев пластины культуры с плоским дном с 8 мл E3, содержащей 600 мкм трикаина.
- Используйте перенесите пипетку для перемещения личинок зебры в вставку для переноса с 74 мкм с сетчатым дном.
- Перенесите вставку с сетчатым дном в колодец из шести хорошо пластины, содержащей раствор E3 и tricaine. Разрешить личинки оставаться в колодец в течение как минимум 3 минут или до полного анестезии. Проверьте анестезию, нажав на вставку. Личинки не должны попледать и плавать в ответ на кран.
4. Флуоресцентный скрининг обезболивания личинок зебры
- Pipette одно обезболивающее личинка в наилучшим образом на 12 наилучшим образом гидрофобно-покрыть скольжения для скрининга. Убедитесь, что существует минимальная кривизна мениска формируется в каждой колодец слайда, чтобы уменьшить оптические искажения при скрининге. Это может быть сделано путем удаления небольшого объема E3 из каждого хорошо после размещения личинок.
- Под 10x целью на вертикальном микроскопе (оборудованном лампой дуги ртути, металлическо-галидной лампой, или светодиодным источником света и соответствующим кубиком фильтра), экран для личинок, которые выражают eGFP в нейромасте и межнейромастах клеток боковой линии системы.
- Выберите личинки с более сильным выражением, что приведет к более яркому eGFP, которые, предположительно, однородны для трансгена.
ПРИМЕЧАНИЕ: В линии ET20 eGFP выражается в кольце мантийных клеток, окружающих каждую нейромасту, а также в узкой полосе межнейромных клеток, соединяющих эти органы. Более сильное выражение eGFP (ярче флуоресценции) способствует более эффективной абляции. - Для изучения специфики абляции используйте двухтрансгенные личинки с трансгенами ET20 и Tg (neuroD:tdTomato). Если скрининг для Tg (neuroD:tdTomato) носителей, использовать RFP фильтр куб набор для выявления ярко-красный патч только задний к уху, представляющих заднюю боковой линии ганглия.
- Чтобы аблатировать волосковые клетки в боковой линии нейромастов, используйте Tg (myo6b:qactin-GFP) трансгенной линии и экран для локализации GFP в центре каждой нейромасты.
- Выберите личинки с более сильным выражением, что приведет к более яркому eGFP, которые, предположительно, однородны для трансгена.
- Выберите личинок со стереотипным интервалом нейромаст. Различия в интервале между нейромастами могут указывать на ненормальное осаждение нейромаста во время развития, предполагая дефектное миграционное поведение или пролиферацию клеток в боковой линииизначального 17. Такие дефекты могут также влиять на миграционное или регенеративное поведение INMCs после абляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общие дефекты в интервале включают необычно большое расстояние между передней самой нейромастой, отложенной первым мигрирующими изначами (prim1L1) и второй нейромаст, отложенной тем же изначом (prim1L2), часто связанным с скучением более задней нейромасты.
5. Монтаж личинок для лазерной абляции и визуализации
- Pipette 3 - 4 под наркозом личинки в небольшую каплю раствора E3/tricaine в центре крышки скольжения дном блюдо (35 мм блюдо с 14 мм номер 1,5 крышки). Удалите избыток раствора так, чтобы личинки оставались в небольшой капле, достаточно большой, чтобы содержать их.
- Перенесите блюдо на стадию бинокулярного стерео микроскопа и манипулируйте зумом и фокусом так, чтобы все личинки были в поле зрения.
- Удалите колбу Erlenmeyer, содержащую низкой точки плавления агарозы из нагретого инкубатора. Используйте передачу пипетки для передачи решения агарозы на крышку слайда для получения тонкого слоя. Нарисуйте избыток агарозы, пока жидкость просто заполняет колодец в нижней части блюда, заботясь, чтобы не аспирировать личинок.
- Быстро расположить личинки в растворе агарозы с помощью ножа для волос или волос петли так, что они выровнены друг с другом и ориентированы с рострал влево.
- Аккуратно прижимайте личинки к стеклу ножом для волос, чтобы они лежали в профиль с правой стороны вниз. Larvae старше 3 dpf, как правило, плавают из-за их надутые плавательные пузыри, поэтому они, возможно, потребуется неоднократно прижаты к стеклу, пока агароза начинает гель.
- Примерно через 60 с агароза начнет затвердевать, и личинки не смогут быть переориентирована. Разрешить примерно 5 минут при комнатной температуре для агарозы на крышке скольжения полностью затвердеть. После того, как агароза затвердевла, используйте пересадочную пипетку, чтобы заполнить блюдо на полпути с E3, содержащим 1x tricaine.
6. Поиск перспективных целей и предабляционная визуализация
- Включите питание системы конфокальные микроскопии лазерного сканирования и инициализируйте с помощью интегрированного программного обеспечения для визуализации. Выберите цель погружения в нефть 63x Plan-Apochromat (числовая диафрагма 1.40) или аналогичную. Нанесите масло погружения и закрените блюдо в круглой стадии вставки так, что личинки сталкиваются с их ростральным аспектом слева.
- При ярко-полевом или дифференциальном интерференционном контрастном освещении выберите одну из установленных личинок для визуализации. Отрегулируйте фокус с ручкой фокуса так, что кожа на стороне рыб наиболее близкая к coverslip находится в фокусе, узнаваемом по отпечаткам пальцев-как картина periderm клеток.
- Оказавшись в фокусе, переключитесь на эпифлюоресцентное освещение в канале GFP. Найдите заднюю боковой линию по выражению GFP вдоль горизонтального миосептума. Кольца флуоресцентных клеток указывают на клетки мантии нейромаста, а удлиненные нити клеток являются межнейроматическими клетками.
- Начиная с чопорной нейромассы, обычно расположенной только спинной к желтку, используйте джойстик управления сценой или другой контроль движения стадии, чтобы визуально сканировать caudally вдоль горизонтального миосепта.
- Следуйте строке межнейромастовых клеток до достижения области между primIL3 и primIL4 (L3 и L4) нейромасты (Рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие регионы также могут быть направлены, но этот участок ствола и хвоста, как правило, ближе всего к крышке стекла и, следовательно, наиболее подлезив абляции. - Если изображение нескольких личинок, установить положение первой стадии, а затем инактивировать несколько этапов позиции вариант, отбирая соответствующую коробку проверки.
- Повторите шаги 6.4.1-6.4.2. для каждого желаемого положения стадии (каждая личинка).
- Следуйте строке межнейромастовых клеток до достижения области между primIL3 и primIL4 (L3 и L4) нейромасты (Рисунок 1A).
- После того, как тела клеток в районе L3-L4 будут идентифицированы, переключитесь на режим приобретения.
- Активируйте трек GFP с помощью лазера 488 нм или 491 нм.
- Добавьте передаваемый свет (передаваемый световой фотомультипьерный канал или T-PMT) к активированной лазерной дорожке 488 нм, активировав флажок T-PMT под меню"Imaging Setup".
- Установите мощность лазера до 6%, размер скважины до 1 Airy эквивалент единицы, и цифровой прирост до 750 для изображения ET20 личинок. Точное увеличение и мощность лазера может варьироваться для любой личинки, в зависимости от того, насколько близко к крышке скольжения они установлены и яркость флуоресценции. Отрегулируйте усиление таким образом, чтобы клеточные тела были насыщены для захвата в противном случае тусклых проекций и filipodia.
- Отрегулируйте параметры до размера кадра 1024 пикселей х 1024 пикселей, цифровой зум 0,7 (145,2 мкм х 145,2 мкм размер изображения). Установите в среднем до 2 для улучшения качества изображения.
- Проверьте z-стек поле, чтобы воспитывать z-позиции падение меню. Во время быстрого сканирования сосредоточьтесь до тех пор, пока межнейромальные клетки не выходят из фокуса. Установите первый срез, а затем сосредоточиться через образец, пока межнейромы клетки снова из фокуса. Установите последний кусочек. Убедитесь, что он включает в себя z-стек примерно 25 мкм. Установите интервал изображения до 1 мкм.
- Начните эксперимент, чтобы запечатлеть предабляцию z-стек(рисунок 1B). Если добавлены позиции этапа, актививируете параметр позиций так, чтобы было изображено только текущее положение. Сохраните файл после его захвата.
7. Лазерная абляция тел клеток
- Нажмите накнопку " Показать все инструменты". Эта опция расположена в верхней части интерфейса приобретения.
- Нажмите на меню высадки для "Imaging Настройка". В "Imaging Настройка ",нажмите на " Добавить новыйтрек" (представлен как".
- В "Imaging Set Up", нажмите на меню высадки для "Краситель". Выберите DAPI в качестве красителя.
- Нажмите на меню высадки для"Каналы"и отказаться от всех других треков, unclicking их соответствующих флажков. Убедитесь, что выбирается только трек DAPI.
- В треке DAPI нажмите на 405 для"Лазерной настройки". Увеличьте мощность лазера до 75%. Unclick канал DAPI, чтобы выключить лазер во время сканирования для тела клеток-кандидатов для абляции.
- С телом межнейромастовой клетки, центряющейся в поле зрения, увеличьте масштаб сканирующей рамы до 20x-22x. Положение кадра, возможно, потребуется настроить, чтобы сохранить тело клетки в центре при нанесении зума. Прекратите живое сканирование, как только тело клетки заполнит поле зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тело клетки должно занимать все поле зрения. На этом уровне масштабирования GFP будет быстро отбеливаться. Свести к минимуму время лазерного воздействия, работая быстро. Используйте зум, а не выбор области, представляющие интерес для увеличения распределения лазерной энергии на небольшой площади. - Проверьте 405 нм лазерной коробке затвора, чтобы активировать трек. Отрегулируйте мощность лазера до 75%. Установите таймер на 45 с. Активируйте непрерывное сканирование и запустите таймер. Прекратите сканирование сразу на 45 с.
8. После абляционная визуализация и промежуток времени микроскопия для изучения регенерации
- Нажмите на меню высадки для"Каналов". В каналах, unclick "DAPI" трек для инактивации абляционных лазеров. Нажмите на меню высадки для" Приобретение режиме".
- В режиме приобретения нажмите накнопку "Увеличить".
- Уменьшите зум до 0,7 либо с помощью ползунка, либо набрав"0,7".
- Чтобы обеспечить успешную абляцию клеток, увеличьте прирост до 900 и быстро сканируйте поле зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет GFP должны быть видны в целевой ячейки или ячейки. Если флуоресценция все еще наблюдается, вернуться к шагам 7,1-7,3. - Используя те же или аналогичные настройки, что и для визуализации до абляции, захват и сохранение изображения после абляции(рисунок 1C). Если изображение показывает остатки флуоресцентных клеток или дополнительных клеток, которые должны быть удалены, повторите шаги лазерной абляции, чтобы создать видимый разрыв в строке межнейромастовых клеток.
- Осмотрите изображение канала T-PMT для дальнейшего подтверждения повреждения сотовой связи. Поврежденные клетки будут иметь гранулированный вид, и часто ядра опухают или становятся нерегулярными по форме(рисунок 2).
- Чтобы обеспечить успешную абляцию клеток, увеличьте прирост до 900 и быстро сканируйте поле зрения.
- После захвата изображения, предабляционного изображения, по мере необходимости, и захвата изображения после абляции для каждой отдельной позиции этапа, настроить промежуток времени микроскопии путем активации как положение этапа и время для захвата изображения. Установите параметры времени до 24 ч или другой желаемой конечной точки и 15 мин интервалов. Начните эксперимент по приобретению изображений и сохранению полученного файла после завершения (на следующий день).
- Если личинки должны быть дополнительно изучены или подняты, тщательно удалить их из агарозы с помощью тонкой типсов, а затем передать в E3 среды без трикаина для восстановления. Если они не будут использоваться в дальнейшем, усыпать в соответствии с утвержденным протоколом животных (быстрое и устойчивое погружение в ледяную ванну является распространенным методом) и распоряжаться ими в соответствии с требуется учреждением.
9. Анализ изображений
- Откройте файл после абляции z-stack в предпочтительном программном обеспечении для обработки изображений(Таблица материалов). Разделите каналы так, чтобы каждый канал был в отдельном смотровом стекле.
- В окне канала GFP используйте линейный инструмент, чтобы провести прямую линию между кончиками остальных INMCs. Этому может помочь прокрутка вверх и вниз через z-стек или выполнение проекции максимальной интенсивности до рисования линии.
- Используйте инструмент«Мера»для получения расстояния между концами INMC в x- и y-самолетах.
- Прокрутите z-срезы в исходном z-стеке, чтобы определить расстояние между INMCs в z-самолете.
- Рассчитайте общее расстояние между концами INMC с помощью теоремы Пифагора(a 2 и b2 q2). Гипотенузе является общее расстояние (или размер разрыва).
- Введите полученное измерение расстояния в приложение электронной таблицы для анализа данных.
- Просмотрите файлы микроскопии замедленного действия, собранные в шаге 8.2-8.3, используя либо интегрированное программное обеспечение для визуализации в конфокаловой системе, либо свободно доступное программное обеспечение для анализа изображений. Определите точку времени, в которой разрыв между клетками интернейромы был заполнен клеточными проекциями. Этому может помочь изучение нескольких z-ломтиков для подтверждения закрытия разрыва во всех измерениях.
- Для достижения наиболее точного измерения времени для закрытия зазора используйте штамп времени изображения после абляции (видимый в Finder или File Explorer) в качестве нулевой точки времени; измерение времени от начала стека изображений замедленного действия может привести к недооценке времени закрытия, в зависимости от того, сколько времени прошло при одновременном использовании дополнительных позиций этапа и т.д.
- Получить скорость закрытия, просто разделив первоначальный размер разрыва (мкм) на часы или минуты, необходимые для полного закрытия разрыва.
Representative Results
Для того, чтобы абляции INMCs и записи регенерации, скрининг GFP-выражение личинок зебры ET20 трансгенной линии были установлены на 2- или 3-дней после оплодотворения для абляции, как описано в шаге 5.4. Несколько рыб могут быть установлены одновременно, так что несколько промежуток времени могут быть захвачены в одном эксперименте. Область боковой линии, расположенной между primIL3 и primIL4 нейромасты была определена, и до абляции изображения были захвачены, как описано в шагах 6,5-6,7(рисунок 1A,B).
Три клеточных тела были направлены на лазерную абляцию, чтобы создать зазор в строке INMC около 40 мкм. Постабляционное сканирование с высоким приростом и последующей визуализацией подтвердило, что в абляционной области не осталось тел клеток, оставив зазор между удлиненными проекциями смежныхINMCs (рисунок 1C). Гибель клеток была дополнительно продемонстрирована путем изучения канала Т-ПМТ после абляции. Поврежденные и умирающие клетки были отмечены опухшими ядрами неправильной формы, а также гранулированным внешнимвидом (рисунок 2, изложенный). В некоторых случаях, промежуток времени изображения также показали набор крупных амебоидных клеток, которые, вероятно,макрофаги (рисунок 2, звездочка). Темные области, окружающие абляционные INMCs указали photobleaching в чрезмерно periderm клеток. Эти клетки, как представляется, не были повреждены или уничтожены лазерным облучением в ходе этих экспериментов; скорее, их флуоресценция была временно снижена. Покадровая микроскопия показывает, что эти клетки обычно восстанавливаются после абляции и не меняют форму или иным образом появляются поврежденными (неопубликованные результаты, Volpe et al.).
Для поддержки специфики уничтожения INMC, абляции были выполнены в двухтрансгенных ET20 и Tg (neuroD:tdTomato) личинки, в которых боковой нерв линии (который работает только микроны ниже межнейроматных клеток) помечен красным флуоресцентным белком. Абляции нескольких клеток, которые создали значительные пробелы в строке INMC, практически не повлияли на боковой линейный нерв, основанный на красной флуоресценции(рисунок 3). Гибкость методики абляций поверхностно локализованных клеток была продемонстрирована селективным разрушением отдельных сенсорных волосковых клеток в нейромастах боковой линии. Используя по существу тот же протокол, описанный выше (разделы 7 и 8), одиночные волосковых клеток в трансгенных Tg (myo6b: qactin-GFP) личинки были уничтожены без видимых повреждений соседних клеток (Рисунок 4). Абляционные волосковые клетки не восстанавливали флуоресценцию после покадровой микроскопии, а их ядра были заметно гранулированными и деформированными после лазерногооблучения (рисунок 4B). Подобно абляции INMC, очевидные макрофаги часто набирались на место лазерной экспозиции (неопубликованные результаты, Volpe et al.).
После лазерной абляции и захвата изображения после абляции размер разрыва измерялся с помощью свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений. Инструмент измерения продемонстрировал размеры зазора от нескольких микрон до 100 микрон, в зависимости от ширины отдельных INMCs и сколько клеток было выбрано для абляции(рисунок 5). Микроскопия timelapse была использована для записи поведения INMC во время регенерации. В 50 испытаниях 15 пробелов (30%) были закрыты регенерацией в течение 24 часов. В большинстве случаев, INMCs, которые смогли восстановить сделал это в течение первых нескольких часов изображения. Восстановление было определено как точка времени, в которой прогнозы из соседних клеток вступил в контакт, который произошел 16 ч после абляции для разрыва около 40 мкм (Movie 1). Для обеспечения того, чтобы контакт между ячейками и ячейками происходил в пределах одного z-самолета, удалось тщательно изучить стеки, избегая возможных артефактов из-за z-проекций. Анализ логистической регрессии показал, что вероятность закрытия разрыва коррелирует с размером разрыва (р 0,0453), при этом меньшие пробелы с большей вероятностью заживут. Разрыв в 55,5 мкм дал вероятность закрытия 50%(рисунок 5).
В 70% случаев МНК не смогли полностью закрыть разрыв, созданный абляцией. Однако даже в этих случаях мы смогли контролировать формирование длинных проекций из соседних INMCs, которые напоминают в некоторых отношениях расширение конусов роста нейронов (Movie 2). Таким образом, эти эксперименты могут также дать представление о поведении INMCs после повреждения.
Рисунок 1: Селективная абляция межнейромных клеток путем лазерного облучения. (A) Межнейромастовые клетки между нейромастами primIL3 и primIL4 были отобраны для абляции. Эти клетки отображают характерную форму шпинделя с удлиненными проекциями, перекрывающими смежные тела клеток. (B)Предабляционная визуализация определила тела клеток, которые могут быть абляции производить разрыв. (C)После абляционная визуализация подтверждает успешную абляцию, о чем свидетельствует отсутствие клеток в области разрыва. Масштаб баров 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Пост-абляционная визуализация демонстрирует гибель клеток в ответ на лазерное воздействие в клетках интернейромы с маркировкой GFP. Передаваемая световая фотомультипьерная визуализация (T-PMT) указывает на наличие некротической клетки с гранулированным внешним видом (окруженным), а также на набор клеток неправильной формы, которые, вероятно, являются макрофагами. Слияние каналов GFP и T-PMT подтверждает, что гибель клеток и активность макрофагов происходили в месте абляции. Масштаб баров 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Специфика межнейромастовой абляции. (A) Предабляция GFP помечены межнейромастовых клеток (зеленый) и tdTomato помечены боковой линии нерва (красный) в двойной трансгенной Tg (ET20; NeuroD:tdTomato) личинка. Тела клеток в непосредственной близости от боковой линии нерва были направлены на абляцию. (B)Пост-абляционная визуализация демонстрирует абляцию целевых тел клеток с нетронутыми боковой линии нерва. Шкала баров 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Абляция сенсорных волосковых клеток с использованием конфокаляционной микроскопии. (A) Предабляционная визуализация определила GFP помечены сенсорные клетки волос (я) предназначены для абляции в двойной трансгенной Tg (ET20; myo6b: qactin-GFP) зебры. Переданная световая фотомультипьерная трубка (T-PMT) показывает нормальную морфологию волосяных клеток, с круглым поперечным сечением. (B) После абляционной визуализации подтверждает успешную абляцию целевой волосяной клетки. T-PMT изображение указывает на неровности в форме волосяных клеток и увеличение детализации после лазерного воздействия, предполагая гибель клеток, а не фотоотчет. Шкала баров 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Логистическая регрессия моделирует вероятность закрытия зазора в качестве функции ширины зазора (в мкм). Оценка 0 представляет собой полное закрытие разрыва, в то время как оценка 1 представляет собой неполное закрытие разрыва. Результаты показывают, что влияние ширины зазора на способность межнейромных клеток закрывать соответствующие пробелы является статистически значимым (р No 0,0453, n No 24 всего; n No 12 закрытых зазоров, n No 12 неполно закрытых зазоров). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Фильм 1: Микроскопия замедленного действия, демонстрирующая замыкание зазора (40 мкм) после 16 ч. Изображения были сняты каждые 15 минут, и максимальная интенсивность z-проекция была сделана для всех точек времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Фильм 2: Промежуток времени микроскопии разрыва INMC, который не был близок. Показаны удлиненные и разветвленные проекции остальных INMCs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Discussion
Протокол описывает универсальный метод абляции лазерных клеток, который может быть выполнен на любом конфокальцивном микроскопе, оснащенном почти ультрафиолетовым лазером (405 нм длины волны). В этом протоколе рассматриваются ограничения ранее используемых методов, таких как электроабляция (которая вызываетболее широкое повреждение 11)и импульсная УФ-лазерная абляция (которая требует дополнительного специализированногооборудования 12). Пред- и после абляционная конфокальные изображения обеспечивают быструю обратную связь относительно успеха эксперимента. Последующая покадровая микроскопия предлагает простой анализ для регенерации в клеточном типе, критически важном для развития сенсорной системы.
Это жизненно важно для предварительного проверки для трансгенных зебры, которые выражают GFP сильно в нейромасты и INMCs. Личинки с яркой флуоресценцией и примерно равномерноями, полученными из primI, являются идеальными кандидатами для лазерной абляции. Даже в этих рыб, Есть иногда тусклым INMCs, которые могут на первый побег обнаружения. Эти клетки могут оставаться позади после лазерной абляции, предотвращая образование истинного разрыва между INMCs. Цифровой прирост должен быть скорректирован, чтобы выявить эти тусклые клетки во время предварительной абляции изображения таким образом, что они также могут быть направлены с 405 нм лазера (шаг 8.2).
Аналогичным образом, лазерная ориентация иногда не будет полностью уничтожить ячейку; скорее, это будет отбеливать флуоресценцию, в результате чего не создать реальный разрыв. Эти клетки, как правило, увеличение флуоресценции во время микроскопии timelapse. Корректировка усиления на этапе визуализации после абляции наряду с T-PMT imaging(рисунок 2)поможет гарантировать, что все целевые клетки были эффективно удалены. Для создания зазора в строке INMC часто требуется два или три отдельных клеточных абляции. Гибель клеток может быть обнаружена путем blebbing или гранулированного появления в целевых клетках; хотя, это может потребовать короткого периода ожидания после лазерного прицелии (а в некоторых случаях, очевидные апоптотические или некротические фигуры наблюдаются вскоре после этого).
Ограничение этой процедуры заключается в том, что она может потребовать нескольких экспериментальных испытаний, прежде чем лазерные условия оптимизированы и регенерация INMC является успешной. Лазерная мощность и общее время обитуемого лазера могут потребовать небольшой корректировки для различных образцов. Было установлено, что чрезмерное применение лазера может ухудшить способность боковой линии к саморемонту. Это включает в себя как 1) чрезмерное воздействие отдельных клеток на лазерное облучение, предположительно вызывая дополнительные повреждения окружающих тканей, а также 2) абляция слишком много клеток в строке, что приводит к большему разрыву. Пользователи должны достичь баланса между достаточно облучающих клеток, чтобы обеспечить их разрушение, а не переэкспонировать клетки, которые могут замедлить или предотвратить регенерацию. При соответствующих настройках, было установлено, что INMCs могут быть удалены без видимых повреждений задней боковой линии нерва, указывая, что сопутствующий ущерб сводится к минимуму с помощью этого протокола в отличие отэлектроабляции 11. Ни в одной из случаев не были новые нейромасты формирования в разрыв наблюдается, предположительно потому, что боковой нерв линии остается нетронутым и основные глиальные клетки остаются иподавляют распространениеINMCs 6,7,8,11.
Попродемонстрировано, что этот метод конфокального лазерного абляции может быть применен и к другим типам клеток, особенно в тех, которые поверхностно расположены внутри животного, включая сенсорные волосяныеклетки (рисунок 4). Аналогичный протокол может быть использован для аблата клеток кожи для изучения раны ремонт или нейронов для аксональной регенерации исследований, как ранее описано13. Предполагается, что этот метод станет полезным дополнением к экспериментальному репертуару лабораторий, обладающих конфокальцатором, но не обладающих другим специализированным оборудованием для лазерной абляции.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет гранта NIH R15 1R15DC015352-01A1 и внутренних источников финансирования Университета Пейс. Рыбные линии были предоставлены ВладимирКорж 14,Кэти Kindt 15,16, и лаборатория А. Джеймс Хадспет. Мы хотели бы поблагодарить А. Джеймса Хадспета и членов его группы за отзывы об этих экспериментах, а также коллег из Университета Пейс за их поддержку. Анализу логистической регрессии в RStudio, в частности, помогал наш коллега Мэтью Айелло-Ламмерс.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C.
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
