Essai confocal d’ablation et de régénération au microscope dans les cellules interuromast de Zebrafish

Summary

L’ablation au laser est une technologie largement applicable pour étudier la régénération dans les systèmes biologiques. Le protocole présenté décrit l’utilisation d’un microscope confocal standard de laser-balayage pour l’ablation de laser et la formation image time-lapse suivante des cellules interuromast régénérantes dans la ligne latérale de zebrafish.

Abstract

Les cellules capillaires sont des cellules mécanosensoryes qui médient le sens de l’ouïe. Ces cellules ne se régénèrent pas après des dommages chez l’homme, mais elles sont naturellement réapprovisionnées chez les vertébrés non mammifères comme le poisson zèbre. Le système de ligne latérale zebrafish est un modèle utile pour caractériser la régénération sensorielle des cellules capillales. La lignée latérale est composée d’organes contenant des cellules capillaires appelés neuromasts, qui sont reliés entre eux par une chaîne de cellules interuromast (INMC). Les INMC agissent comme des cellules progénitrices qui donnent naissance à de nouveaux neuromasts pendant le développement. Les INMC peuvent réparer les lacunes du système de ligne latérale créé par la mort cellulaire. Une méthode est décrite ici pour l’ablation sélective d’INMC utilisant un microscope confocal conventionnel de laser-balayage et les poissons transgéniques qui expriment la protéine fluorescente verte dans LES INMC. La microscopie time-lapse est ensuite utilisée pour surveiller la régénération de l’INMC et déterminer le taux de fermeture des écarts. Il s’agit d’un protocole accessible pour l’ablation cellulaire qui ne nécessite pas d’équipement spécialisé, comme un laser ultraviolet pulsé de grande puissance. Le protocole d’ablation peut servir des intérêts plus larges, car il pourrait être utile pour l’ablation de types de cellules supplémentaires, en utilisant un ensemble d’outils qui est déjà disponible pour de nombreux utilisateurs. Cette technique permettra en outre la caractérisation de la régénération inmc dans différentes conditions et de différents milieux génétiques, ce qui permettra de faire progresser la compréhension de la régénération sensorielle des cellules progénitrices.

Introduction

Au cœur de la perte auditive la plus progressive se trouve la destruction des cellules capillaires sensorielles, qui transduisent des stimuli auditifs extrinsèques en impulsions nerveuses détectables par le cerveau. La mort des cellules cochléaires provoque une perte auditive permanente, car les mammifères adultes n’ont pas la capacité de régénérer ces cellules à la suite de dommages. Inversement, les vertébrés non mammifères comme le poisson zèbre peuvent régénérer les cellules cils perdues à cause d’un traumatisme acoustique ou d’une insulte ototoxique. La ligne latérale mécanosensory de poisson zèbre est un système d’organe simple et facilement manipulé qui peut être employé pour étudier la régénération de cellules de^{cheveux 1,2,3.}

La lignée latérale se compose de petites plaques sensorielles appelées neuromasts, qui sont reliées pendant le développement par une chaîne de cellules allongées connues sous le nom de cellules interuromast (INMC). Compte tenu de leur capacité proliférative en tant que cellules souches apparentes qui donnent naissance à de nouveaux organes contenant des cellules capillaires, le comportement des INMC est d’un grand intérêt pour la^{communauté 4,5}. Une grande partie de la recherche concernant les INMC a caractérisé la suppression de leur prolifération par les cellules voisines de Schwann qui s’enroulent autour du nerf latéral de ligne, probablement par un inhibiteur de la signalisation de Wnt/β-caténine. ^6,7,8. Bien que la régulation de la prolifération et de la différenciation de l’INMC en nouveaux neuromasts ait été bien décrite, les mécanismes régissant la repousse de l’INMC après ablation n’ont pas été élucidés. Ce protocole sert de moyen d’ablating INMC individuels et d’analyser leur comportement régénérateur ultérieur.

Une variété de méthodes pour détruire les cellules capillaires, les cellules de soutien et les neuromasts entiers ont été publiées, ainsi que des méthodologies pour surveiller la récupération. L’ablation chimique fonctionne bien pour les cellules cils, mais les doses de produits chimiques toxiques tels que CuSO 4 doivent être_{considérablement} augmentées pour enlever d’autres types de cellules latérales^{de ligne 9.} Bien que l’électroablation par microscopie par fluorescence soit un moyen efficace et simple de détruire les INMC pour étudier la régénération, elle est difficile à cibler de façon étroite et, par conséquent, est susceptible de causer des dommages collatéraux importants. En conséquence, cela peut masquer des aspects des comportements spécifiques à l’INMC^10,11. Des protocoles d’ablation au laser ont été utilisés, mais ils nécessitent l’utilisation d’équipement spécialisé qui n’est pas nécessairement présent dans le laboratoire moyen ou l’installation d’imagerie (c.-à-d. les lasers UV^{pulsés de grande puissance 12).} La méthode décrite ici peut être effectuée avec n’importe quel microscope confocal à balayage laser équipé du laser commun de 405 nm, habituellement utilisé pour l’imagerie DAPI et d’autres fluorophores bleus. Un avantage de cette méthode est que l’imagerie confocale peut être effectuée immédiatement avant et après les dommages cellulaires sans engager de systèmes de contrôle laser supplémentaires ou de transfert à un autre microscope équipé d’un laser pulsé.

Une méthode similaire a été décrite pour ablating neurones dans la moelle épinière zebrafish¹³. Toutefois, la méthode précédente nécessite un module FRAP pour l’ablation cellulaire, ce qui n’est pas une exigence pour ce protocole. En outre, étant donné les propriétés distinctes de différents types de cellules (c.-à-d. la luminosité de la fluorescence transgénique, la profondeur dans le corps et la forme des cellules), il est probable que des modifications importantes seront nécessaires selon le type de cellule utilisé. Le protocole détaillé ici est plus susceptible d’être efficace pour les cellules plus superficielles, comme soutenu par une démonstration de l’ablation sensorielle des cellules capillaires en utilisant la même méthode. Un test de régénération est également décrit pour évaluer les taux de récupération de l’INMC après ablation, ce qui n’était pas une caractéristique de l’étude susmentionnée.

Le protocole d’ablation cellulaire au laser détaillé ci-après capture la capacité régénératrice des INMC grâce à l’optimisation des conditions laser, de l’imagerie avant et après l’ablation et de la microscopie en accéléré. Ces éléments se réunissent pour dépeindre de manière exhaustive la repousse de l’INMC et la fermeture des écarts dans son ensemble. Bien que ce protocole soit utilisé ici pour détruire les INMC, il peut être appliqué à d’autres travaux qui nécessitent une évaluation fiable et efficace de l’ablation cellulaire. C’est aussi une technologie accessible, puisqu’elle peut être menée sur n’importe quel microscope confocal équipé d’un laser de 405 nm.

Protocol

Tous les travaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Pace en vertu du protocole 2018-2011.

1. Préparation des larves de poisson zèbre

1. Mettre en place l’accouplement 3-5 jours avant la réalisation de l’expérience, de sorte que les larves seront 2 jours après la fécondation (dpf) à 4 dpf dans l’âge lorsqu’il est monté pour l’ablation au laser.
   REMARQUE : La ligne de piégeage et(krt4:EGFP)sqEt20 (abrégée EN20), dans laquelle les cellules interuromast sont clairement étiquetées avec la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), permet une identification cellulaire relativement facile et l’ablation^11,14. Pour confirmer la spécificité et la flexibilité de l’ablation au laser, les poissons ET20 sont élevés avec des poissons Tg(neuroD:tdTomato),dans lesquels le nerf latéral est étiqueté avec des protéines fluorescentes rouges ou avec tg (myo6b:βactin-GFP) pour étiqueter les cellules capillaires sensorielles avec GFP^15,16.
2. Après la collecte d’embryons le lendemain, incuber des embryons à 28,5 °C dans le milieu E3 contenant 0,0001 % de bleu méthylène jusqu’à ce qu’ils soient prêts à anesthésier et à monter.

2. Préparation de solutions d’agarose et de tricaine à faible gelling

1. Dans un flacon Erlenmeyer en verre de 250 mL, ajouter 48 mL de milieu E3 1x, 2 mL de solution de stock de tricaine de 15 mM et 0,5 g d’agarose à faible fondante.
2. Micro-ondes la solution à haute hauteur pendant 30 s et tourbillonner (portant des gants de protection thermique) pour dissoudre l’agarose. Répétez les cycles de chauffage de 30 s jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
3. Conserver l’agarose dans un incubateur chauffé à 42 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.

3. Anesthésie des larves de poisson zèbre

1. Dans un tube conique de 50 mL, ajouter 24 mL de 1 x E3 moyen et 1 mL de solution de stock de tricaine (15 mM) à une concentration finale de 600 μM. Tourbillon à mélanger.
2. Chargez l’un des six puits d’une plaque de culture cellulaire à fond plat avec 8 mL d’E3 contenant 600 μM de tricaine.
3. Utilisez une pipette de transfert pour déplacer les larves de poisson zèbre dans un insert de transfert à fond de maille de 74 μm.
4. Transférer l’insert à fond de maille dans le puits de la plaque de six puits contenant la solution E3 + tricaine. Permettre aux larves de rester dans le puits pendant au moins 3 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement anesthésiées. Testez l’anesthésie en appuyant sur l’insert. Les larves ne doivent pas surserner et nager en réponse au robinet.

4. Criblage fluorescent des larves anesthésiées de poisson zèbre

1. Pipette une larve anesthésiée par puits sur 12 toboggans bien recouverts d’hydrophobe pour le criblage. Assurez-vous qu’il y a une courbure minimale du ménisque formé dans chaque puits de la glissière pour réduire la distorsion optique lors du criblage. Cela peut être fait en enlevant un petit volume d’E3 de chaque puits après avoir placé les larves.
2. Sous un objectif de 10 x sur un microscope droit (équipé d’une lampe à arc de mercure, d’une lampe à halogénure métallique ou d’une source lumineuse LED et d’un cube de filtre approprié), dépister les larves qui expriment l’eGFP dans les neuromasts et les cellules interuromast du système de ligne latérale.
   1. Sélectionnez les larves dont l’expression est plus forte, ce qui donne un eGFP plus lumineux, qui sont vraisemblablement des homozygotes pour le transgène.
      REMARQUE : Dans la lignée ET20, l’eGFP s’exprime dans un anneau de cellules du manteau entourant chaque neuromast ainsi que dans la bande étroite des cellules interuromast reliant ces organes. Une expression eGFP plus forte (fluorescence plus brillante) contribue à une ablation plus efficace.
   2. Pour examiner la spécificité de l’ablation, utilisez des larves double-transgéniques avec les transgènes ET20 et Tg(neuroD:tdTomato). Si vous testez les porteurs de Tg(neuroD:tdTomato), utilisez le cube de filtre RFP pour identifier un patch rouge vif juste postérieur à l’oreille représentant le ganglion latéral postérieur de la ligne.
   3. Pour abréchir les cellules cils dans les neuromasts de la lignée latérale, utilisez la ligne transgénique Tg(myo6b:βactin-GFP) et l’écran pour la localisation du GFP au centre de chaque neuromast.
3. Sélectionnez les larves avec un espacement stéréotypé des neuromasts. Les différences dans l’espacement entre les neuromasts peuvent indiquer le dépôt anormal de neuromast pendant le développement, suggérant le comportement migratoire défectueux ou la prolifération cellulaire dans le primordium latéral de^{ligne 17.} De tels défauts peuvent également affecter le comportement migratoire ou régénérateur des INMC après ablation.
   REMARQUE : Les défauts communs dans l’espacement incluent une distance exceptionnellement grande entre le neuromast antérieur-le plus déposé par le premier primordium migrateur (prim1L1) et le deuxième neuromast déposé par le même primordium (prim1L2), souvent associé à l’encombrement des neuromasts plus postérieurs.

5. Larves de montage pour l’ablation au laser et l’imagerie

1. Pipette 3 - 4 larves anesthésiées dans une petite gouttelette de solution E3/tricaine au centre d’un plat à fond de glissement de couverture (plat de 35 mm avec un couvercle numéro 1,5 de 14 mm). Enlever l’excès de solution pour que les larves restent dans une petite gouttelette, juste assez grande pour les contenir.
2. Transférez le plat au stade d’un microscope stéréo binoculaire et manipulez le zoom et concentrez-vous afin que toutes les larves soient dans le champ de vision.
3. Retirer le flacon Erlenmeyer contenant le point de fusion bas de l’incubateur chauffé. Utilisez une pipette de transfert pour transférer la solution agarose sur la glissière de couverture pour produire une fine couche. Enlever l’excès d’agarose jusqu’à ce que le liquide remplisse juste le puits au fond du plat, en prenant soin de ne pas aspirer les larves.
4. Disposer rapidement les larves dans la solution agarose à l’aide d’un couteau à cheveux ou d’une boucle de cheveux afin qu’elles soient alignées les unes avec les autres et orientées avec rostral vers la gauche.
5. Appuyez doucement sur les larves contre le verre avec le couteau à cheveux, de sorte qu’ils se trouvent dans le profil avec leurs côtés droits vers le bas. Les larves âgées de plus de 3 dpf ont tendance à flotter en raison de leur vessie natatoire gonflée, de sorte qu’ils peuvent avoir besoin d’être pressés à plusieurs reprises contre le verre jusqu’à ce que l’agarose commence à geler.
6. Après environ 60 s, l’agarose commencera à se solidifier, et les larves ne pourront pas être réorientées. Prévoyez environ 5 minutes à température ambiante pour que l’agarose sur le bordereau de couverture se solidifie complètement. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, utilisez une pipette de transfert pour remplir le plat à mi-chemin avec l’E3 contenant 1x tricaine.

6. Localisation des cibles prospectives et imagerie pré-ablation

1. Allumez la puissance du système de microscopie confocale à balayage laser et initialisez par le biais du logiciel d’imagerie intégré. Sélectionnez l’objectif d’immersion d’huile plan-apochromat 63x (ouverture numérique 1,40) ou similaire. Appliquer l’huile d’immersion et fixer le plat dans un insert de stade circulaire de sorte que les larves font face à leur aspect rostral vers la gauche.
2. Sous un éclairage de contraste de brouillage à champ lumineux ou différentiel, sélectionnez l’une des larves montées pour l’imagerie. Ajustez la mise au point avec le bouton de mise au point de telle sorte que la peau sur le côté du poisson le plus proche de la couverture est au point, reconnaissable par le modèle d’empreinte digitale des cellules periderm.
3. Une fois au point, passez à l’éclairage épifluorescent dans le canal GFP. Localiser la ligne latérale postérieure par expression GFP le long du myoseptum horizontal. Les anneaux des cellules fluorescentes indiquent les cellules neuromast de manteau, et les brins allongés des cellules sont des cellules interuromast.
4. En commençant par le neuromast primIL1, habituellement situé juste dorsale au jaune, utilisez le joystick de contrôle de scène ou tout autre contrôle de mouvement d’étape pour scanner visuellement caudally le long du myoseptum horizontal.
   1. Suivez la chaîne des cellules interuromast jusqu’à atteindre la région entre les neuromasts primIL3 et primIL4 (L3 et L4) (Figure 1A).
      REMARQUE : D’autres régions peuvent également être ciblées, mais cette section du tronc et de la queue a tendance à être la plus proche du verre de couverture et, par conséquent, la plus agréable à l’ablation.
   2. Si vous imageriez plusieurs larves, réglez la position du premier étage, puis inactivez l’option des positions à plusieurs étapes en désélectionnant la case à cochée appropriée.
   3. Répétez les étapes 6.4.1-6.4.2. pour chaque position de scène désirée (chaque larve).
5. Une fois que les corps cellulaires de la région L3-L4 ont été identifiés, passez au mode d’acquisition.
   1. Activez une piste d’imagerie GFP à l’aide du laser 488 nm ou 491 nm.
   2. Ajoutez un canal de lumière transmise (tube photomultiplier de lumière transmise ou T-PMT) à la piste laser active de 488 nm en activant la case à cocher T-PMT dans le menu de dropdown «Imaging Setup».
   3. Réglez la puissance laser à 6 %, la taille du sténopé à 1 équivalent unité aéroy et le gain numérique à 750 pour l’imagerie des larves d’ET20. Le gain exact et la puissance laser peuvent varier pour n’importe quelle larve donnée, selon la proximité du glissement de couverture qu’ils sont montés et la luminosité de la fluorescence. Ajustez le gain de telle sorte que les corps cellulaires soient saturés pour capturer des projections et des filipodia autrement faibles.
   4. Ajustez les paramètres à une taille d’image de 1024 pixels x 1024 pixels, zoom numérique de 0,7 (145,2 μm x 145,2 μm taille de l’image). Réglez en moyenne à 2 pour améliorer la qualité de l’image.
6. Cochez la boîte z-stack pour faire monter le menu de dropdown z-position. Tout en scannant rapidement, concentrez-vous jusqu’à ce que les cellules interuromast soient juste hors de discussion. Réglez la première tranche, puis concentrez-vous à travers l’échantillon jusqu’à ce que les cellules interuromast soient une fois de plus hors de discussion. Réglez la dernière tranche. Assurez-vous qu’il englobe une pile z d’environ 25 μm. Réglez l’intervalle d’imagerie à 1 μm.
7. Commencez l’expérience pour capturer une z-stack de pré-ablation (Figure 1B). Si des positions d’étape ont été ajoutées, inactivez l’option positions de sorte que seule la position actuelle est image. Enregistrez le fichier une fois qu’il est capturé.

7. Ablation au laser des corps cellulaires

1. Cliquez sur "Afficher tous les outils« . Cette option est située en haut de l’interface d’acquisition.
2. Cliquez sur le menu dropdown pour "Imaging Set Up« . Dans "Imaging Set up« , cliquez sur " Ajouter une nouvellepiste" (représentée comme "+« ).
3. Dans "Imaging Set Up« , cliquez sur le menu dropdown pour "Dye« . Sélectionnez DAPI comme colorant.
4. Cliquez sur le menu dropdown pour "Channels" et désélectionner toutes les autres pistes en détrballant leurs casettes respectives. Assurez-vous que seule la piste DAPI est sélectionnée.
5. Dans la piste DAPI, cliquez sur 405 pour le "réglage laser« . Augmenter la puissance laser à 75%. Défécez le canal DAPI pour éteindre le laser tout en scannant les corps cellulaires candidats pour l’ablation.
6. Avec le corps d’une cellule interneuromast centrée dans le champ de vision, zoomez dans le cadre de balayage à 20x-22x. La position du cadre peut devoir être ajustée pour maintenir le corps cellulaire au centre au fur et à mesure que le zoom est appliqué. Arrêtez la numérisation en direct dès que le corps cellulaire remplit le champ de vision.
   REMARQUE : Le corps cellulaire doit occuper tout le champ de vision. À ce niveau de zoom, le GFP blanchira rapidement. Réduisez au minimum le temps d’exposition au laser en travaillant rapidement. Utilisez le zoom plutôt que de sélectionner une région d’intérêt pour augmenter la distribution de puissance laser sur une petite zone.
7. Vérifiez la boîte d’obturateur laser de 405 nm pour activer la piste. Réglez la puissance laser à 75%. Réglez une mise à jour pour 45 s. Activez la numérisation continue et démarrez la insurrateur. Arrêtez immédiatement de scanner à 45 s.

8. Imagerie post-ablation et microscopie en accéléré pour étudier la régénération

1. Cliquez sur le menu dropdown pour "Channels« . Dans les canaux, détrêtez lapiste « DAPI» pour inactiver le laser d’ablation. Cliquez sur le menu dropdown pour "Mode Acquisition« .
2. En mode acquisition, cliquez sur "Zoom« .
3. Diminuez le zoom à 0,7 soit en utilisant le curseur ou en tapant dans "0,7« .
   1. Pour assurer le succès de l’ablation cellulaire, augmentez le gain à 900 et numérisez rapidement le champ de vision.
      REMARQUE : Aucun GFP ne doit être visible à l’intérieur de la cellule ou des cellules ciblées. Si la fluorescence est toujours observée, revenez aux étapes 7.1-7.3.
   2. En utilisant les mêmes paramètres ou des paramètres similaires que ceux décrits pour l’imagerie pré-ablation, capturer et enregistrer une image post-ablation (Figure 1C). Si l’image révèle des restes de cellules fluorescentes ou de corps cellulaires supplémentaires qui doivent être enlevés, répétez les étapes d’ablation laser pour créer un espace visible dans la chaîne des cellules interuromast.
   3. Inspectez l’image du canal T-PMT pour confirmer davantage les dommages cellulaires. Les cellules endommagées auront un aspect granulaire, et souvent les noyaux gonfleront ou deviendront irréguliers dans la forme (figure 2).
4. Après avoir capturé une image de pré-ablation, ablating les cellules si nécessaire, et la capture d’une image post-ablation pour chaque position de scène individuelle, mettre en place la microscopie time-lapse en activant à la fois la position de l’étape et les options de temps pour la capture d’image. Réglez les paramètres de temps à 24 h ou un autre point final désiré et des intervalles de 15 min. Commencez l’expérience pour acquérir des images et enregistrer le fichier résultant une fois terminé (le lendemain).
5. Si les larves doivent être étudiées ou élevées, retirez-les soigneusement de l’agarose à l’aide de forceps fins, puis transférez-les dans le milieu E3 sans tricaine pour la récupération. S’ils ne doivent pas être utilisés plus loin, euthanasier selon le protocole animal approuvé (l’immersion rapide et soutenue dans un bain de glace est une méthode courante) et les éliminer comme l’exige l’institution.

9. Analyse d’image

1. Ouvrez un fichier z-stack post-ablation dans le logiciel de traitement d’image préféré( Table of Materials). Divisez les canaux de telle sorte que chaque canal est dans un volet de visionnement séparé.
2. Dans la fenêtre du canal GFP, utilisez l’outil de ligne pour tracer une ligne droite entre les extrémités des INMC restants. Cela peut être facilité par le défilement de haut en bas à travers la z-stack ou en effectuant une projection d’intensité maximale avant de tracer la ligne.
3. Utilisezl’outil «Mesure » pour obtenir la distance entre les extrémités INMC dans les plans x et y.
4. Faites défiler les tranches z dans la pile z d’origine pour déterminer la distance entre les INMC dans le z-plane.
5. Calculer la distance totale entre les extrémités de l’INMC à l’aide du théorème de Pythagore^{(un 2} + b² = c²). L’hypoténuse est la distance totale (ou la taille de l’écart).
6. Entrez la mesure de distance résultante dans une application de feuille de calcul pour l’analyse des données.
7. Examinez les fichiers de microscopie en accéléré recueillis à l’étape 8.2-8.3 à l’aide soit du logiciel d’imagerie intégré sur le système confocal, soit d’un logiciel d’analyse d’image librement disponible. Identifier le moment où l’écart entre les cellules interuromast a été comblé par des projections cellulaires. Cela peut être facilité par l’examen de plusieurs tranches z pour confirmer la fermeture de l’écart dans toutes les dimensions.
8. Pour obtenir la mesure la plus précise du temps de fermeture des écarts, utilisez l’horodatage d’image post-ablation (visible dans Finder ou File Explorer) comme point zéro; mesurer le temps écoulé depuis le début de la pile d’images time-lapse peut entraîner une sous-estimation du temps de fermeture, selon le temps écoulé tout en ablating positions de scène supplémentaires, etc.
9. Tirez le taux de fermeture en divisant simplement la taille de l’écart d’origine (μm) par les heures ou les minutes requises pour la fermeture complète de l’écart.

Representative Results

Afin d’apaiser les INMC et d’enregistrer la régénération, des larves de poisson zèbre s’exprimant par GFP de la lignée transgénique ET20 ont été montées à 2 ou 3 jours après la fécondation pour l’ablation telle que décrite à l’étape 5.4. Plusieurs poissons peuvent être montés simultanément de sorte que plusieurs laps de temps peuvent être capturés en une seule expérience. La région de la ligne latérale située entre les neuromasts primIL3 et primIL4 a été identifiée, et des images de pré-ablation ont été capturées telles que décrites dans les étapes 6.5-6.7 (Figure 1A,B).

Trois corps cellulaires ont été ciblés pour l’ablation au laser afin de créer un espace dans la chaîne INMC d’environ 40 μm. Le balayage post-ablation avec gain élevé et imagerie subséquente a confirmé qu’aucun corps cellulaire n’est resté dans la région ablated, laissant un écart entre les projections allongées des INMC adjacents (figure 1C). La mort cellulaire a été démontrée en examinant le canal de T-PMT après ablation. Les cellules endommagées et mourantes ont été marquées par des noyaux gonflés et de forme irrégulière ainsi qu’une apparence granulaire (figure 2, décrite). Dans certains cas, l’imagerie en accéléré a également révélé le recrutement de grosses cellules amimoeboides qui étaient probablement des macrophages (figure 2, astérisque). Les zones sombres entourant les INMC ablated ont indiqué le photobleaching dans les cellules periderm overlying. Ces cellules ne semblent pas avoir été endommagées ou détruites par irradiation au laser dans ces expériences; au contraire, leur fluorescence a été temporairement réduite. La microscopie time-lapse révèle que ces cellules se rétablissent normalement après ablation et ne changent pas de forme ou n’apparaissent pas endommagées (résultats non publiés, Volpe et coll.).

Pour soutenir la spécificité de la destruction de l’INMC, des ablations ont été réalisées chez les larves d’ET20 et de Tg (neuroD:tdTomato) dans lesquelles le nerf latéral de la lignée (qui ne coule que des microns sous les cellules interuromast) est étiqueté avec de la protéine fluorescente rouge. Les ablations de plusieurs cellules qui ont créé d’importantes lacunes dans la chaîne INMC ont eu peu ou pas d’effet sur le nerf latéral de la ligne basée sur la fluorescence rouge (figure 3). La flexibilité de la technique pour ablating les cellules superficiellement localisées a été démontrée par la destruction sélective des cellules sensorielles individuelles de cheveux dans les neuromasts de la ligne latérale. En utilisant essentiellement le même protocole décrit ci-dessus (sections 7 et 8), les cellules cils simples des larves transgéniques de Tg (myo6b:βactin-GFP) ont été détruites sans dommages apparents aux cellules adjacentes (figure 4). Les cellules cils abérées n’ont pas récupéré la fluorescence après microscopie time-lapse, et leurs noyaux étaient sensiblement granulaires et difformes après exposition au laser (Figure 4B). À l’semblable aux ablations de l’INMC, des macrophages apparents ont souvent été recrutés sur le site d’exposition au laser (résultats non publiés, Volpe et coll.).

Après ablation laser et capture d’image post-ablation, la taille des écarts a été mesurée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image librement disponible. L’outil de mesure a démontré des tailles d’écart allant de quelques microns à 100 microns, selon la largeur des INMC individuels et le nombre de cellules choisies pour l’ablation (figure 5). La microscopie Timelapse a été utilisée pour enregistrer les comportements de l’INMC pendant la régénération. Dans 50 essais, 15 lacunes (30 %) ont été fermés par régénération dans un délai de 24 h. Dans la plupart des cas, les INMC qui ont pu récupérer l’ont fait dans les premières heures suivant l’imagerie. La récupération a été définie comme le point de temps auquel les projections des cellules voisines sont entrées en contact, ce qui s’est produit 16 h après ablation pour un écart d’environ 40 μm (Film 1). Les piles Z ont été soigneusement examinées pour s’assurer que le contact cellule-cellule s’est produit dans un seul plan Z, évitant ainsi d’éventuels artefacts en raison de projections z. L’analyse de régression logistique a révélé que la probabilité de fermeture des écarts était corrélée avec la taille de l’écart (p = 0,0453), les écarts plus faibles étant plus susceptibles de guérir. Un écart de 55,5 μm a donné une probabilité de fermeture de 50 %(figure 5).

Dans 70 % des cas, les INMC n’ont pas été en mesure de combler complètement l’écart créé par l’ablation. Cependant, même dans ces cas, nous avons pu surveiller la formation de longues projections à partir d’INMC voisins, qui ressemblent à certains égards à l’extension des cônes de croissance neuronale (Film 2). Ainsi, ces expériences peuvent également fournir un aperçu des comportements des INMC après les dommages.

Figure 1 : Ablation sélective des cellules interuromast par irradiation au laser. (A) Les cellules interneuromast entre les neuromasts primIL3 et primIL4 ont été choisies pour l’ablation. Ces cellules présentent une forme caractéristique de fuseau avec des projections allongées chevauchant les corps cellulaires adjacents. (B) L’imagerie pré-ablation a permis d’identifier les corps cellulaires qui pourraient être ablated pour produire un écart. (C) La formation image post-ablation confirme l’ablation réussie comme indiqué par l’absence des corps cellulaires dans la région d’écart. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : L’imagerie post-ablation démontre la mort cellulaire en réponse à l’exposition au laser dans les cellules interuromast étiquetées GFP. L’imagerie photomultiplier de lumière transmise (T-PMT) indique la présence d’une cellule nécrotique avec un aspect granulaire (encerclé) aussi bien que le recrutement des cellules irrégulièrement formées qui sont probablement des macrophages (*). La fusion des canaux GFP et T-PMT confirme que la mort cellulaire et l’activité des macrophages se sont produites sur le site de l’ablation. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Spécificité de l’ablation interneuromast. (A) Cellules interuromast pré-ablation étiquetées GFP (vertes) et tdTomato-étiquetées nerf latéral de ligne (rouge) dans un Tg double-transgénique (ET20 ; NeuroD:tdTomato) larve. Des corps cellulaires à proximité du nerf latéral de ligne ont été visés pour l’ablation. (B) La formation image de poteau-ablation démontre l’ablation des corps ciblés de cellules avec un nerf latéral intact de ligne. Barres d’échelle = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Ablation des cellules capillaires sensorielles à l’aide d’une microscopie confoccale. (A) L’imagerie par pré-ablation a permis d’identifier une cellule capiculaire sensorielle étiquetée GFP (*) ciblée pour l’ablation chez le poisson zèbre tg (ET20) double transgénique; myo6b:βactin-GFP). L’imagerie par tube photomultiplier de lumière transmise (T-PMT) révèle la morphologie normale des cellules capillées, avec une section transversale ronde. (B) L’imagerie post-ablation confirme l’ablation réussie de la cellule capiculaire ciblée. Une image T-PMT indique une irrégularité dans la forme des cellules capillaires et une granularité accrue après l’exposition au laser, suggérant la mort cellulaire plutôt que la photobleaching. Barres d’échelle = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : La régression logistique modèle la probabilité de fermeture des écarts en fonction de la largeur de l’écart (en μm). Une note de 0 représente une fermeture complète de l’écart, alors qu’une note de 1 représente une fermeture incomplète de l’écart. Les résultats indiquent que l’effet de la largeur des écarts sur la capacité des cellules interuromast à combler les lacunes respectives est statistiquement significatif (p = 0,0453, n = 24 au total; n = 12 lacunes fermées, n = 12 lacunes incomplètement comblées). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Film 1 : Microscopie time-lapse démontrant la fermeture de l’écart (~40 μm) après 16 h. Des images ont été capturées toutes les 15 minutes, et une projection z d’intensité maximale a été faite pour tous les points de temps. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Film 2 : Microscopie time-lapse d’un écart INMC qui ne s’est pas resserri. Les projections allongées et ramifiées des INMC restantes sont affichées. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Le protocole décrit une méthode polyvalente pour l’ablation des cellules laser qui peut être effectuée sur n’importe quel microscope confocal équipé d’un laser presque ultraviolet (longueur d’onde de 405 nm). Ce protocole traite des limitations des méthodes précédemment employées telles que l’électroablation (qui cause des dommages plus^{répandus 11)}et l’ablation uv-laser pulsée (qui exige l’équipement spécialisé^{additionnel 12).} L’imagerie confocale avant et après l’ablation fournit une rétroaction rapide sur le succès de l’expérience. La microscopie de time-lapse suivante offre un essai simple pour la régénération dans un type de cellule critique pour le développement sensoriel de système.

Il est d’une importance vitale de pré-dépistage pour le poisson zèbre transgénique qui expriment fortement GFP chez les neuromasts et les INMC. Les larves avec la fluorescence lumineuse et approximativement même l’espacement des neuromasts primI-dérivés sont des candidats idéaux pour l’ablation de laser. Même chez ces poissons, il y a parfois des INMC plus faible qui peuvent d’abord échapper à la détection. Ces cellules peuvent rester derrière après ablation au laser, empêchant la formation d’un véritable écart entre les INMC. Le gain numérique doit être ajusté pour révéler ces cellules plus gradées lors de l’imagerie pré-ablation de telle sorte qu’elles puissent également être ciblées avec le laser de 405 nm (étape 8.2).

De même, le ciblage laser parfois ne détruira pas entièrement une cellule; au contraire, il va blanchir la fluorescence, ce qui entraîne un échec à créer un véritable écart. Ces cellules augmenteront généralement en fluorescence pendant la microscopie timelapse. L’ajustement de l’étape d’imagerie post-ablation ainsi que l’imagerie T-PMT (figure 2) aident à s’assurer que toutes les cellules ciblées ont été effectivement enlevées. Il nécessite fréquemment deux ou trois ablations cellulaires individuelles pour produire une lacune dans la chaîne INMC. La mort cellulaire peut être détectée par des saignements ou une apparence granulaire dans les cellules ciblées; bien que cela puisse nécessiter une brève période d’attente après le ciblage laser (et dans certains cas, des figures apoptotiques ou nécrotiques apparentes sont observées peu de temps après).

Une limitation de cette procédure est qu’elle peut nécessiter plusieurs essais expérimentaux avant que les conditions laser soient optimisées et que la régénération de l’INMC soit réussie. La puissance laser et le temps de vie total du laser peuvent chacun nécessiter un léger ajustement pour différents échantillons. Il a été constaté qu’une application laser excessive peut nuire à la capacité de la ligne latérale de se réparer. Ceci inclut les deux 1) surexposition des cellules individuelles à l’irradiation de laser, causant vraisemblablement des dommages additionnels aux tissus environnants, aussi bien que 2) l’ablation de trop de cellules dans la chaîne, menant à un plus grand écart. Les utilisateurs doivent atteindre un équilibre entre les cellules suffisamment irradiantes pour assurer leur destruction et ne pas surexposer les cellules, ce qui peut ralentir ou empêcher la régénération. Avec les paramètres appropriés, il a été constaté que les INMC peuvent être enlevés sans dommages visibles au nerf postérieur de la ligne latérale, ce qui indique que les dommages collatéraux sont minimisés avec ce protocole contrairement à l’électroablation¹¹. Dans aucun cas de nouveaux neuromasts ne se sont formés dans l’écart observé, vraisemblablement parce que le nerf latéral de ligne reste intact et les cellules gliales sous-jacentes restent et empêchent la prolifération des INMC^6,7,8,11.

Il est démontré que cette méthode d’ablation au laser confocal peut également être appliquée à d’autres types de cellules, en particulier chez ceux qui se trouvent superficiellement dans l’animal, y compris les cellules capillaires sensorielles (figure 4). Un protocole semblable peut être employé pour ablater des cellules de peau pour examiner la réparation de blessure ou les neurones pour des études axonales de régénération, comme^{précédemment décrit 13.} On s’attend à ce que cette technique devienne un ajout utile au répertoire expérimental des laboratoires qui possèdent un microscope confocal, mais aucun autre équipement spécialisé pour l’ablation au laser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well PTFE Printed Slides	Electron Microscopy Sciences	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricaine in reverse osmosis water
1X E3 + 600 µM Tricaine			Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media
1X E3 media			Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L)
60 X E3 media	All components purchased from Sigma-Aldrich		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water
Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence	Olympus
LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers	Carl Zeiss Microscopy, LLC		A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40
FIJI/ImageJ Image processing software	Multiple contributors		Downloadable at https://fiji.sc/
Dissecting needle modified into hair knife	Fisher Scientific	19010	An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle
Microsoft Excel software	Microsoft Corp.		Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel
Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm petri dish, 20 mm glass window
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Low Gelling Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Downloadable at https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereo microscope	Motic
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC