Summary
레이저 절제는 생물학적 시스템의 재생을 연구하는 데 널리 적용되는 기술입니다. 제시된 프로토콜은 제브라피시 측면에서 신경마비 세포를 재생시키는 레이저 절제 및 후속 시간 경과 화상 진찰을 위한 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 사용을 설명합니다.
Abstract
모발 세포는 청력의 감각을 중재하는 메카노 감각 세포입니다. 이 세포는 인간에 있는 손상 후에 재생하지 않습니다, 그러나 그(것)들은 제브라피시와 같은 비 포유류 척추동물에서 자연적으로 보충됩니다. 제브라피시 측삭 시스템은 감각적인 모발 세포 재생을 특성화하는 데 유용한 모델입니다. 측면 선은 신경 마비 세포 (INMC)의 문자열에 의해 함께 연결되는 신경 종에게 불린 머리 세포 포함 기관으로 이루어져 있습니다. INMC는 발달 도중 새로운 신경종염을 초래하는 선조 세포로 작동합니다. INMC는 세포 사멸에 의해 생성된 측면 선 시스템의 간격을 복구할 수 있습니다. INMC에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 기존의 레이저 스캐닝 공초점 현미경 및 트랜스제닉 어류를 이용한 선택적 INMC 절제를 위한 방법이 여기에 설명되어 있다. 그런 다음 시간 경과 현미경 검사법은 INMC 재생을 모니터링하고 갭 클로저 속도를 결정하는 데 사용됩니다. 이는 고성능 펄스 자외선 레이저와 같은 특수 장비가 필요하지 않은 세포 절제에 대한 접근 가능한 프로토콜을 나타냅니다. 절제 프로토콜은 많은 사용자가 이미 사용할 수있는 도구 세트를 사용하여 추가 셀 유형의 절제에 유용 할 수 있으므로 더 넓은 관심사를 제공 할 수 있습니다. 이 기술은 다른 조건및 다른 유전 배경에서 INMC 재생의 특성화를 가능하게 할 것입니다, 감각 전구 세포 재생의 이해를 발전시킬 것이다.
Introduction
대부분의 진보적 인 청력 손실의 핵심은 감각 모발 세포의 파괴, 이는 뇌에 의해 감지 신경 충진으로 외음 청각 자극을 변환. 달팽이관 머리 세포 죽음은 성인 포유동물이 손상 다음이 세포를 재생하는 기능이 부족하기 때문에 영구적 인 청력 손실을 일으킵니다. 반대로, 얼룩말물고기와 같은 비 포유류 척추동물은 음향 외상 또는 이토독성 모욕으로 잃어버린 모발 세포를 재생할 수 있습니다. 제브라피쉬 메카노감각 측면라인은 모발 세포재생1,2,3을연구하는 데 사용할 수 있는 간단하고 쉽게 조작된 기관 시스템이다.
측면 선은 신경종 세포 (INMC)로 알려진 길쭉한 세포의 문자열에 의해 개발 하는 동안 연결 하는 neuromasts 라는 작은 감각 패치로 구성 됩니다. 새로운 모발 세포 함유 장기를 초래하는 명백한 줄기 세포로서의 증식 능력을 감안할 때, INMC의 행동은 지역 사회에 큰 관심을 가지고4,5. INMC에 관한 연구의 대부분은 측면 라인 신경 주위를 감싸는 가까운 슈완 세포에 의해 그들의 확산의 억제를 특징으로하고있다, Wnt / β 카테닌 신호의 억제제를 통해 가능성이. 6,7,8. 새로운 신경종으로 INMC 증식 및 분화의 규정이 잘 설명되어 있는 동안, 절제 후에 INMC 재성장을 지배하는 기계장치는 해명되지 않았습니다. 이 프로토콜은 개별 INMC를 비난하고 후속 재생 동작을 분석하는 수단으로 작동합니다.
모발 세포를 파괴하기 위한 다양한 방법, 세포 지원, 및 전체 신경종술사, 복구 모니터링을 위한 방법론이 발표되었습니다. 화학 절제는 모발 세포에 적합하지만 CuSO4와 같은 독성 화학 물질의 투여량은 다른 측면 세포 유형9를제거하기 위해 현저하게 증가해야합니다. 형광 현미경 검사의 밑에 전기제는 재생을 공부하기 위하여 INMC를 파괴하는 효과적이고 간단한 수단이기 때문에, 좁게 표적으로 하기 어렵고, 따라서, 중요한 부수적인 손상을 생성하기 위하여 확률이 높습니다. 결과적으로 INMC 별동작(10,11)의측면을 마스크할 수 있습니다. 레이저 절제 프로토콜이 사용되었지만 평균 실험실 또는 이미징 시설(즉, 고성능 펄스 UV 레이저12)에반드시 존재하지 않는 특수 장비의 사용이 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 일반적인 405 nm 레이저가 장착된 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 수행될 수 있으며, 일반적으로 이미징 DAPI 및 기타 블루 형광에 사용됩니다. 이 방법의 장점은 공초점 이미징은 추가 레이저 제어 시스템을 참여하거나 펄스 레이저가 장착 된 다른 현미경으로 전송하지 않고 세포 손상 직전과 후에 수행 될 수 있다는 것입니다.
유사한 방법은 얼룩말 척수(13)에서포만 신경을 위해 설명되었습니다. 그러나 이전 메서드에는 셀 절제를 위한 FRAP 모듈이 필요하며, 이 프로토콜에는 요구 사항이 없습니다. 더욱이, 상이한 세포 유형의 뚜렷한 특성(즉, 간형의 밝기, 신체 내 깊이 및 세포 형상)을 감안할 때, 사용되는 세포 유형에 따라 상당한 변형이 필요할 가능성이 높습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 동일한 방법을 사용하여 감각 모발 세포 절제의 데모에 의해 지원되는 바와 같이 더 많은 피상적 인 세포에 효과적일 가능성이 높습니다. 또한 앞서 언급한 연구의 특징이 아닌 절제 후 INMC 회수율을 평가하기 위한 재생 분석이 설명되어 있습니다.
여기에 상세한 레이저 기반 세포 절제 프로토콜은 레이저 조건, 절제 후 이미징 및 시간 경과 현미경 검사법의 최적화를 통해 INMC의 재생 능력을 캡처합니다. 이러한 요소들은 INMC 재성장과 격차 해소를 전체적으로 종합적으로 묘사하기 위해 함께 모입니다. 이 프로토콜은 INMC를 파괴하는 데 사용되지만 셀룰러 절제에 대한 신뢰할 수 있고 효과적인 평가가 필요한 다른 작업에 적용될 수 있습니다. 그것은 또한 접근 가능한 기술, 그것은 405 nm 레이저장착 하는 모든 공초점 현미경에 실시 될 수 있기 때문에.
Protocol
모든 동물 작업은 프로토콜 2018-1에 따라 Pace 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 제브라피쉬 애벌레 의 준비
- 실험을 수행하기 3-5일 전에 짝짓기를 설치하여, 레이저 절제에 장착될 때 유충은 2일 후 수정(dpf)에서 4dpf로 될 것이다.
참고: Et(krt4:EGFP)sqEt20(ET20으로 약어) 인핸서 트랩 라인( 중뇌근 세포가 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)으로 명확하게 표지되어 상대적으로 쉬운 세포 식별 및절제(11,14)를허용한다. 레이저 절제 특이성 및 유연성의 확인을 위해, ET20 물고기는 Tg (neuroD:tdTomato)물고기로 사육되며, 측면 라인 신경은 적색 형광 단백질 또는 Tg (myo6b: βactin-GFP)로 표지되어 GFP15,16으로감각 모발 세포를 라벨로 지정합니다. - 배아 수집 후 다음 날, 0.0001% 메틸렌 블루를 함유하는 E3 배지에서 28.5°C에서 배아를 마취하고 탈산할 준비가 될 때까지 배아를 배양한다.
2. 낮은 겔화 아가로즈 및 트리카인 솔루션의 준비
- 250mL 글래스 에를렌마이어 플라스크에 1x E3 배지 48mL, 15mM 트리카인 스톡 솔루션 2mL, 저용아가로즈 0.5g을 추가한다.
- 30s의 높은 에 용액을 전자 레인지와 소용돌이 (열 보호 장갑 착용) 아가로즈를 용해. 아가로즈가 완전히 용해 될 때까지 30 의 가열 주기를 반복합니다.
- 사용 준비가 될 때까지 42 °C로 가열 된 인큐베이터에 아가로즈를 저장합니다.
3. 제브라피쉬 애벌레의 마취
- 50mL 원원형 튜브에, 혼합600 μM의 최종 농도에 1x E3 배지 및 1mL의 1x E3 배지 및 1mL의 24mL를 추가합니다.
- 600 μM 트리카인을 함유한 8mL의 E3가 있는 평평한 바닥 세포 배양 판의 6개의 우물 중 하나를 적재합니다.
- 변속 파이펫을 사용하여 제브라피시 유충을 74 μm 메쉬 바닥 이송 삽입체로 이동합니다.
- 메쉬 바닥 인서트를 E3 + 트리카인 용액을 포함하는 6웰 플레이트의 우물에 전달합니다. 애벌레가 최소 3분 동안 또는 완전히 마취될 때까지 우물에 남아 있게 하십시오. 삽입을 눌러 마취를 테스트합니다. 애벌레는 탭에 대한 응답으로 놀랍고 수영해서는 안됩니다.
4. 마취 된 얼룩말 물고기 애벌레의 형광 검사
- 피펫 1 마취 유충에 잘 12 잘 소수성 코팅 슬라이드에 스크리닝. 슬라이드의 각 웰에 형성된 반월 상연의 곡률이 최소화되어 스크리닝 시 광학 왜곡을 줄입니다. 이것은 애벌레를 배치 한 후 각 우물에서 소량의 E3를 제거하여 수행 할 수 있습니다.
- 직립 현미경 (수은 아크 램프, 금속 할라이드 램프 또는 LED 광원 및 적절한 필터 큐브 장착)에 대한 10 배 목표하에서, 측면 라인 시스템의 신경 종 및 신경 종 세포에서 eGFP를 표현하는 애벌레를위한 화면.
- 더 강한 발현을 가진 애벌레를 선택하여 더 밝은 eGFP의 결과로, 이는 아마도 트랜스진에 대한 동질이다.
참고: ET20 라인에서, eGFP는 각 신경종세포를 둘러싼 맨틀 세포의 고리뿐만 아니라 이 기관을 연결하는 중신경종 세포의 좁은 스트립에서 발현된다. 더 강한 eGFP 발현(밝은 형광)은 보다 효과적인 절제에 기여합니다. - 절제의 특이성을 검사하려면 ET20과 Tg (neuroD:tdTomato) 전유전자를 모두 갖춘 이중 형질전환 애벌레를 사용하십시오. Tg(neuroD:tdTomato) 캐리어를 검사하는 경우 RFP 필터 큐브세트를 사용하여 후반 측삭 신경절을 나타내는 귀에 밝은 빨간색 패치를 식별합니다.
- 측면 선 신경종에서 모발 세포를 축출하려면 각 신경종의 중심에 GFP 국소화를 위한 Tg(myo6b:βactin-GFP) 형질전환선 및 화면을 사용한다.
- 더 강한 발현을 가진 애벌레를 선택하여 더 밝은 eGFP의 결과로, 이는 아마도 트랜스진에 대한 동질이다.
- 신경마스트의 고정관념 간격으로 애벌레를 선택합니다. 신경종자 사이의 간격에 있는 다름은 발달 도중 이상한 신경종 증착을 나타낼 수 있습니다, 측면 선 primordium17에결함이 있는 철새 행동 또는 세포 증식을 건의합니다. 이러한 결함은 절제 후 INMC의 마이그레이션 또는 재생 동작에 영향을 줄 수 있습니다.
참고: 간격에 있는 일반적인 결점은 첫번째 이주 프리모듐 (prim1L1)에 의해 증착된 전방 가장 신경종 사이 비정상적으로 큰 거리를 포함하고 동일 원시 (prim1L2)에 의해 증착된 두 번째 신경종, 수시로 더 후방 신경종의 혼잡과 연관됩니다.
5. 레이저 절제 및 이미징을 위한 애벌레 장착
- 파이펫 3 - 4 마취 유충은 커버 슬립 바닥 접시 (14mm 번호 1.5 커버 슬립이있는 35mm 접시)의 중앙에있는 E3 / 트리카인 용액의 작은 방울로 넣습니다. 여분의 용액을 제거하여 애벌레가 작은 물방울에 남아 있도록 제거하여 포함할 만큼 충분히 큽립니다.
- 쌍안경 스테레오 현미경의 단계로 접시를 옮기고 줌과 초점을 조작하여 모든 애벌레가 시야에 있도록 합니다.
- 가열 된 인큐베이터에서 아가로 산 낮은 융점을 포함하는 Erlenmeyer 플라스크를 제거합니다. 전달 파이펫을 사용하여 아가로즈 용액을 커버 슬라이드에 전송하여 얇은 층을 생성합니다. 액체가 접시 의 바닥에 우물을 채울 때까지 여분의 아가로즈를 제거하여 애벌레를 흡입하지 않도록주의하십시오.
- 그들은 서로 정렬하고 왼쪽에 로스트랄지향되도록 헤어 나이프 또는 헤어 루프를 사용하여 아가로즈 솔루션에 애벌레를 신속하게 배열합니다.
- 유충을 머리 칼로 유리에 부드럽게 눌러 오른쪽 면으로 프로필에 놓여 있습니다. 3 dpf 보다 더 오래 된 애벌레는 그들의 팽창 된 수영 방광 때문에 떠 있는 경향이 있다, 그래서 그들은 반복적으로 아가로즈 젤 시작 될 때까지 유리에 대 한 아래로 누르면 해야 할 수 있습니다.
- 약 60s 후 아가로즈는 고화되기 시작하고 애벌레는 방향을 향할 수 없습니다. 커버 슬립의 아가로즈가 완전히 고화되도록 실온에서 약 5분간 기다립니다. 아가로즈가 고화되면, 1x 트리카인을 함유한 E3로 접시를 반쯤 채우기 위해 이송 파이펫을 사용한다.
6. 예비 목표 및 절제 전 이미징 찾기
- 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템에 전원을 켜고 통합 이미징 소프트웨어를 통해 초기화합니다. 63x 플랜-아포크로마트 오일 침지 목표(숫자 조리개 1.40) 또는 이와 유사한 것을 선택합니다. 침수 오일을 바르고 접시를 원형 스테이지 인서트에 고정하여 유충이 왼쪽으로 장밋빛 면을 향하도록 합니다.
- 밝은 필드 또는 차동 간섭 대조 조명에서, 화상 진찰을 위해 장착된 애벌레 중 하나를 선택합니다. 커버슬립에 가장 가까운 물고기 의 측면에 있는 피부가 페라이더름 세포의 지문 과 같은 패턴으로 인식될 수 있도록 초점 손잡이로 초점을 조정합니다.
- 일단 초점에, GFP 채널에 있는 상피 형광 조명으로 전환합니다. 수평 근세텀을 따라 GFP 식으로 후면 측선을 찾습니다. 형광 세포의 고리는 신경종 맨틀 세포를 나타내고, 세포의 길쭉한 가닥은 신경종 세포입니다.
- 보통 노른자에 그냥 등쪽위치 원시1 신경종으로 시작, 시각적으로 수평 심근을 따라 caudally 스캔 하는 무대 제어 조이스틱 또는 다른 단계 운동 컨트롤을 사용 하 여.
- primILIL3와 primIL4 (L3 및 L4) 신경종자(도 1A)사이지역에 도달할 때까지 신경 마비 세포의 문자열을 따르십시오.
참고: 다른 영역도 대상이 될 수 있지만 트렁크와 꼬리의 이 섹션은 커버 글래스에 가장 가깝기 때문에 절제에 가장 가깝습니다. - 여러 애벌레를 이미징하는 경우 첫 번째 단계 위치를 설정한 다음 적절한 확인란을 선택 해제하여 여러 단계 위치 옵션을 비활성화합니다.
- 6.4.1-6.4.2 단계를 반복합니다. 각 원하는 단계 위치(각 애벌레)에 대해.
- primILIL3와 primIL4 (L3 및 L4) 신경종자(도 1A)사이지역에 도달할 때까지 신경 마비 세포의 문자열을 따르십시오.
- L3-L4 영역의 세포 체가 확인된 후 획득 모드로 전환합니다.
- 488 nm 또는 491 nm 레이저를 사용하여 GFP 이미징 트랙을 활성화합니다.
- "이미징설정"드롭다운 메뉴에서 T-PMT 확인란을 활성화하여 활성화된 488nm 레이저 트랙에 전송된 라이트(송신광 광증튜브 또는 T-PMT) 채널을 추가합니다.
- 레이저 전력을 6%, 핀홀 크기를 1개의 에어리 유닛으로 설정하고, 화상 진찰 ET20 애벌레의 경우 디지털 게인을 750으로 설정합니다. 정확한 게인 및 레이저 파워는 커버 슬립에 얼마나 가깝고 형광의 밝기에 따라 주어진 애벌레에 따라 다를 수 있습니다. 세포 체가 포화되어 그렇지 않으면 희미한 투영및 필리포디아를 캡처하도록 게인을 조정합니다.
- 매개 변수를 1024 픽셀 x 1024 픽셀, 디지털 줌 0.7 (145.2 μm x 145.2 μm 이미지 크기)로 조정합니다. 이미지 품질을 향상시키기 위해 평균 을 2로 설정합니다.
- z 스택 상자를 확인하여 z 위치 드롭다운 메뉴를 가져옵니다. 빠른 스캐닝하는 동안, 신경 마비 세포가 초점에서 벗어날 때까지 집중하십시오. 첫 번째 슬라이스를 설정한 다음 신경 마비 세포가 다시 초점이 될 때까지 샘플을 통해 집중하십시오. 마지막 슬라이스를 설정합니다. 약 25 μm의 z 스택을 포함해야 합니다. 이미징 간격을 1μm로 설정합니다.
- 사전 절제 z스택(도 1B)을캡처하기 위해 실험을 시작합니다. 스테이지 위치가 추가된 경우 현재 위치만 이미지되도록 위치 옵션을 비활성화합니다. 파일을 캡처한 후 저장합니다.
7. 세포 체의 레이저 절제
- "모든도구 표시"를클릭합니다. 이 옵션은 인수 인터페이스의 맨 위에 있습니다.
- "이미징 설정"에 대한 드롭다운 메뉴를클릭합니다. "이미징설정"에서"" 클릭 " 클릭 "새 트랙 추가" (로 표현 "+").
- "이미징설정"에서" 염료"에 대한 드롭다운 메뉴를클릭합니다. DAPI를 염료로 선택합니다.
- "채널"의 드롭다운메뉴를 클릭하고 각 확인란을 클릭하여 다른 모든 트랙을 선택 해제합니다. DAPI 트랙만 선택되었는지 확인합니다.
- DAPI 트랙에서"레이저 설정"에대해 405를 클릭합니다. 레이저 전력을 75%로 늘립니다. DAPI 채널을 클릭 해제하여 레이저를 끄고 후보 셀 바디를 스캔하여 절제할 수 있습니다.
- 시야를 중심으로 신경마비세포의 본체를 사용하여 스캐닝 프레임을 20x-22x로 확대합니다. 확대/축소가 적용될 때 셀 본체를 중앙에 유지하기 위해 프레임 위치를 조정해야 할 수 있습니다. 셀 바디가 시야를 채우는 즉시 라이브 스캐닝을 중지합니다.
참고: 셀 바디는 전체 시야필드를 차지해야 합니다. 이 줌 수준에서 GFP는 빠르게 표백됩니다. 빠르게 작업하여 레이저 노출 시간을 최소화합니다. 관심 영역을 선택하지 않고 줌을 사용하여 작은 영역에 레이저 배전을 증가시면 됩니다. - 405 nm 레이저 셔터 박스를 확인하여 트랙을 활성화합니다. 레이저 전력을 75%로 조정합니다. 45s의 타이머를 설정합니다. 연속 스캐닝을 활성화하고 타이머를 시작합니다. 45s에서 즉시 스캔을 중지합니다.
8. 재생을 연구하기 위해 절제 후 이미징 및 시간 경과 현미경 검사법
- "채널"에대한 드롭다운 메뉴를 클릭합니다. 채널에서"DAPI"트랙을 클릭하여 절제 레이저를 비활성화합니다. "획득모드"의드롭다운 메뉴를 클릭합니다.
- 획득 모드에서는"확대/축소"를 클릭합니다.
- 슬라이더를 사용하거나 "0.7"을 입력하여 확대/축소를0.7로줄입니다.
- 성공적인 셀 절제를 보장하려면 게인을 900으로 늘리고 시야를 빠르게 스캔합니다.
참고: 표적 셀 또는 셀 내에서 GFP가 표시되지 않아야 합니다. 형광이 여전히 관찰되면 7.1-7.3 단계로 돌아갑니다. - 절제 전 이미징에 대해 설명된 것과 동일하거나 유사한 설정을 사용하여 절제 후이미지(그림 1C)를캡처하고 저장합니다. 이미지가 형광 세포의 잔재 또는 제거해야 하는 추가 세포 체를 드러내면 레이저 절제 단계를 반복하여 신경마비세포 의 문자열에 눈에 보이는 간격을 만듭니다.
- T-PMT 채널 이미지를 검사하여 셀룰러 손상을 추가로 확인합니다. 손상된 세포는 과립 된 외관을 가지며, 핵이 팽창하거나 모양이 불규칙해지는 경우가 빈번하게(도 2).
- 성공적인 셀 절제를 보장하려면 게인을 900으로 늘리고 시야를 빠르게 스캔합니다.
- 절제 전 이미지를 캡처하고, 필요에 따라 세포를 블라스팅하고, 각 개별 스테이지 위치에 대한 절제 후 이미지를 캡처한 후 이미지 캡처를 위한 스테이지 위치 및 시간 옵션을 모두 활성화하여 시간 경과 현미경 검사를 설정합니다. 시간 매개 변수를 24h 또는 다른 원하는 끝점 및 15분 간격으로 설정합니다. 실험을 시작하여 이미지를 획득하고 완료되면 결과 파일을 저장합니다(다음 날).
- 애벌레가 더 공부하거나 올려야 하는 경우, 미세 포셉을 사용하여 아가로즈에서 조심스럽게 제거한 다음 회복을 위해 트리카인없이 E3 배지로 옮겨넣습니다. 더 이상 사용하지 않을 경우 승인된 동물 프로토콜에 따라 안락사(얼음 목욕에 신속하고 지속적인 침수는 일반적인 방법)에 따라 안락사하고 기관에서 요구하는 대로 폐기하십시오.
9. 이미지 분석
- 선호하는 이미지 처리 소프트웨어(재료 표)에서 절제 후 z-스택 파일을엽니다. 각 채널이 별도의 보기 창에 있도록 채널을 분할합니다.
- GFP 채널 창에서 라인 도구를 사용하여 나머지 INMC의 팁 사이에 직선을 그립니다. 이는 z 스택을 통해 위아래로 스크롤하거나 선을 그리기 전에 최대 강도 투영을 수행하여 도움이 될 수 있습니다.
- "측정"도구를 사용하여 x-및 y-평면에서 INMC 끝 사이의 거리를 가져옵니다.
- 원래 z-스택의 z 슬라이스를 스크롤하여 z 평면의 INMC 사이의 거리를 확인합니다.
- 피타고라스 정리(2 + b 2 = c 2)를 사용하여 INMC끝 사이의 총 거리를 계산합니다. 저혈압은 총 거리(또는 갭 크기)입니다.
- 결과 거리 측정을 데이터 분석을 위해 스프레드시트 애플리케이션에 입력합니다.
- 공초점 시스템의 통합 이미징 소프트웨어 또는 자유롭게 사용할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 8.2-8.3 단계에서 수집된 시간 경과 현미경 파일을 검토합니다. 신경마비세포 사이의 간격이 세포 투영에 의해 채워진 시점을 확인한다. 이는 여러 z 슬라이스를 검사하여 모든 차원의 간격을 닫는 것을 확인할 수 있습니다.
- 간격 닫기 시간의 가장 정확한 측정을 얻으려면 절제 후 이미지 타임 스탬프(Finder 또는 파일 탐색기에서 볼 수 있음)를 제로 시점으로 사용합니다. 시간 경과 이미지 스택의 시작부터 시간을 측정하면 추가 스테이지 위치 등을 제거하면서 경과된 시간에 따라 종료 시간을 과소 평가할 수 있습니다.
- 원래 갭 크기(μm)를 완전한 간격 클로저에 필요한 시간 또는 분으로 분할하여 폐쇄 속도를 유도하십시오.
Representative Results
INMC를 축결하고 재생을 기록하기 위해 ET20 형질대사의 GFP 표현 제브라피시 애벌레를 5.4단계에 기재한 바와 같이 절제를 위해 2일 또는 3일 후에 장착되었다. 여러 물고기를 동시에 장착할 수 있으므로 단일 실험에서 여러 시간 경과를 캡처할 수 있습니다. primIL3와 primIL4 신경종 사이에 위치한 측면 선의 영역이 확인되었고, 사전 절제 이미지는 6.5-6.7 단계(도 1A, B)에설명된 바와 같이 캡처되었다.
3개의 세포 체는 약 40 μm의 INMC 문자열에 있는 간격을 만들기 위하여 레이저 절제를 표적으로 했습니다. 높은 이득과 후속 화상 진찰을 가진 절제 후 스캐닝은 인접한 INMC의 길쭉한 투영 사이 간격을 남겨 둔, ablated 지역에 남아 있는 세포 바디가 없다는 것을 확인했습니다(그림 1C). 세포 죽음은 절제 후에 T-PMT 채널을 검토해서 더 입증되었습니다. 손상된 및 죽어가는 세포는 부어지고 불규칙하게 형성된 핵뿐만 아니라 과립된외관(도 2,설명)으로 표시하였다. 경우에 따라, 시간 경과 화상 진찰은 또한 가능성이 대식세포이었다 큰 아모에이드 세포의 모집을 밝혔다(도 2,별표). ABLATED INMC를 둘러싼 어두운 지역은 지나치게 페라이더름 세포에서 표백을 나타냈다. 이 세포는 이러한 실험에서 레이저 조사에 의해 손상되거나 파괴되는 것으로 보이지 않았다; 오히려, 그들의 형광은 일시적으로 감소되었습니다. 시간 경과 현미경 검사법은 이러한 세포가 일반적으로 절제 후 회복되고 모양을 변경하거나 손상된 것처럼 보이지 않는다는 것을 밝힙니다 (공개되지 않은 결과, Volpe 외.).
INMC 파괴의 특이성을 지원하기 위해, 절제는 이중 형질 전환 ET20 및 Tg (neuroD:tdTomato) 애벌레에서 수행되었으며, 측면 라인 신경 (이는 신경 종세포 아래미크론을 실행)은 붉은 형광 단백질로 표시됩니다. INMC 문자열에서 상당한 간격을 생성한 여러 세포의 절제는 적색 형광(그림3)에기초한 측면 선 신경에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. 표면적으로 국소화된 세포를 타개하는 기술의 유연성은 측면 선의 신경종 내의 개별 감각 모발 세포의 선택적 파괴에 의해 입증되었다. 상기상술한 동일한 프로토콜(섹션 7 및 8)을 사용하여, 형질전환 Tg(myo6b:βactin-GFP) 애벌레내의 단일 모발 세포는 인접한 세포에 명백한 손상 없이 파괴되었다(도4). 압착 된 모발 세포는 시간 경과 현미경 검사법 후 형광을 회복하지 못했고, 그들의 핵은 레이저 노출 후 눈에 띄게 세분화되고 모양이 틀린(도 4B). INMC 절제와 유사하게, 명백한 대식세포는 레이저 노출 부위에 자주 모집되었다 (게시되지 않은 결과, Volpe 등).
레이저 절제 및 절제 후 이미지 캡처에 이어 자유롭게 사용할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 갭 크기를 측정했습니다. 측정 도구는 개별 INMC의 폭과 절제를 위해 선택된 세포 수에 따라 단지 몇 미크론에서 100 미크론까지 의 간격 크기를 시연하였다(그림5). 타임랩스 현미경 검사는 재생 중에 INMC 행동을 기록하기 위해 사용되었습니다. 50번의 시험에서 15개의 격차(30%) 24 시간 기간 내에 재생에 의해 폐쇄되었다. 대부분의 경우, 복구할 수 있었던 INMC는 이미징의 처음 몇 시간 이내에 그렇게 했습니다. 회수는 약 40 μm(Movie1)의간격에 대해 절제 후 16시간 후에 발생한 인접한 세포로부터의 투영이 접촉되는 시점으로 정의되었다. Z-스택은 z-프로젝션으로 인해 가능한 아티팩트를 피하면서 단일 z-평면 내에서 셀 셀 접촉이 발생했는지 확인하기 위해 신중하게 검사되었습니다. 물류 회귀 분석에 따르면 갭 클로징 확률이 갭 크기(p = 0.0453)와 상관관계가 있으며, 간격이 작아치유될 가능성이 더 높은 것으로 나타났습니다. 55.5 μm의 간격은 50 %의 폐쇄 확률을 산출(그림 5).
70%의 경우 INMC는 절제에 의해 생성된 격차를 완전히 해소할 수 없었습니다. 그러나, 이러한 경우에도 우리는 뉴런 성장 콘을 확장 어떤 면에서 유사 이웃 INMC에서 긴 프로젝션의 형성을 모니터링 할 수 있었다(영화 2). 따라서 이러한 실험은 손상 후 INMC의 행동에 대한 통찰력을 제공할 수도 있습니다.
그림 1: 레이저 조사에 의한 신경종 세포의 선택적 절제. (A)신경종기 프리틸3와 primIL4 사이의 신경종 세포가 절제를 위해 선택되었다. 이 세포는 인접한 세포 체체와 겹치는 길쭉한 투영을 가진 특징적인 스핀들 모양을 표시합니다. (B)사전 절제 화상 진찰은 간격을 생성하기 위하여 ablated될 수 있는 세포 바디를 확인했습니다. (C)절제 후 이미징은 갭 영역에서 세포 체의 부재에 의해 표시된 바와 같이 성공적인 절제를 확인합니다. 스케일 바 = 10 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: 절제 후 이미징은 GFP 표지 된 신경 종세포에서 레이저 노출에 대한 응답으로 세포 사멸을 보여줍니다. 전송된 광증 화상 진찰(T-PMT)은 과립된 외관(encircled)을 가진 괴사 세포의 존재뿐만 아니라 대식세포(*)일 가능성이 있는 불규칙한 모양의 세포의 모집을 나타낸다. GFP 및 T-PMT 채널의 병합은 세포 사멸 및 대식세포 활성이 절제 부위에서 발생했는지 확인합니다. 스케일 바 = 10 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: 간 신경마비절의 특이성. (A)이중 형질전환 Tg(ET20)에서 GFP-표지된 신경종 세포(green) 및 tdTomato 표지측측선 신경(red); 신경 D:tdTomato) 애벌레. 측면 선 신경에 가까운 세포 체는 절제에 대 한 대상으로 했다. (B)절제 후 이미징은 손상되지 않은 측면 라인 신경을 가진 표적 세포 체의 절제를 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 공초점 현미경 검사를 사용하여 감각 모발 세포의 절제. (A) 사전 절제 화상 진찰은 이중 형질전환 Tg (ET20; 근6b:βactin-GFP) 얼룩말fish에 있는 절제를 표적으로 한 GFP 표지된 감각 헤어 셀 (*)를 확인했습니다. 전송된 광증증관(T-PMT) 이미징은 둥근 단면을 가진 정상적인 모발 세포 형태를 공개합니다. (B)절제 후 이미징은 표적 모발 세포의 성공적인 절제를 확인합니다. T-PMT 이미지는 레이저 노출 후 모발 세포 모양의 불규칙성과 세분성이 증가하여 광표백보다는 세포 사멸을 시사합니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 물류 회귀는 갭 폭(μm)의 함수로서 갭 클로저 확률을 모델합니다. 점수 0은 완전한 간격 폐쇄를 나타내며 점수는 1이 불완전한 간격 클로저를 나타냅니다. 결과는 각 간격을 닫는 신경 질 세포의 능력에 갭 폭의 효과가 통계적으로 유의함을 나타냅니다 (p = 0.0453, n = 24 총; n = 12 닫힌 간격, n = 12 불완전 폐쇄 간격). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 16h 이후의 간격 폐쇄(~40 μm)를 보여주는 시간 경과 현미경 검사법. 이미지는 15분마다 캡처되었으며 모든 시간 포인트에 대해 최대 강도의 z 프로젝션이 만들어졌습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2: 닫히지 않은 INMC 갭의 시간 경과 현미경 검사. 나머지 INMC의 길쭉한 분기 투영이 표시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 거의 자외선 레이저 (405 nm 파장)가 장착 된 모든 공초점 현미경에서 수행 할 수있는 레이저 세포 절제를위한 다목적 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전자 절제 (더 광범위한 손상을 일으키는 원인이 되는11)와펄스 UV 레이저 절제 (추가 전문 장비12필요)와같은 이전에 사용 된 방법의 한계를 해결합니다. 절제 전후 공초점 이미징은 실험의 성공에 관한 신속한 피드백을 제공합니다. 후속 시간 경과 현미경 검사는 감각 시스템 개발에 중요한 세포 유형에서 재생을위한 간단한 분석법을 제공합니다.
신경마비와 INMC에서 GFP를 강력하게 표현하는 형질전환 제브라피시(transgenic zebrafish)를 위한 사전 스크린에 매우 중요합니다. 밝은 형광과 원시 에서 파생 된 신경 종의 약 간격을 가진 애벌레는 레이저 절제에 이상적인 후보입니다. 이 물고기에서도 처음에는 탈출 감지할 수 있는 조광기 INMC가 가끔 씩씩하게 사용됩니다. 이 세포는 레이저 절제 후에 뒤에 남아 있어 INMC 사이의 진정한 간격의 형성을 방지할 수 있습니다. 디지털 게인은 405 nm 레이저 (단계 8.2)로 표적으로 할 수 있도록 사전 절제 이미징 중에 이러한 조광 세포를 밝히기 위해 조정되어야합니다.
마찬가지로, 레이저 타겟팅은 때때로 완전히 세포를 파괴하지 않습니다; 오히려 형광을 표백하여 실제 간격을 만들지 못합니다. 이 세포는 일반적으로 타임랩스 현미경 검사 의 동안 형광에서 증가할 것입니다. T-PMT이미징(그림 2)과함께 절제 후 이미징 단계의 게인 조정은 표적화된 모든 세포가 효과적으로 제거되었는지 확인하는 데 도움이 됩니다. INMC 문자열의 간격을 생성하기 위해 두 개 또는 세 개의 개별 셀 절제가 자주 필요합니다. 세포 사멸은 표적 세포에서 출혈 또는 세분화된 외관에 의해 검출될 수 있다; 하지만, 이것은 레이저 타겟팅 후 짧은 대기 기간을 요구할 수 있습니다 (그리고 어떤 경우에는 명백한 apoptotic 또는 괴사 수치가 그 직후 관찰됩니다).
이 절차의 한계는 레이저 조건이 최적화되고 INMC 재생이 성공하기 전에 여러 실험 시험을 요구할 수 있다는 것입니다. 레이저 의 레이저 전력 및 총 거주 시간은 각각 다른 샘플에 대한 약간의 조정이 필요할 수 있습니다. 그것은 과도 한 레이저 응용 자체를 복구 하는 측면 라인의 능력을 손상시킬 수 있습니다 발견 되었습니다. 여기에는 레이저 조사에 개별 세포의 1) 과다 노출이 포함되어 주변 조직에 추가 손상을 입히고 2) 문자열에 너무 많은 세포의 절제가 발생하여 더 큰 간격이 있습니다. 사용자는 파괴를 보장하고 세포를 과도하게 노출시키지 않도록 충분히 조사하는 세포 사이의 균형을 이루어야 하며, 이는 재생을 늦추거나 예방할 수 있습니다. 적절한 설정으로, INMC는 후방 측선 신경에 가시손상 없이 제거할 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는전자(11)와달리 이 프로토콜로 부수적인 손상이 최소화되었음을 나타낸다. 어떤 경우에도 관찰 된 간격에서 형성되는 새로운 신경 종자, 아마도 측면 라인 신경신경세포가 그대로 남아 있고 INMC6,7,8,11의증식을 억제하기 때문이다.
이러한 공초점 레이저 절제 방법은 다른 세포 유형에도 적용될 수 있으며, 특히 감각 모발 세포를 포함한 동물 내에 위치하는세포(도 4)에서특히 피상적으로 위치할 수 있음을 입증하였다. 유사한 프로토콜은 이전에 설명된13와같이 축산 재생 연구를 위한 상처 수리 또는 뉴런을 검사하기 위해 피부 세포를 축하하는 데 사용될 수 있다. 이 기술은 공초점 현미경을 가지고 있지만 레이저 절제를위한 다른 전문 장비가없는 실험실의 실험 레퍼토리에 유용한 추가될 것으로 예상됩니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R15 교부금 1R15DC015352-01A1 및 Pace 대학 내부 자금 조달 소스에 의해 지원되었다. 물고기 선은 블라디미르 코르즈14,케이티 킨트15,16,그리고 A. 제임스 허드스페스의 실험실의 호의였다. 우리는 이러한 실험에 대한 피드백에 대한 A. 제임스 허드스페스와 그의 그룹의 구성원, 그리고 그들의 지원에 대한 페이스 대학의 동료에게 감사드립니다. RStudio의 물류 회귀 분석은 특히 동료 매튜 아이엘로-램멘스의 도움을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
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