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Developmental Biology

ज़ेब्राफ़िश इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप-आधारित लेजर एब्लेशन और पुनर्जनन परख

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/60966
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Pace University

Summary

लेजर एब्लेशन जैविक प्रणालियों में पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से लागू तकनीक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में लेजर एब्लेशन के लिए एक मानक लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग और बाद में जेब्राफिश पार्श्व रेखा में इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने के बाद के समय-चूक इमेजिंग का वर्णन किया गया है।

Abstract

बाल कोशिकाएं मशीनी कोशिकाएं हैं जो सुनने की भावना में मध्यस्थता करती हैं। ये कोशिकाएं मनुष्यों में नुकसान के बाद पुनर्जीवित नहीं होती हैं, लेकिन उन्हें स्वाभाविक रूप से गैर-स्तनधारी कशेरुकी जैसे जेब्राफिश में मंगाया जाता है। ज़ेब्राफ़िश पार्श्व रेखा प्रणाली संवेदी हेयर सेल पुनर्जनन की विशेषता के लिए एक उपयोगी मॉडल है। पार्श्व रेखा में हेयर सेल युक्त अंग शामिल होते हैं जिन्हें न्यूरोमास्ट कहा जाता है, जो इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं (INMCs) की एक स्ट्रिंग द्वारा एक साथ जुड़े हुए हैं। आईएनएमसी जनक कोशिकाओं के रूप में कार्य करते हैं जो विकास के दौरान नए न्यूरोमामेस्तों को जन्म देते हैं। आईएनएमसी सेल डेथ द्वारा बनाई गई पार्श्व लाइन प्रणाली में अंतराल की मरम्मत कर सकता है। एक विधि यहां एक पारंपरिक लेजर स्कैनिंग कंफोकल माइक्रोस्कोप और ट्रांसजेनिक मछली है कि INMCs में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त का उपयोग कर चयनात्मक INMC ablation के लिए वर्णित है । समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग आईएमसी पुनर्जनन की निगरानी और अंतर बंद करने की दर निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यह सेल एब्लेशन के लिए एक सुलभ प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, जैसे कि एक उच्च-स्तरीय स्पंदित पराबैंगनी लेजर। एब्लेशन प्रोटोकॉल व्यापक हितों की सेवा कर सकता है, क्योंकि यह अतिरिक्त सेल प्रकारों के एब्लेशन के लिए उपयोगी हो सकता है, एक उपकरण सेट को नियोजित करता है जो पहले से ही कई उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध है। इस तकनीक से विभिन्न परिस्थितियों में और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि से आईएनएससी पुनर्जनन के लक्षण वर्णन को और सक्षम बनाया जा सकेगा, जो संवेदी जनक कोशिका उत्थान की समझ को आगे बढ़ाएगा।

Introduction

सबसे प्रगतिशील सुनवाई हानि के मूल में संवेदी बाल कोशिकाओं का विनाश निहित है, जो मस्तिष्क द्वारा पता लगाने योग्य तंत्रिका आवेगों में बाह्य श्रवण उत्तेजनाओं को स्थानांतरित करता है। कॉकलियर हेयर सेल डेथ स्थायी सुनवाई हानि का कारण बनता है, क्योंकि वयस्क स्तनधारियों में नुकसान के बाद इन कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने की क्षमता की कमी होती है। इसके विपरीत, गैर-स्तनधारी कशेरुकी जैसे जेब्राफिश ध्वनिक आघात या ओटोटॉक्सिक अपमान से खोने वाली बाल कोशिकाओं को पुनर्जीवित कर सकते हैं। जेब्राफिश मैकेनोसेंसरी पार्श्व रेखा एक सरल और आसानी से छेड़छाड़ की गई अंग प्रणाली है जिसका उपयोग बाल कोशिका उत्थान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है1,2,3.

पार्श्व रेखा में न्यूरोमास्ट नामक छोटे संवेदी पैच होते हैं, जो विकास के दौरान विस्तारित कोशिकाओं की एक स्ट्रिंग द्वारा जुड़े होते हैं जिन्हें इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं (आईएनएमसी) के रूप में जाना जाता है। नए बाल कोशिका युक्त अंगों को जन्म देने वाली स्पष्ट स्टेम कोशिकाओं के रूप में उनकी प्रजनन क्षमता को देखते हुए, आईएनएमसी का व्यवहार समुदाय4, 5के लिए बहुत रुचिरखताहै । INMCs से संबंधित अनुसंधान के अधिकांश पास Schwann कोशिकाओं द्वारा उनके प्रसार के दमन की विशेषता है कि पार्श्व लाइन तंत्रिका के आसपास लपेटो, W β nt के एक अवरोधक के माध्यम से होने की संभावना/ 6,7,8. जबकि आईएमसी प्रसार और नए न्यूरोमाट्स में भेदभाव के नियमन को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, एब्लेशन के बाद आईएमसी पुनर्विकास को नियंत्रित करने वाले तंत्र को स्पष्ट नहीं किया गया है। यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत INMCs को एब्लेटिंग करने और उनके बाद के पुनर्योजी व्यवहार का विश्लेषण करने के साधन के रूप में कार्य करता है।

बाल कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए विभिन्न तरीकों, कोशिकाओं का समर्थन करने और पूरे न्यूरोमास्टा प्रकाशित किए गए हैं, साथ ही वसूली की निगरानी के तरीकों के साथ। रासायनिक एब्लेशन बालों की कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन अन्य पार्श्व रेखा सेल प्रकार9को हटाने के लिए CuSO4 जैसे जहरीले रसायनों की खुराक में काफी वृद्धि की जानी चाहिए। जबकि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत इलेक्ट्रोब्लेशन पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए आईएनएमसी को नष्ट करने का एक प्रभावी और सरल साधन है, इसलिए संकीर्ण रूप से लक्षित करना मुश्किल है और इसलिए, महत्वपूर्ण संपाश्र्वक क्षति का उत्पादन होने की संभावना है । नतीजतन, यह INMC-विशिष्ट व्यवहार10, 11के पहलुओं को मुखौटा कर सकताहै। लेजर एब्लेशन प्रोटोकॉल नियोजित किए गए हैं, लेकिन उन्हें औसत प्रयोगशाला या इमेजिंग सुविधा (यानी, उच्च स्तरीय स्पंदित यूवी लेजर12)में आवश्यक रूप से मौजूद विशेष उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित विधि को आम 405 एनएम लेजर के साथ आउटफिट किए गए किसी भी लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है, आमतौर पर इमेजिंग डीएपीआई और अन्य नीले फ्लोरोफोरस के लिए उपयोग किया जाता है। इस विधि का एक लाभ यह है कि कॉन्फोकल इमेजिंग किसी भी अतिरिक्त लेजर नियंत्रण प्रणाली को उलझाने या स्पंदित लेजर से लैस किसी अन्य माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित किए बिना सेल क्षति से तुरंत पहले और बाद में किया जा सकता है।

जेब्राफिश रीढ़ की हड्डी13में न्यूरॉन्स को एब्लेटिंग करने के लिए इसी तरह की विधि का वर्णन किया गया है । हालांकि, पिछली विधि को सेल एब्लेशन के लिए एफआरएपी मॉड्यूल की आवश्यकता होती है, जो इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, विभिन्न सेल प्रकारों (यानी, ट्रांसजीन फ्लोरेसेंस की चमक, शरीर के भीतर गहराई, और सेल आकार) के विशिष्ट गुणों को देखते हुए, यह संभावना है कि उपयोग किए गए सेल प्रकार के आधार पर महत्वपूर्ण संशोधनों की आवश्यकता होगी। यहां विस्तृत प्रोटोकॉल अधिक सतही कोशिकाओं के लिए प्रभावी होने की संभावना है, जैसा कि एक ही विधि का उपयोग करके संवेदी बाल कोशिका एब्लेशन के प्रदर्शन द्वारा समर्थित है। इसके अलावा उल्लिखित एक पुनर्जनन परख के लिए ablation के बाद INMC वसूली दरों का आकलन है, जो ऊपर उल्लिखित अध्ययन की एक विशेषता नहीं थी ।

यहां विस्तृत लेजर-आधारित सेल एब्लेशन प्रोटोकॉल लेजर स्थितियों, प्री-एंड पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग, और टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के अनुकूलन के माध्यम से आईएनएमसी की पुनर्योजी क्षमता को कैप्चर करता है। ये तत्व आईएमसी पुनर्विकास और गैप क्लोजर को अपनी संपूर्णता में व्यापक रूप से चित्रित करने के लिए एक साथ आते हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग यहां INMCs को नष्ट करने के लिए किया जाता है, इसे अन्य काम पर लागू किया जा सकता है जिसके लिए सेलुलर एब्लेशन के विश्वसनीय और प्रभावी मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। यह एक सुलभ तकनीक भी है, क्योंकि इसे 405 एनएम लेजर से लैस किसी भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर संचालित किया जा सकता है।

Protocol

सभी पशु कार्य को प्रोटोकाल 2018-1 के तहत पेस यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी ने मंजूरी दी थी।

1. जेब्राफिश लार्वा की तैयारी

  1. प्रयोग करने से 3-5 दिन पहले संभोग सेट करें, जैसे कि लार्वा लेजर एब्लेशन के लिए घुड़सवार होने पर उम्र में 2 दिन निषेचन (डीपीएफ) से 4 डीपीएफ होगा।
    नोट: एट (krt4:EGFP) sqEt20 (ET20 के रूप में संक्षिप्त) बढ़ाने वाला जाल लाइन, जिसमें इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से बढ़ाया हुआ हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) के साथ लेबल किया जाता है, अपेक्षाकृत आसान सेल पहचान और एब्लेशन11,14के लिए अनुमति देता है। लेजर एब्लेशन विशिष्टता और लचीलेपन की पुष्टि के लिए, ET20 मछली को टीजी (न्यूरोड: टीडीटोमाटो)मछली के साथ पैदा किया जाता है, जिसमें पार्श्व रेखा तंत्रिका को लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ या टीजी (मायो6बी: एएक्टिन-जीएफपी) के साथ लेबल किया जाता है ताकि जीएफपी15,16के साथ संवेदी बाल कोशिकाओं को लेबल किया जा सके।
  2. अगले दिन भ्रूण संग्रह के बाद, E3 माध्यम में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट भ्रूण 0.0001% मेथिलीन नीले रंग से युक्त जब तक एनेस्थेटाइज और माउंट करने के लिए तैयार है।

2. कम जेलिंग एगर उठे और ट्राइकेन समाधान की तैयारी

  1. 250 एमएल ग्लास एर्लेनमेयर फ्लास्क में, 1x E3 माध्यम के 48 एमएल, 15 एमएल ट्राइकेन स्टॉक समाधान के 2 एमएल और 0.5 ग्राम कम पिघलने वाले एगरेस जोड़ें।
  2. माइक्रोवेव 30 एस और भंवर (गर्मी सुरक्षात्मक दस्ताने पहने हुए) के लिए उच्च पर समाधान agarose भंग करने के लिए । 30 एस हीटिंग चक्र दोहराएं जब तक कि एगर उठी पूरी तरह से भंग न हो जाए।
  3. उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 42 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एक इनक्यूबेटर में एगर उठे स्टोर करें।

3. जेब्राफिश लार्वा का एनेस्थेटाइजेशन

  1. 50 एमएल शंकु नली में, 1x E3 माध्यम के 24 एमएल और ट्राइकेन स्टॉक समाधान (15 mm) के 1 एमएल को 600 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
  2. 600 माइक्रोन ट्राइकेन युक्त E3 के 8 एमएल के साथ एक फ्लैट तली सेल संस्कृति प्लेट के छह कुओं में से एक लोड करें।
  3. जेब्राफिश लार्वा को 74 माइक्रोन मेश-तली ट्रांसफर डालने में स्थानांतरित करने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें।
  4. जाल-तली डालने को ई 3 + ट्राइकेन समाधान युक्त छह-अच्छी प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें। लार्वा को न्यूनतम 3 मिनट के लिए या पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड होने तक कुएं में रहने दें। डालने को टैप करके संज्ञाहरण का परीक्षण करें। लार्वा को नल के जवाब में चौंकना और तैरना नहीं चाहिए।

4. एनेस्थेटाइज्ड जेब्राफिश लार्वा की फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग

  1. पिपेट एक एनेस्थेटाइज्ड लार्वा प्रति अच्छी तरह से स्क्रीनिंग के लिए 12 अच्छी तरह से हाइड्रोफोबिक-लेपित स्लाइड पर। सुनिश्चित करें कि स्क्रीनिंग करते समय ऑप्टिकल विरूपण को कम करने के लिए स्लाइड के प्रत्येक कुएं में गठित मेनिस्कस की न्यूनतम वक्रता है। लार्वा रखने के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से ई 3 की एक छोटी मात्रा को हटाकर ऐसा किया जा सकता है।
  2. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर 10x उद्देश्य के तहत (पारा आर्क लैंप, धातु-हलाइड लैंप, या एलईडी लाइट स्रोत और एक उपयुक्त फिल्टर क्यूब से लैस), लार्वा के लिए स्क्रीन जो लैटर लाइन सिस्टम के न्यूरोमास्ट और इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं में ईजीएफपी व्यक्त करता है।
    1. मजबूत अभिव्यक्ति के साथ लार्वा का चयन करें जिसके परिणामस्वरूप उज्जवल ईजीएफपी होता है, जो संभवतः ट्रांसजीन के लिए होमोज़ियस होते हैं।
      नोट: ET20 लाइन में, eGFP प्रत्येक न्यूरोमास्ट के आसपास के मेंटल कोशिकाओं की एक अंगूठी के साथ-साथ इन अंगों को जोड़ने वाली इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं की संकीर्ण पट्टी में व्यक्त किया जाता है। मजबूत eGFP अभिव्यक्ति (उज्जवल फ्लोरेसेंस) अधिक प्रभावी एब्लेशन में योगदान देता है।
    2. एब्लेशन की विशिष्टता की जांच करने के लिए, ईटी 20 और टीजी (न्यूरोड: टीडीटोमाटो) ट्रांसजीन दोनों के साथ डबल-ट्रांसजेनिक लार्वा का उपयोग करें। यदि टीजी (न्यूरोड: टीडीटोमाटो) वाहकों के लिए स्क्रीनिंग, आरएफपी फिल्टर घन सेट का उपयोग करें ताकि पीछे पार्श्व रेखा गैंगलियन का प्रतिनिधित्व करने वाले कान के ठीक पीछे एक उज्ज्वल लाल पैच की पहचान की जा सके।
    3. पार्श्व रेखा न्यूरोमास्ट में बाल कोशिकाओं को फिर से चालू करने के लिए, प्रत्येक न्यूरोमास्ट के केंद्र में जीएफपी स्थानीयकरण के लिए टीजी (मायो6बी:एएक्टिन-जीएफपी) ट्रांसजेनिक लाइन और स्क्रीन का उपयोग करें।
  3. न्यूरोमास्ट के टकसाली अंतर के साथ लार्वा का चयन करें। न्यूरोमास्ट के बीच अंतर विकास के दौरान असामान्य न्यूरोमास्ट बयान का संकेत दे सकता है, जो पार्श्व रेखा प्राइमोडियम17में दोषपूर्ण प्रवासी व्यवहार या कोशिका प्रसार का सुझाव दे सकता है। इस तरह के दोषों को भी Ablation के बाद INMCs के प्रवासी या पुनर्योजी व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं ।
    नोट: रिक्ति में सामान्य दोषों में पहले माइग्रेटिंग प्राइमोडियम (prim1L1) द्वारा जमा पूर्वकाल-सबसे न्यूरोमास्ट और एक ही प्राइमोडियम (prim1L2) द्वारा जमा दूसरा न्यूरोमास्ट के बीच असामान्य रूप से बड़ी दूरी शामिल है, जो अक्सर अधिक पोस्टर न्यूरोमास्ट की भीड़ से जुड़ा होता है।

5. लेजर एब्लेशन और इमेजिंग के लिए बढ़ते लार्वा

  1. एक कवर स्लिप-तली डिश (14 मिमी संख्या 1.5 कवरलिप के साथ 35 मिमी पकवान) के केंद्र में E3/ट्राइकेन समाधान की एक छोटी बूंद में पिपेट 3 - 4 एनेस्थेटाइज्ड लार्वा।) अतिरिक्त समाधान निकालें ताकि लार्वा एक छोटी बूंद में रहे, बस उन्हें रोकने के लिए काफी बड़ा हो।
  2. एक दूरबीन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के चरण में पकवान स्थानांतरित करें और ज़ूम और फोकस में हेरफेर करें ताकि सभी लार्वा देखने के क्षेत्र में हों।
  3. गर्म इनक्यूबेटर से कम पिघलने वाले बिंदु एगरसे युक्त एर्लेनमेयर फ्लास्क को हटा दें। एक पतली परत का उत्पादन करने के लिए कवर स्लाइड पर agarose समाधान हस्तांतरण करने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें। अतिरिक्त एगर उठे हुए ड्रा करें जब तक कि तरल डिश के तल पर अच्छी तरह से भरता है, किसी भी लार्वा को अपमानित न करने का ध्यान रखता है।
  4. बाल चाकू या हेयर लूप का उपयोग करके एगर उठे समाधान में लार्वा को जल्दी से व्यवस्थित करें ताकि वे एक दूसरे के साथ गठबंधन कर सकें और बाईं ओर रोस्ट्रल के साथ उन्मुख हों।
  5. धीरे-धीरे लार्वा को बाल चाकू के साथ ग्लास के खिलाफ दबाएं, जैसे कि वे अपने दाहिने पक्षों के साथ प्रोफ़ाइल में झूठ बोलते हैं। 3 डीपीएफ से पुराने लार्वा अपने फुलाया तैरने वाले मूत्राशय के कारण तैरते हैं, इसलिए उन्हें बार-बार ग्लास के खिलाफ दबाया जा सकता है जब तक कि एगर उठे जेल शुरू न हो जाएं।
  6. लगभग 60 एस के बाद एगरे ने जमना शुरू कर दिया है, और लार्वा को पुन: उन्मुख नहीं किया जा सकेगा। कवर स्लिप पर लगभग 5 मिनट की अनुमति पूरी तरह से जमना है। एक बार एगर उठे हुए जम जाने के बाद, 1x ट्राइकेन युक्त ई3 के साथ आधे रास्ते में डिश को भरने के लिए एक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।

6. संभावित लक्ष्यों और पूर्व-एब्लेशन इमेजिंग का पता लगाना

  1. लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर पावर चालू करें और एकीकृत इमेजिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से शुरू करें। 63x योजना-एपोक्रोमैट तेल विसर्जन उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर 1.40) या इसी तरह का चयन करें। विसर्जन तेल लागू करें और एक परिपत्र चरण में पकवान को सुरक्षित करें ताकि लार्वा अपने रोस्ट्रल पहलू के साथ बाईं ओर सामना करे।
  2. उज्ज्वल क्षेत्र या अंतर हस्तक्षेप विपरीत रोशनी के तहत, इमेजिंग के लिए घुड़सवार लार्वा में से एक का चयन करें। फोकस घुंडी के साथ ध्यान समायोजित करें कि कवरस्लिप के निकटतम मछली के किनारे की त्वचा ध्यान में है, पेरिडर्म कोशिकाओं के फिंगरप्रिंट जैसे पैटर्न से पहचानने योग्य है।
  3. एक बार फोकस में, जीएफपी चैनल में एपिफ्लोरोसेंट रोशनी पर स्विच करें। क्षैतिज मायोसेप्टम के साथ जीएफपी अभिव्यक्ति द्वारा पीछे की पार्श्व रेखा का पता लगाएं। फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के छल्ले न्यूरोमास्ट मेंटल कोशिकाओं को इंगित करते हैं, और कोशिकाओं की लम्बी किस्में इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाएं हैं।
  4. प्राइमिल1 न्यूरोमास्ट से शुरुआत, आमतौर पर जर्दी के लिए सिर्फ पृष्ठीय स्थित है, क्षैतिज मायोसेप्टम के साथ नेत्रहीन स्कैन कौडाली के लिए मंच नियंत्रण जॉयस्टिक या अन्य चरण आंदोलन नियंत्रण का उपयोग करें।
    1. प्राइमिल3 और प्राइमिल4 (एल 3 और एल 4) न्यूरोमास्ट(चित्रा 1 ए)के बीच के क्षेत्र तक पहुंचने तक इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं की स्ट्रिंग का पालन करें।
      नोट: अन्य क्षेत्रों को भी लक्षित किया जा सकता है, लेकिन ट्रंक और पूंछ का यह खंड कवर ग्लास के निकटतम होता है और इसलिए, सबसे अधिक एब्लेशन के लिए उत्तरदायी होता है।
    2. यदि कई लार्वा इमेजिंग करते हैं, तो पहले चरण की स्थिति निर्धारित करें, फिर उचित चेक बॉक्स का चयन करके कई चरण पदों के विकल्प को निष्क्रिय करें।
    3. 6.4.1-6.4.2 कदम दोहराएं। प्रत्येक वांछित चरण की स्थिति (प्रत्येक लार्वा) के लिए।
  5. L3-L4 क्षेत्र में सेल निकायों के बाद की पहचान की गई है, अधिग्रहण मोड में स्विच करें।
    1. 488 एनएम या 491 एनएम लेजर का उपयोग करके जीएफपी इमेजिंग ट्रैक को सक्रिय करें।
    2. इमेजिंग सेटअपड्रॉपडाउन मेन्यू के तहत टी-पीएमटी चेकबॉक्स को एक्टिवेट करके एक्टिवेटेड 488 एनएम लेजर ट्रैक पर ट्रांसमिटेड लाइट (ट्रांसमिटेड लाइट फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब या टी-पीएमटी) चैनल डालें।
    3. लेजर पावर को 6%, पिनहोल साइज को 1 एयरी यूनिट समकक्ष, और इमेजिंग ईटी 20 लार्वा के लिए 750 तक डिजिटल गेन सेट करें। सटीक लाभ और लेजर शक्ति किसी भी लार्वा के लिए भिन्न हो सकती है, इस पर निर्भर करती है कि कवर स्लिप के कितने करीब वे घुड़सवार हैं और फ्लोरेसेंस की चमक। लाभ को समायोजित करें जैसे सेल निकाय अन्यथा मंद अनुमानों और फिलिपोडिया को पकड़ने के लिए संतृप्त होते हैं।
    4. पैरामीटर्स को 1024 पिक्सल x 1024 पिक्सल के फ्रेम साइज, 0.7 के डिजिटल जूम (145.2 माइक्रोम x 145.2 माइक्रोन इमेज साइज) में एडजस्ट करें। छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए औसत 2 सेट करें।
  6. जेड-स्थिति ड्रॉपडाउन मेनू को लाने के लिए जेड-स्टैक बॉक्स की जांच करें। तेजी से स्कैनिंग करते समय, तब तक ध्यान केंद्रित करें जब तक कि इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाएं ध्यान से बाहर न हों। पहला टुकड़ा सेट करें, फिर नमूने के माध्यम से ध्यान केंद्रित करें जब तक कि इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाएं एक बार फिर ध्यान से बाहर न हों। अंतिम टुकड़ा सेट करें। सुनिश्चित करें कि यह लगभग 25 माइक्रोन का जेड-स्टैक शामिल है। इमेजिंग अंतराल को 1 माइक्रोन सेट करें।
  7. प्री-एब्लेशन जेड-स्टैक(चित्रा 1B)पर कब्जा करने के लिए प्रयोग शुरू करें। यदि चरण की स्थिति को जोड़ा गया है, तो पदों के विकल्प को निष्क्रिय करें ताकि केवल वर्तमान स्थिति को इमेज किया जा सके। एक बार कब्जा कर लिया है फाइल सहेजें।

7. सेल निकायों के लेजर एब्लेशन

  1. "सभी उपकरण दिखाएं"पर क्लिक करें। यह विकल्प अधिग्रहण इंटरफेस के शीर्ष पर स्थित है।
  2. "इमेजिंग सेट अप"के लिए ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें। "इमेजिंग सेट अप"में,"एक नया ट्रैक जोड़ें"("+"के रूप में प्रतिनिधित्व पर क्लिक करें।
  3. "इमेजिंग सेट अप"में,"डाई"के लिए ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें। डाई के रूप में DAPI का चयन करें।
  4. 'चैनल'के लिए ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें और अपने संबंधित चेकबॉक्स को अनक्लिक करके अन्य सभी पटरियों को डिविक करें। सुनिश्चित करें कि केवल डीएपीआई ट्रैक का चयन किया गया है।
  5. DAPI ट्रैक में,"लेजर सेटिंग"के लिए 405 पर क्लिक करें। लेजर पावर को 75% तक बढ़ाएं। एब्लेशन के लिए उम्मीदवार सेल निकायों के लिए स्कैनिंग करते समय लेजर को बंद करने के लिए DAPI चैनल को खोलना।
  6. देखने के क्षेत्र में केंद्रित एक इंटरन्यूरोमास्ट सेल के शरीर के साथ, स्कैनिंग फ्रेम में 20x-22x तक ज़ूम करें। फ्रेम की स्थिति को केंद्र में सेल शरीर रखने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि ज़ूम लागू होता है। जैसे ही सेल बॉडी को देखने के क्षेत्र में भरता है लाइव स्कैनिंग बंद करो।
    नोट: सेल शरीर को देखने के पूरे क्षेत्र पर कब्जा करना चाहिए । इस जूम स्तर पर जीएफपी तेजी से ब्लीच करेगा। जल्दी से काम करके लेजर एक्सपोजर समय को कम करें। एक छोटे से क्षेत्र में लेजर बिजली वितरण बढ़ाने के लिए ब्याज के एक क्षेत्र का चयन करने के बजाय ज़ूम का उपयोग करें।
  7. ट्रैक को सक्रिय करने के लिए 405 एनएम लेजर शटर बॉक्स की जांच करें। लेजर पावर को 75% तक एडजस्ट करें। 45 एस के लिए एक टाइमर सेट करें। निरंतर स्कैनिंग को सक्रिय करें और टाइमर शुरू करें। 45 एस पर तुरंत स्कैनिंग बंद करो।

8. पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग और समय-चूक माइक्रोस्कोपी

  1. 'चैनलों' के लिएड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें। चैनलों में, एब्लेशन लेजर को निष्क्रिय करने के लिए"DAPI"ट्रैक को खोलना। "अधिग्रहणमोड"के लिए ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें।
  2. अधिग्रहण मोड में,"ज़ूम"पर क्लिक करें।
  3. स्लाइडर का उपयोग करके या "0.7" में टाइप करके ज़ूम को0.7तक कम करें।
    1. सफल सेल एब्लेशन सुनिश्चित करने के लिए, लाभ को 900 तक बढ़ाएं और देखने के क्षेत्र को तेजी से स्कैन करें।
      नोट: लक्षित सेल या कोशिकाओं के भीतर कोई जीएफपी दिखाई नहीं देना चाहिए। यदि अभी भी फ्लोरेसेंस मनाया जाता है, तो चरण 7.1-7.3 पर लौटें।
    2. प्री-एब्लेशन इमेजिंग के लिए वर्णित समान या समान सेटिंग्स का उपयोग करके, पोस्ट-एब्लेशन इमेज(चित्रा 1C)को कैप्चर और सेव करें। यदि छवि फ्लोरोसेंट कोशिकाओं या अतिरिक्त सेल निकायों के अवशेषों का पता चलता है जिन्हें हटाने की आवश्यकता है, तो इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं की स्ट्रिंग में एक दृश्यमान अंतर बनाने के लिए लेजर एब्लेशन चरणों को दोहराएं।
    3. सेलुलर क्षति की पुष्टि करने के लिए टी-पीएमटी चैनल छवि का निरीक्षण करें। क्षतिग्रस्त कोशिकाओं में दानेदार उपस्थिति होगी, और अक्सर नाभिक प्रफुल्लित हो जाएगा या आकार में अनियमित हो जाएगा(चित्रा 2)।
  4. एक पूर्व-एब्लेशन छवि को कैप्चर करने के बाद, कोशिकाओं को आवश्यक रूप से एब्लेटिंग करें, और प्रत्येक व्यक्तिगत चरण की स्थिति के लिए पोस्ट-एब्लेशन छवि पर कब्जा करें, छवि कैप्चर के लिए चरण की स्थिति और समय विकल्प दोनों को सक्रिय करके समय-चूक माइक्रोस्कोपी स्थापित करें। समय मापदंडों को 24 घंटे या किसी अन्य वांछित एंडपॉइंट और 15 मिनट के अंतराल पर सेट करें। छवियों को प्राप्त करने और परिणामी फ़ाइल को पूरा होने पर (अगले दिन) सहेजने के लिए प्रयोग शुरू करें।
  5. यदि लार्वा का आगे अध्ययन किया जाना है या उठाया जाना है, तो उन्हें ठीक संदंश का उपयोग करके एगर उठे से सावधानी से हटा दें, फिर वसूली के लिए ट्राइकेन के बिना E3 माध्यम में स्थानांतरित करें। यदि उन्हें आगे उपयोग नहीं किया जाना है, तो अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल (बर्फ स्नान में तेजी से और निरंतर विसर्जन एक आम विधि है) के अनुसार इच्छामृत्यु और संस्था द्वारा आवश्यक के रूप में उनका निपटान करें।

9. छवि विश्लेषण

  1. पसंदीदा इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)में पोस्ट-एब्लेशन जेड-स्टैक फाइल खोलें। चैनलों को इस तरह विभाजित करें कि प्रत्येक चैनल एक अलग देखने के फलक में है।
  2. जीएफपी चैनल विंडो में, शेष आईएनएमसी के सुझावों के बीच एक सीधी रेखा खींचने के लिए लाइन टूल का उपयोग करें। यह जेड-स्टैक के माध्यम से ऊपर और नीचे स्क्रॉल करके या लाइन खींचने से पहले अधिकतम तीव्रता वाले प्रक्षेपण को निष्पादित करके सहायता प्राप्त हो सकती है।
  3. एक्स और वाई-प्लेन में INMC समाप्त होता है के बीच की दूरी प्राप्त करने के लिए"उपाय"उपकरण का उपयोग करें।
  4. जेड-प्लेन में INMCs के बीच की दूरी निर्धारित करने के लिए मूल जेड-स्टैक में जेड-स्लाइस के माध्यम से स्क्रॉल करें।
  5. पाइथागोरस प्रमेय (ए 2 +बी 2 = सी2) का उपयोग करके INMC के बीच की कुल दूरीकीगणना करें। हाइपोटेन्यूस कुल दूरी (या गैप आकार) है।
  6. डेटा विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट एप्लिकेशन में परिणामी दूरी माप दर्ज करें।
  7. कॉन्फोकल सिस्टम या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेज विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर एकीकृत इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके चरण 8.2-8.3 में एकत्र किए गए समय-चूक माइक्रोस्कोपी फ़ाइलों की समीक्षा करें। उस समय बिंदु की पहचान करें जिस पर इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं के बीच के अंतर को सेल अनुमानों द्वारा भरा गया था। यह सभी आयामों में अंतर के बंद होने की पुष्टि करने के लिए कई जेड-स्लाइस की परीक्षा से सहायता प्राप्त की जा सकती है।
  8. गैप क्लोजर के लिए समय का सबसे सटीक माप प्राप्त करने के लिए, शून्य समय बिंदु के रूप में पोस्ट-एब्लेशन इमेज टाइम स्टैंप (फाइंडर या फाइल एक्सप्लोरर में दिखाई) का उपयोग करें; समय-चूक छवि स्टैक की शुरुआत से समय को मापने के परिणामस्वरूप बंद होने के समय को कम करके आंका जा सकता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि अतिरिक्त चरण की स्थिति को कम करते हुए कितना समय बीता, आदि।
  9. केवल मूल अंतर आकार (μm) को पूर्ण अंतर बंद करने के लिए आवश्यक घंटों या मिनटों द्वारा विभाजित करके बंद करने की दर प्राप्त करें।

Representative Results

INMCs और रिकॉर्ड उत्थान को कम करने के लिए, ET20 ट्रांसजेनिक लाइन के जीएफपी-व्यक्त जेब्राफिश लार्वा की जांच की गई थी, जो चरण 5.4 में वर्णित एब्लेशन के लिए निषेचन के लिए 2 या 3-दिन बाद निषेचन पर रखा गया था। कई मछलियों को एक साथ रखा जा सकता है ताकि एक ही प्रयोग में कई बार चूक को पकड़ लिया जा सके। प्राइमिल3 और प्राइमिल 4 न्यूरोमाट्स के बीच स्थित पार्श्व रेखा के क्षेत्र की पहचान की गई थी, और पूर्व-एब्लेशन छवियों को चरण 6.5-6.7(चित्रा 1ए, बी)में वर्णित के रूप में कैप्चर किया गया था।

लगभग 40 माइक्रोन की आईएमसी स्ट्रिंग में अंतर पैदा करने के लिए लेजर एब्लेशन के लिए तीन सेल निकायों को लक्षित किया गया था। उच्च लाभ और बाद में इमेजिंग के साथ पोस्ट-एब्लेशन स्कैनिंग ने पुष्टि की कि कोई सेल निकाय एब्लेटेड क्षेत्र में नहीं रहा, जिससे आसन्न आईएनएमसी(चित्रा 1C)के लम्बी अनुमानों के बीच अंतर हो गया। एब्लेशन के बाद टी-पीएमटी चैनल की जांच कर सेल डेथ को आगे प्रदर्शित किया गया। क्षतिग्रस्त और मरने वाली कोशिकाओं को सूजन और अनियमित आकार के नाभिक के साथ-साथ एक दानेदार उपस्थिति(चित्र 2,उल्लिखित) द्वारा चिह्नित किया गया था। कुछ मामलों में, समय-चूक इमेजिंग ने बड़े एमोएबॉइड कोशिकाओं की भर्ती का भी खुलासा किया जो संभावित मैक्रोफेज(चित्रा 2,तारांकन) थे। एब्लेटेड आईएनएमसी के आसपास के अंधेरे क्षेत्रों ने ओवरलाइंग पेरिडर्म कोशिकाओं में फोटोब्लैचिंग का संकेत दिया। इन कोशिकाओं को इन प्रयोगों में लेजर विकिरण द्वारा क्षतिग्रस्त या नष्ट नहीं किया गया था; बल्कि, उनकी फ्लोरेसेंस अस्थायी रूप से कम हो गई थी। समय-चूक माइक्रोस्कोपी से पता चलता है कि ये कोशिकाएं सामान्य रूप से एब्लेशन के बाद ठीक हो जाती हैं और आकार नहीं बदलती हैं या अन्यथा क्षतिग्रस्त दिखाई देती हैं (अप्रकाशित परिणाम, वोल्प एट अल.)।

आईएनएससी विनाश की विशिष्टता का समर्थन करने के लिए, डबल-ट्रांसजेनिक ईटी 20 और टीजी (न्यूरोड: टीडीटोमाटो) लार्वा में एब्लेशन किए गए थे जिसमें पार्श्व रेखा तंत्रिका (जो इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं के नीचे सिर्फ माइक्रोन चलाती है) को लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किया जाता है। आईएमसी स्ट्रिंग में खासी अंतराल पैदा करने वाली कई कोशिकाओं के एब्लेशन का लाल फ्लोरेसेंस(चित्रा 3)के आधार पर पार्श्व रेखा तंत्रिका पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं पड़ा। सतही रूप से स्थानीयकृत कोशिकाओं को एब्लेम करने की तकनीक का लचीलापन पार्श्व रेखा के न्यूरोमाट्स के भीतर व्यक्तिगत संवेदी बाल कोशिकाओं के चयनात्मक विनाश द्वारा प्रदर्शित किया गया था। अनिवार्य रूप से ऊपर विस्तृत एक ही प्रोटोकॉल (सेक्शन 7 और 8) का उपयोग करना, ट्रांसजेनिक टीजी में एकल बाल कोशिकाओं (myo6b: एंक्टिन-जीएफपी) लार्वा को आसन्न कोशिकाओं(चित्रा 4)को स्पष्ट क्षति के बिना नष्ट कर दिया गया था। अवाकित बाल कोशिकाओं को समय चूक माइक्रोस्कोपी के बाद फ्लोरेसेंस ठीक नहीं किया, और उनके नाभिक काफ़ी दानेदार और लेजर जोखिम(चित्रा 4B)के बाद misshapen थे । आईएनएससी एब्लेशन के समान, लेजर एक्सपोजर साइट (अप्रकाशित परिणाम, वोल्प एट अल) में अक्सर स्पष्ट मैक्रोफेज की भर्ती की जाती थी।

लेजर एब्लेशन और पोस्ट-एब्लेशन इमेज कैप्चर के बाद, गैप आकार को स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया था। उपाय उपकरण ने व्यक्तिगत आईएनएमसी की चौड़ाई के आधार पर 100 माइक्रोन तक के कुछ माइक्रोन से लेकर अंतर आकारों का प्रदर्शन किया और एब्लेशन(चित्र 5)के लिए कितनी कोशिकाओं को चुना गया। टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी को पुनर्जनन के दौरान आईएमसी व्यवहार रिकॉर्ड करने के लिए नियोजित किया गया था। 50 परीक्षणों में, 15 अंतराल (30%) 24 घंटे की अवधि के भीतर पुनर्जनन से बंद कर दिया गया। ज्यादातर मामलों में, INMCs कि ठीक करने में सक्षम थे इमेजिंग के पहले कई घंटे के भीतर ऐसा किया । रिकवरी को उस समय बिंदु के रूप में परिभाषित किया गया था जिस पर पड़ोसी कोशिकाओं के अनुमान संपर्क में आए थे, जो लगभग 40 माइक्रोन (मूवी 1) के अंतराल के लिए एब्लेशन के बाद16घंटे हुए थे। जेड-स्टैक की सावधानीपूर्वक जांच की गई ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेल-सेल संपर्क एक जेड-प्लेन के भीतर हुआ, जेड-अनुमानों के कारण संभावित कलाकृतियों से बचा जाए । लॉजिस्टिक प्रतिगमन विश्लेषण से पता चला है कि गैप क्लोजर की संभावना गैप आकार (पी = 0.0453) के साथ सहसंबद्ध है, जिसमें छोटे अंतराल के ठीक होने की अधिक संभावना है। 55.5 माइक्रोन के अंतर से 50%(चित्रा 5)के बंद होने की संभावना उत्पी।

70% मामलों में, आईएनएमसी एब्लेशन द्वारा बनाए गए अंतर को पूरी तरह से बंद करने में असमर्थ थे। हालांकि, यहां तक कि इन मामलों में हम पड़ोसी INMCs, जो कुछ न्यूरोनल विकास शंकु(फिल्म 2)का विस्तार मामलों में सदृश से लंबे अनुमानों के गठन की निगरानी करने में सक्षम थे । इस प्रकार, ये प्रयोग क्षति के बाद INMCs के व्यवहार में भी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: लेजर विकिरण द्वारा इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं का चयनात्मक एब्लेशन। (A)न्यूरोमास्ट प्राइमिल3 और प्राइमिल4 के बीच इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं को एब्लेशन के लिए चुना गया । ये कोशिकाएं एक विशिष्ट धुरी आकार प्रदर्शित करती हैं जिसमें विस्तारित अनुमानों के साथ आसन्न कोशिका निकायों को ओवरलैपिंग किया जाता है। (ख)प्री-एब्लेशन इमेजिंग ने उन सेल निकायों की पहचान की जिन्हें गैप पैदा करने के लिए एब्लेटेड किया जा सकता है । (ग)पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग सफल एब्लेशन की पुष्टि करता है जैसा कि गैप क्षेत्र में सेल निकायों की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है । स्केल बार = 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग जीएफपी-लेबल इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं में लेजर एक्सपोजर के जवाब में सेल डेथ को दर्शाता है। प्रेषित प्रकाश फोटोमल्टीप्लायर इमेजिंग (टी-पीएमटी) एक दानेदार उपस्थिति (घेर) के साथ एक परिगलित कोशिका की उपस्थिति के साथ-साथ अनियमित आकार की कोशिकाओं की भर्ती को इंगित करता है जो संभावित मैक्रोफेज (*) हैं। जीएफपी और टी-पीएमटी चैनलों के विलय से इस बात की पुष्टि होती है कि सेल डेथ और मैक्रोफेज एक्टिविटी एब्लेशन की साइट पर हुई । स्केल बार = 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: इंटरन्यूरोमास्ट एब्लेशन की विशिष्टता। (A)डबल-ट्रांसजेनिक टीजी (ईटी20) में प्री-एब्लेशन जीएफपी-लेबल इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाएं (ग्रीन) और टीडीटोमाटो-लेबलेड लेटरल लाइन नर्व (लाल) न्यूरोड: टीडीटोमाटो) लार्वा। पार्श्व रेखा तंत्रिका के करीब निकटता में सेल निकायों को एब्लेशन के लिए लक्षित किया गया था। (ख)पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग एक अक्षुण्ण पार्श्व रेखा तंत्रिका के साथ लक्षित कोशिका निकायों के एब्लेशन को दर्शाता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संवेदी बाल कोशिकाओं का एब्लेशन। (क) प्री-एब्लेशन इमेजिंग ने डबल-ट्रांसजेनिक टीजी (ईटी20; मायो6बी:एएक्टिन-जीएफपी) जेब्राफिश में एब्लेशन के लिए लक्षित जीएफपी लेबल वाले संवेदी हेयर सेल (*) की पहचान की । प्रेषित प्रकाश फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (टी-पीएमटी) इमेजिंग सामान्य हेयर सेल आकृति विज्ञान का खुलासा करती है, जिसमें एक गोल क्रॉस-सेक्शन होता है। (ख)पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग लक्षित हेयर सेल के सफल एब्लेशन की पुष्टि करता है। एक टी-पीएमटी छवि बाल कोशिका के आकार में अनियमितता और लेजर एक्सपोजर के बाद दानेदारता में वृद्धि का संकेत देती है, जो फोटोब्लैचिंग के बजाय सेल डेथ का सुझाव देती है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: लॉजिस्टिक प्रतिगमन अंतर चौड़ाई (μm में) के एक समारोह के रूप में अंतर बंद होने की संभावना मॉडल । 0 का स्कोर पूर्ण अंतर बंद करने का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि 1 का स्कोर अधूरा अंतर बंद करने का प्रतिनिधित्व करता है । परिणाम इंगित करते हैं कि इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं की संबंधित अंतरालों को बंद करने की क्षमता पर अंतर चौड़ाई का प्रभाव सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण है (पी = 0.0453, एन = 24 कुल; एन = 12 बंद अंतराल, एन = 12 अपूर्ण रूप से बंद अंतराल)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 1: समय चूक माइक्रोस्कोपी 16 घंटे के बाद अंतर बंद (~ ४० μm) का प्रदर्शन । छवियों को हर 15 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था, और सभी टाइमपॉइंट्स के लिए अधिकतम तीव्रता वाले जेड-प्रक्षेपण किए गए थे। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 2: एक INMC अंतर है कि बंद नहीं किया की समय चूक माइक्रोस्कोपी । शेष आईएनएमसी के लम्बी और शाखाओं में बंटी अनुमानों को दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

प्रोटोकॉल लेजर सेल एब्लेशन के लिए एक बहुमुखी विधि का वर्णन करता है जिसे किसी भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है जो निकट-पराबैंगनी लेजर (405 एनएम तरंगदैर्ध्य) से लैस है। यह प्रोटोकॉल इलेक्ट्रोब्लेशन (जो अधिक व्यापक क्षति11का कारण बनता है) और स्पंदित यूवी-लेजर एब्लेशन (जिसके लिए अतिरिक्त विशेष उपकरण12की आवश्यकता होती है) जैसे पहले से नियोजित तरीकों की सीमाओं को संबोधित करता है। पूर्व और बाद में एब्लेशन कॉन्फोकल इमेजिंग प्रयोग की सफलता के बारे में तेजी से प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं। बाद के समय-चूक माइक्रोस्कोपी संवेदी प्रणाली के विकास के लिए महत्वपूर्ण कोशिका प्रकार में उत्थान के लिए एक सरल परख प्रदान करता है।

ट्रांसजेनिक जेब्राफिश के लिए प्रीस्क्रीन करना महत्वपूर्ण है जो न्यूरोमाट्स और आईएनएमसी में GFP को दृढ़ता से व्यक्त करता है। उज्ज्वल फ्लोरेसेंस के साथ लार्वा और प्राइमी-व्युत्पन्न न्यूरोमास्ट का लगभग भी अंतर लेजर एब्लेशन के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं। यहां तक कि इन मछलियों में, कभी-कभी आईएनएमसी को मंद किया जाता है जो पहले बच सकते हैं। इन कोशिकाओं को लेजर ablation के बाद पीछे रह सकते हैं, INMCs के बीच एक सच्चे अंतर के गठन को रोकने । डिजिटल लाभ को प्री-एब्लेशन इमेजिंग के दौरान इन मंद कोशिकाओं को प्रकट करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ताकि उन्हें 405 एनएम लेजर (चरण 8.2) के साथ भी लक्षित किया जा सके।

इसी तरह, लेजर लक्ष्यीकरण कभी-कभी पूरी तरह से एक कोशिका को नष्ट नहीं करेगा; बल्कि, यह फ्लोरेसेंस को ब्लीच करेगा, जिसके परिणामस्वरूप वास्तविक अंतर पैदा करने में विफलता होगी। इन कोशिकाओं को आम तौर पर टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी के दौरान फ्लोरेसेंस में वृद्धि होगी। टी-पीएमटी इमेजिंग(चित्रा 2)के साथ-साथ पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग स्टेप में लाभ समायोजन यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि लक्षित सभी कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से हटा दिया गया है। यह अक्सर दो या तीन व्यक्तिगत सेल ablations की आवश्यकता के लिए INMC स्ट्रिंग में एक अंतर का उत्पादन । सेल डेथ का पता ब्लीबिंग या लक्षित कोशिकाओं में दानेदार उपस्थिति से लगाया जा सकता है; हालांकि, लेजर लक्ष्यीकरण के बाद इसके लिए एक संक्षिप्त प्रतीक्षा अवधि की आवश्यकता हो सकती है (और कुछ मामलों में, स्पष्ट एपोप्टोटिक या परिगलित आंकड़े कुछ ही समय बाद देखे जाते हैं)।

इस प्रक्रिया की एक सीमा यह है कि लेजर स्थितियों को अनुकूलित करने से पहले कई प्रयोगात्मक परीक्षणों की आवश्यकता हो सकती है और आईएमसी पुनर्जनन सफल होता है। लेजर शक्ति और लेजर के कुल निवास समय प्रत्येक विभिन्न नमूनों के लिए मामूली समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। यह पाया गया है कि अत्यधिक लेजर आवेदन पार्श्व लाइन की क्षमता को खुद की मरम्मत करने के लिए ख़राब कर सकते हैं। इसमें लेजर विकिरण के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के ओवरएक्सपोजर दोनों शामिल हैं, संभवतः आसपास के ऊतकों को अतिरिक्त क्षति पहुंचाते हैं, साथ ही 2) स्ट्रिंग में बहुत अधिक कोशिकाओं का एब्लेशन, जिससे एक बड़ा अंतर होता है। उपयोगकर्ताओं को उनके विनाश को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त रूप से विकिरण कोशिकाओं के बीच संतुलन प्राप्त करना चाहिए और कोशिकाओं को अधिक उजागर नहीं करना चाहिए, जो पुनर्जनन को धीमा या रोक सकता है। उपयुक्त सेटिंग्स के साथ, यह पाया गया है कि आईएनएमसी को पीछे की पार्श्व रेखा तंत्रिका को दिखाई देने वाली क्षति के बिना हटाया जा सकता है, यह दर्शाता है किविद्युतीकरण 11के विपरीत इस प्रोटोकॉल के साथ संपाश्र्वक क्षति को कम किया जाता है। किसी भी समय नए न्यूरोमास्ते नहीं थे, संभवतः क्योंकि पार्श्व रेखा तंत्रिका बरकरार रहती है और अंतर्निहित ग्लियल कोशिकाएं बनी रहती हैं और आईएनएमसी6,7,8, 11के प्रसार कोरोकतीहैं।

यह प्रदर्शित किया जाता है कि कॉन्फोकल लेजर एब्लेशन की इस विधि को अन्य सेल प्रकारों पर भी लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से संवेदी बाल कोशिकाओं(चित्रा 4)सहित जानवर के भीतर स्थित उन सतही रूप से में। इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग त्वचा कोशिकाओं को अक्षीय पुनर्जनन अध्ययनों के लिए घाव की मरम्मत या न्यूरॉन्स की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पहले13वर्णित है। यह अनुमान है कि इस तकनीक प्रयोगशालाओं कि एक confocal माइक्रोस्कोप के अधिकारी लेकिन लेजर ablation के लिए कोई अंय विशेष उपकरण के अधिकारी के प्रयोगात्मक प्रदर्शनों की सूची के लिए एक उपयोगी इसके अतिरिक्त बन जाएगा ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NIH R15 अनुदान 1R15DC015352-01A1 और पेस विश्वविद्यालय आंतरिक वित्तपोषण स्रोतों द्वारा वित्त पोषित किया गया था । मछली लाइनें व्लादिमीर कोरज़14,केटी किंट15,16,और ए जेम्स हडस्पेथ की प्रयोगशाला के सौजन्य से थीं। हम इन प्रयोगों पर प्रतिक्रिया के लिए ए जेम्स हडस्पेथ और उनके समूह के सदस्यों और उनके समर्थन के लिए पेस यूनिवर्सिटी के सहयोगियों को धन्यवाद देना चाहते हैं । RStudio में रसद प्रतिगमन विश्लेषण विशेष रूप से हमारे सहयोगी मैथ्यू Aiello-Lammens द्वारा सहायता प्राप्त की थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well PTFE Printed Slides Electron Microscopy Sciences 63425-05
15 mM Tricaine stock solution Sigma E10521 15 mM Tricaine in reverse osmosis water
1X E3 + 600 µM Tricaine Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media
1X E3 media Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L)
60 X E3 media All components purchased from Sigma-Aldrich 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water
Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence Olympus
LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers Carl Zeiss Microscopy, LLC A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40
FIJI/ImageJ Image processing software Multiple contributors Downloadable at https://fiji.sc/
Dissecting needle modified into hair knife Fisher Scientific 19010 An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle
Microsoft Excel software Microsoft Corp. Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel
Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window Mattek Corporation P35G-1.5-20-C 35 mm petri dish, 20 mm glass window
Immersol 518F Immersion Oil Fisher Scientific 12-624-66A
Low Gelling Agarose Sigma Life Science A9414-256
Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert Millipore Sigma CLS3479-48EA
Rstudio software Rstudio PBC Downloadable at https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereo microscope Motic
Transfer Pipette Fisher Scientific 13-711-7M
ZEN software Carl Zeiss Microscopy, LLC

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References

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Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells. J. Vis. Exp. (159), e60966, doi:10.3791/60966 (2020).

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