Summary
Laser ablation er en bredt anvendelig teknologi til at studere regenerering i biologiske systemer. Den præsenterede protokol beskriver brugen af et standard laserscanningskonfokalt mikroskop til laserablation og efterfølgende time-lapse-billeddannelse af regenererende interneuromastceller i zebrafisk laterallinjen.
Abstract
Hårceller er mechanosensoriske celler, der mægle følelsen af hørelse. Disse celler regenereres ikke efter skader hos mennesker, men de genopfyldes naturligt i ikke-pattedyrhvirveldyr som zebrafisk. Zebrafisk lateral linje system er en nyttig model til at karakterisere sensorisk hår celle regenerering. Den laterale linje består af hårcelleholdige organer kaldet neuromaser, som er forbundet sammen af en række interneuromast celler (INMCs). INMCS fungerer som stamcelle, der giver anledning til nye neuromaste under udvikling. INMCs kan reparere huller i den laterale linje system skabt af celledød. En metode er beskrevet her for selektiv INMC ablation ved hjælp af en konventionel laser-scanning konfokal mikroskop og transgene fisk, der udtrykker grønne fluorescerende protein i INMCs. Time-lapse mikroskopi bruges derefter til at overvåge INMC regenerering og bestemme hastigheden af gap lukning. Dette repræsenterer en tilgængelig protokol for celle ablation, der ikke kræver specialiseret udstyr, såsom en høj-drevne pulserende ultraviolet laser. Ablation-protokollen kan tjene bredere interesser, da det kan være nyttigt for ablation af yderligere celletyper, der anvender et værktøjssæt, der allerede er tilgængeligt for mange brugere. Denne teknik vil yderligere gøre det muligt at karakterisering af INMC regenerering under forskellige forhold og fra forskellige genetiske baggrunde, som vil fremme forståelsen af sensorisk stamcelleregenerering.
Introduction
Kernen i de fleste progressive høretab ligger ødelæggelsen af sensoriske hårceller, som transduce ydre auditive stimuli i nerveimpulser, der kan påvises af hjernen. Cochlear hår celle død forårsager permanent høretab, som voksne pattedyr mangler evnen til at regenerere disse celler efter skader. Omvendt kan ikke-pattedyr hvirveldyr såsom zebrafisk regenerere hårceller tabt til akustisk traume ellerototoksisk fornærmelse. Zebrafisk mechanosensory lateral linje er en enkel og let manipuleret organsystem, der kan bruges til at studere hårcelle regenerering1,2,3.
Den laterale linje består af små sensoriske pletter kaldet neuromastrere, som er forbundet under udviklingen af en række aflange celler kendt som interneuromast celler (INMCs). I betragtning af deres proliferative kapacitet som tilsyneladende stamceller, der giver anledning til nye hår celle-holdige organer, adfærd INPC'er er af stor interesse for samfundet4,5. Meget af forskningen vedrørende INMP'er har karakteriseret undertrykkelse af deres spredning af nærliggende Schwann celler, wrap omkring lateral linje nerve, sandsynligvis gennem en hæmmer af Wnt / β-catenin signalering. 6,7,8. Mens reguleringen af INMC spredning og differentiering i nye neuromaser er blevet godt beskrevet, de mekanismer, der regulerer INMC genvækst efter ablation er ikke blevet belyst. Denne protokol fungerer som et middel til at ablande individuelle INMCs og analysere deres efterfølgende regenerative adfærd.
En række metoder til at ødelægge hårceller, støtte celler, og hele neuromaturer er blevet offentliggjort, sammen med metoder til overvågning opsving. Kemisk ablation fungerer godt for hårceller, men doser af giftige kemikalier såsom CuSO4 skal øges betydeligt for at fjerne andre laterale linje celletyper9. Mens elektroablation under fluorescensmikroskopi er et effektivt og enkelt middel til at ødelægge INM'er for at studere regenerering, er det vanskeligt at målrette snævert og vil derfor sandsynligvis medføre betydelige følgeskader. Som et resultat, dette kan maskere aspekter af INMC-specifikke adfærd10,11. Laser ablation protokoller har været ansat, men de kræver brug af specialiseret udstyr ikke nødvendigvis til stede i den gennemsnitlige laboratorium eller billeddannelse facilitet (dvs. høj-drevne pulserende UV lasere12). Den metode, der er beskrevet her, kan udføres med enhver laser-scanning konfokal mikroskop udstyret med den fælles 405 nm laser, der normalt anvendes til billeddannelse DAPI og andre blå fluorophores. En fordel ved denne metode er, at konfokale billeddannelse kan udføres umiddelbart før og efter celleskader uden at engagere yderligere laser kontrolsystemer eller overføre til et andet mikroskop udstyret med en pulserende laser.
En lignende metode er blevet beskrevet for ablandende neuroner i zebrafisk rygmarven13. Den tidligere metode kræver dog et FRAP-modul til celleablation, hvilket ikke er et krav til denne protokol. I betragtning af de forskellige celletypers forskellige egenskaber (dvs. lysstyrken af transgenefluorescens, dybden i kroppen og celleformen) er det desuden sandsynligt, at der vil være behov for væsentlige ændringer afhængigt af den anvendte celletype. Protokollen beskrevet her er mere tilbøjelige til at være effektiv til mere overfladiske celler, som understøttes af en demonstration af sensorisk hårcelle ablation ved hjælp af samme metode. Også skitseret er en regenerering assay at vurdere INMC inddrivelse satser efter ablation, som ikke var en funktion af ovennævnte undersøgelse.
Den laserbaserede celleablationsprotokol, der er beskrevet heri, registrerer INMC'ernes regenerative kapacitet gennem optimering af laserforhold, præ- og post-ablation-billeddannelse og tidsforfaldmikroskopi. Disse elementer kommer sammen for omfattende skildre INMC genvækst og gap lukning i sin helhed. Mens denne protokol bruges her til at ødelægge INMCs, det kan anvendes til andet arbejde, der kræver pålidelig og effektiv vurdering af cellulære ablation. Det er også en tilgængelig teknologi, da det kan udføres på enhver konfokal mikroskop udstyret med en 405 nm laser.
Protocol
Alt dyrearbejde blev godkendt af Pace University Institutional Animal Care and Use Committee i henhold til protokol 2018-1.
1. Fremstilling af zebrafisklarver
- Opsæt parring 3-5 dage før udførelsen af eksperimentet, således at larver vil være 2 dage efter befrugtning (dpf) til 4 dpf i alder, når monteret til laser ablation.
BEMÆRK: Et(krt4:EGFP)sqEt20 (forkortet ET20) forstærker fælde linje, hvor interneuromast celler er tydeligt mærket med forbedret grøn fluorescerende protein (eGFP), giver mulighed for relativt let celle identifikation og ablation11,14. For bekræftelse af laser ablation specificitet og fleksibilitet, ET20 fisk er opdrættet med Tg (neuroD: tdTomato)fisk, hvor den laterale linje nerve er mærket med rødt fluorescerende protein eller med Tg (myo6b:βactin-GFP) at mærke sensoriske hårceller med GFP15,16. - Efter embryonindsamling den følgende dag inkuberes embryoner ved 28,5 °C i E3-medium indeholdende 0,0001 % methylenblåt, indtil de er klar til at bedøve og montere.
2. Fremstilling af lav gelering agarose og tricain løsninger
- Til en 250 ml erlenmeyerkolbe i 250 ml glas tilsættes 48 ml 1x E3-medium, 2 ml 15 mM tricainlageropløsning og 0,5 g lavsmeltende agarose.
- Mikrobølgeovn opløsningen på høj for 30 s og hvirvle (iført varme-beskyttende handsker) til at opløse agarose. Gentag de 30 s opvarmningscyklusser, indtil agarose er helt opløst.
- Agarosen opbevares i en inkubator, der er opvarmet til 42 °C, indtil den er klar til brug.
3. Bedøvelse af zebrafisklarver
- Til et 50 ml konisk rør tilsættes 24 ml 1x E3-medium og 1 ml tricainbestandopløsning (15 mM) til en endelig koncentration på 600 μM. Swirl til blanding.
- Der indlæses en af de seks brønde i en cellekulturplade med en fladbundet cellekulturplade med 8 ml E3 indeholdende 600 μM tricain.
- Brug en overførselpipette til at flytte zebrafisklarver til et 74 μm mesh-bottomed transfer insert.
- Overfør den mesh-bottomed indsætte i brønden af seks-brøndpladen indeholder E3 + tricain opløsning. Lad larverne forblive i brønden i mindst 3 min eller indtil fuldt bedøvet. Test anæstesi ved at trykke på indsatsen. Larver bør ikke forskrække og svømme som reaktion på hanen.
4. Fluorescerende screening af bedøvede zebrafisklarver
- Pipette en bedøvet larve per godt på 12 godt hydrofobe-belagt dias til screening. Sørg for, at der er minimal krumning af menisken dannet i hver brønd af diaset for at reducere optisk forvrængning ved screening. Dette kan gøres ved at fjerne en lille mængde E3 fra hver brønd efter placering af larverne.
- Under en 10x mål på en opretstående mikroskop (udstyret med en kviksølv bue lampe, metal-halogenlys, eller LED lyskilde og en passende filter terning), skærm for larver, der udtrykker eGFP i neuromasts og interneuromast celler i lateral linje system.
- Vælg larver med stærkere udtryk resulterer i lysere eGFP, som formentlig er homozygot for transgenet.
BEMÆRK: I ET20-linjen udtrykkes eGFP i en ring af kappeceller omkring hver neuromast samt den smalle stribe interneuromastceller, der forbinder disse organer. Stærkere eGFP udtryk (lysere fluorescens) bidrager til en mere effektiv ablation. - For at undersøge ablationens specificitet anvendes dobbelttransgene larver med både ET20- og Tg(neuroD:tdTomato) transgene. Hvis screening for Tg (neuroD:tdTomato) luftfartsselskaber, skal du bruge RFP filterterningen indstillet til at identificere en lys rød patch bare posterior til øret, der repræsenterer den bageste laterale linje ganglion.
- At ablate hårceller i den laterale linje neuromaster, skal du bruge Tg (myo6b:βactin-GFP) transgene linje og skærm for GFP lokalisering i midten af hver neuromast.
- Vælg larver med stærkere udtryk resulterer i lysere eGFP, som formentlig er homozygot for transgenet.
- Vælg larver med stereotype afstand af neuromaster. Forskelle i afstanden mellem neuromasts kan indikere unormal neuromast deposition under udvikling, hvilket tyder på defekt migrationsadfærd eller celleproliferation i den laterale linje primordium17. Sådanne defekter kan også påvirke INFC'ernes vandrende eller regenerative adfærd efter ablation.
BEMÆRK: Almindelige fejl i afstanden omfatter en usædvanlig stor afstand mellem den forreste mest neuromast deponeret af den første migrerende primordium (prim1L1) og den anden neuromast deponeret af samme primordium (prim1L2), ofte forbundet med fortrængning af de mere bageste neuromasterer.
5. Montering larver til laser ablation og billeddannelse
- Pipette 3 - 4 bedøvet larver i en lille dråbe E3/tricainopløsning i midten af en dækselskål (35 mm skål med en 14 mm nummer 1,5 coverslip). Fjern overskydende opløsning, så larverne forbliver i en lille dråbe, lige stor nok til at indeholde dem.
- Overfør skålen til den fase af en kikkert stereomikroskop og manipulere zoom og fokus, så alle larver er i synsfeltet.
- Erlenmeyerkolben, der indeholder det lave smeltepunkt agarose fra den opvarmede inkubator, fjernes. Brug en overførselspipette til at overføre agaroseopløsning på dækslet for at producere et tyndt lag. Træk overskydende agarose, indtil væsken bare fylder brønden i bunden af skålen, og pas på ikke at aspirere nogen larver.
- Hurtigt arrangere larver i agarose opløsning ved hjælp af en hårkniv eller hår løkke, så de er på linje med hinanden og orienteret med rostral til venstre.
- Tryk forsigtigt larverne ned mod glasset med hårkniven, så de ligger i profil med højre side nedad. Larver ældre end 3 dpf tendens til at flyde på grund af deres oppustede svømme blærer, så de kan være nødvendigt at blive gentagne gange presset ned mod glasset, indtil agarose begynder at gel.
- Efter ca. 60 s vil agarose begynde at størkne, og larverne vil ikke være i stand til at blive omlægget. Der skal gå ca. 5 minutter ved stuetemperatur, før agarose på dækslet størknes. Når agarose er størknet, skal du bruge en overførselpipette til at fylde skålen halvvejs med E3 indeholdende 1x tricain.
6. Lokalisering af potentielle mål og præ-ablation imaging
- Tænd for strømmen til det konfokale mikroskopisystem til laserscanning, og initialiser gennem den integrerede billedbehandlingssoftware. Vælg målet 63x Plan-Apochromat olienedsænkningsmålet (numerisk blænde 1,40) eller lignende. Påfør nedsænkningsolie og fastgør skålen i en cirkulær fase indsætte således, at larverne ansigt med deres rostral aspekt til venstre.
- Vælg en af de monterede larver til billeddannelse under lysfelt eller differens interferenskontrastbelysning. Juster fokus med fokusknappen, således at huden på siden af fisken tættest på dækslet er i fokus, genkendeligt ved det fingeraftrykslignende mønster af peridermceller.
- Når du er i fokus, skal du skifte til epifluorescerende belysning i GFP-kanalen. Find den bageste laterale linje ved GFP udtryk langs den vandrette myoseptum. Ringe af fluorescerende celler angiver neuromast kappe celler, og aflange dele af celler er interneuromast celler.
- Begyndende med primIL1 neuromast, normalt placeret bare dorsale til æggeblomme, bruge scenen kontrol joystick eller andre fase bevægelse kontrol til visuelt scanne caudally langs vandret myoseptum.
- Følg strengen af interneuromastceller, indtil de når regionen mellem primIL3 og primIL4 (L3 og L4) neuromastrer (Figur 1A).
BEMÆRK: Andre regioner kan også målrettes, men denne del af stammen og halen har tendens til at være tættest på dækglasset og derfor mest modtagelige for ablation. - Hvis du afskryber flere larver, skal du angive placeringen af første fase og derefter deaktivere indstillingen for flere trinpositioner ved at fravælge det relevante afkrydsningsfelt.
- Gentag trin 6.4.1-6.4.2. for hver ønsket sceneposition (hver larver).
- Følg strengen af interneuromastceller, indtil de når regionen mellem primIL3 og primIL4 (L3 og L4) neuromastrer (Figur 1A).
- Når celleorganer i L3-L4-området er blevet identificeret, skal du skifte til anskaffelsestilstanden.
- Aktiver et GFP-billedspor ved hjælp af laseren på 488 nm eller 491 nm.
- Tilføj et transmitteret lys (transmitteret lysfotomultiplierrør eller T-PMT) kanal til det aktiverede 488 nm laserspor ved at aktivere T-PMT-afkrydsningsfeltet under rullemenuen "Imaging Setup".
- Indstil lasereffekten til 6 %, pinhole-størrelseen til 1 Airy-enhedsækvivalent og digital forstærkning til 750 til billeddannelse af ET20-larver. Præcis forstærkning og laser effekt kan variere for en given larver, afhængigt af hvor tæt på dækslet slip de er monteret og lysstyrken af fluorescens. Juster forstærkningen således, at celleorganer er mættet for at fange ellers dæmpede projektioner og filipodia.
- Juster parametrene til en rammestørrelse på 1024 pixel x 1024 pixel, digital zoom på 0,7 (145,2 μm x 145,2 μm billedstørrelse). Indstil gennemsnit til 2 for at forbedre billedkvaliteten.
- Markér z-stack-boksen for at få kortmenuen med z-positionen frem. Mens hurtig scanning, fokusere ud, indtil interneuromast celler er lige ude af fokus. Indstil det første udsnit, og fokuser derefter gennem prøven, indtil interneuromastcellerne igen er ude af fokus. Indstil det sidste udsnit. Sørg for, at den omfatter en z-stak på ca. 25 μm. Indstil billedintervallet til 1 μm.
- Start eksperiment for at fange en pre-ablation z-stack (Figur 1B). Hvis der er tilføjet scenepositioner, skal du deaktivere indstillingen positioner, så kun den aktuelle position afbildes. Gem filen, når den er hentet.
7. Laser ablation af celle organer
- Klik på "Vis alle værktøjer". Denne indstilling er placeret øverst i anskaffelsesgrænsefladen.
- Klik på rullemenuen for "Imaging Set Up". I "Imaging Set up", skal du klikke på "Tilføj et nyt spor" (repræsenteret som "+").
- I "Imaging Set Up", skal du klikke på rullemenuen for "Dye". Vælg DAPI som farvestof.
- Klik på rullemenuen for "Channels "og fravælg alle andre spor ved at fjerne klik på deres respektive afkrydsningsfelter. Sørg for, at kun DAPI-sporet er markeret.
- I DAPI-sporet skal du klikke på 405 for "Laserindstillingen". Forøg lasereffekten til 75 %. Unclick DAPI-kanalen for at slukke for laseren, mens du scanner for kandidatcellekroppe til ablation.
- Med kroppen af en interneuromast celle centreret i synsfeltet, zoom i scanningsrammen til 20x-22x. Det kan være nødvendigt at justere rammepositionen for at holde cellekroppen i midten, når zoomen anvendes. Stop livescanning, så snart cellekroppen udfylder synsfeltet.
BEMÆRK: Cellekroppen skal besætte hele synsfeltet. På dette zoomniveau bleger GFP hurtigt. Minimer lasereksponeringstiden ved at arbejde hurtigt. Brug zoom i stedet for at vælge et område af interesse for at øge laser magtfordeling over et lille område. - Kontroller 405 nm laserlukkerboksen for at aktivere sporet. Juster lasereffekten til 75 %. Indstil en timer til 45 s. Aktivér kontinuerlig scanning, og start timeren. Stop scanningen med det samme ved 45 s.
8. Post-ablation imaging og time-lapse mikroskopi til undersøgelse regenerering
- Klik på rullemenuen for "Kanaler". I kanaler skal du fjerne klik på "DAPI"-sporetfor at deaktivere ablationslaseren. Klik på rullemenuen for "Anskaffelsestilstand".
- Klik på " Zoom " ianskaffelsestilstand.
- Formindsk zoom til 0,7 enten ved hjælp af skyderen eller ved at skrive i "0,7 ."
- For at sikre vellykket celle ablation, øge gevinsten til 900 og hurtigt scanne synsfeltet.
BEMÆRK: Ingen GFP bør være synlig i den eller de målrettede celler. Hvis fluorescens stadig observeres, vende tilbage til trin 7.1-7.3. - Brug af de samme eller lignende indstillinger som dem, der er beskrevet for præ-ablation billeddannelse, fange og gemme en post-ablation billede (Figur 1C). Hvis billedet afslører rester af fluorescerende celler eller yderligere celleorganer, der skal fjernes, skal du gentage laserablationstrinnene for at skabe et synligt hul i strengen af interneuromastceller.
- Undersøg T-PMT-kanalbilledet for yderligere at bekræfte celleskader. Beskadigede celler vil have et granuleret udseende, og ofte vil kernerne svulme op eller blive uregelmæssige i form (Figur 2).
- For at sikre vellykket celle ablation, øge gevinsten til 900 og hurtigt scanne synsfeltet.
- Når du har optaget et forablationsbillede, ablating af cellerne efter behov og optagelse af et post-ablationbillede for hver enkelt sceneposition, skal du konfigurere tidsforstyrrende mikroskopi ved at aktivere både sceneposition og tidsindstillinger for billedoptagelse. Indstil tidsparametrene til 24 timer eller et andet ønsket slutpunkt og 15 min intervaller. Start eksperimentet for at hente billeder og gemme den resulterende fil, når den er færdig (den følgende dag).
- Hvis larver skal undersøges nærmere eller hæves, skal de forsigtigt fjernes fra agarosen ved hjælp af fine saftafgængestykker, hvorfra til E3-medium uden tricain til nyttiggørelse. Hvis de ikke skal anvendes yderligere, aflives i henhold til den godkendte dyreprotokol (hurtig og vedvarende nedsænkning i et isbad er en almindelig metode) og bortskaffe dem som krævet af institutionen.
9. Billedanalyse
- Åbn en post-ablation z-stack fil i den foretrukne billedbehandling software (Tabel over materialer). Opdel kanalerne, så hver kanal er i en separat visningsrude.
- I GFP-kanalvinduet skal du bruge stregværktøjet til at tegne en lige linje mellem spidsen af de resterende INPC'er. Dette kan hjælpes ved at rulle op og ned gennem z-stack eller ved at udføre en maksimal intensitet projektion før tegning af linjen.
- Brug værktøjet "Mål" til at opnå afstanden mellem INMC-enderne i x- og y-flyene.
- Rul gennem z-udsnit i den oprindelige z-stack for at bestemme afstanden mellem INME'er i z-planet.
- Den samlede afstand mellem INMC-enderne beregnes ved hjælp af den pythagoræiske sætning (en2 + b2 = c2). Hypotenus er den samlede afstand (eller mellemrumsstørrelse).
- Angiv den resulterende afstandsmåling i et regnearksprogram til dataanalyse.
- Gennemgå de tidsforskridte mikroskopifiler, der er indsamlet i trin 8.2-8.3, ved hjælp af enten den integrerede billedbehandlingssoftware på konfokale system eller frit tilgængelig billedanalysesoftware. Identificer det tidspunktspunkt, hvor afstanden mellem interneuromastceller blev udfyldt af celleprojektioner. Dette kan hjælpes ved undersøgelse af flere z-skiver for at bekræfte lukningen af hullet i alle dimensioner.
- Hvis du vil opnå den mest nøjagtige måling af tid til lukning af mellemrum, skal du bruge tidsstemplet efter ablation (synlig i Finder eller Stifinder) som nultidspunkt. måletid fra begyndelsen af time-lapse-billedstakken kan resultere i undervurdering af tid til lukning, afhængigt af hvor lang tid der er gået, mens yderligere scenepositioner osv.
- Aftænd afslutningshastigheden ved blot at dividere den oprindelige mellemrumsstørrelse (μm) med de timer eller minutter, der kræves for fuldstændig lukning af mellemrum.
Representative Results
For at ablate INMC'er og registrere regenerering blev screenet GFP-udtrykkelige zebrafisklarver af ET20-linjen monteret ved 2- eller 3-dages efterbefrugtning for ablation som beskrevet i trin 5.4. Flere fisk kan monteres samtidigt, så flere tidsforfald kan fanges i et enkelt eksperiment. Regionen af den laterale linje placeret mellem primIL3 og primIL4 neuromaser blev identificeret, og præ-ablation billeder blev taget som beskrevet i trin 6.5-6.7 (Figur 1A, B).
Tre cellekroppe blev målrettet mod laserablation for at skabe et hul i INMC-strengen på ca. 40 μm. Post-ablation scanning med høj gevinst og efterfølgende billeddannelse bekræftet, at ingen celle organer forblev i den ablated region, efterlader et hul mellem aflange fremskrivninger af de tilstødende INMCs (Figur 1C). Celledød blev yderligere påvist ved at undersøge T-PMT-kanalen efter ablation. Beskadigede og døende celler var præget af hævede og uregelmæssigt formede kerner samt et granuleret udseende (Figur 2, skitseret). I nogle tilfælde afslørede time-lapse imaging også rekruttering af store amøde celler, der sandsynligvis var makrofager ( Figur2,stjerne). Mørke områder omkring de ablated INMCs angivet photobleaching i overliggende periderm celler. Disse celler syntes ikke at være beskadiget eller ødelagt af laserbestråling i disse forsøg; snarere, deres fluorescens blev midlertidigt reduceret. Time-lapse mikroskopi afslører, at disse celler normalt inddrive efter ablation og ikke ændre form eller på anden måde synes beskadiget (ikke-offentliggjorte resultater, Volpe et al.).
For at understøtte specificiteten af INMC-ødelæggelse blev ablationer udført i dobbelttransgene ET20 og Tg(neuroD:tdTomato) larver, hvor den laterale linjenerven (som kun kører mikron under de interneuromastceller) er mærket med rødt fluorescerende protein. Ablationer af flere celler, der skabte betydelige huller i INMC-strengen, havde ringe eller ingen effekt på den laterale linjenerve baseret på rød fluorescens (Figur 3). Fleksibiliteten af teknikken til ablande overfladisk lokaliserede celler blev demonstreret ved selektiv ødelæggelse af individuelle sensoriske hårceller i neuromaser af sidelinjen. Ved hjælp af stort set den samme protokol, der er beskrevet ovenfor (afsnit 7 og 8), blev enkelthårsceller i transgene Tg(myo6b:βactin-GFP) larver destrueret uden synlige skader på tilstødende celler (Figur 4). De abladerede hårceller genoprettede ikke fluorescens efter tidsforskudt mikroskopi, og deres kerner var mærkbart granuleret og misdannet efter lasereksponering (Figur 4B). I lighed med INMC-ablationer blev der ofte rekrutteret tilsyneladende makrofager til lasereksponeringsstedet (ikke-offentliggjorte resultater, Volpe et al.).
Efter laser ablation og post-ablation billedoptagelse, hulstørrelse blev målt ved hjælp af frit tilgængelige billedanalyse software. Måleværktøjet demonstrerede mellemrumsstørrelser, der spænder fra nogle få mikron op til 100 mikron, afhængigt af bredden af de enkelte INMC'er, og hvor mange celler der blev valgt til ablation (figur 5). Timelapse mikroskopi blev ansat til at registrere INMC adfærd under regenerering. I 50 forsøg var der 15 huller (30 %) blev lukket ved regenerering inden for en periode på 24 timer. I de fleste tilfælde, INMC' er, der var i stand til at inddrive gjorde det inden for de første mange timer af billeddannelse. Recovery blev defineret som det tidspunkt, hvor fremskrivninger fra tilstødende celler kom i kontakt, som fandt sted 16 timer efter ablation for et hul på ca 40 μm (Movie 1). Z-stakke blev nøje undersøgt for at sikre, at celle-celle kontakt opstod inden for en enkelt z-plan, undgå mulige artefakter på grund af z-fremskrivninger. Logistisk regressionsanalyse viste, at sandsynligheden for hullukning korreleret med gap størrelse (p = 0,0453), med mindre huller er mere tilbøjelige til at helbrede. Et hul på 55,5 μm gav en lukkesandsynlighed på 50 % (figur 5).
I 70 % af tilfældene var INM'erne ikke i stand til helt at lukke det hul, der blev skabt af ablation. Men selv i disse tilfælde var vi i stand til at overvåge dannelsen af lange fremskrivninger fra tilstødende INC'er, som ligner i nogle henseender udvide neuronal vækst kegler (Movie 2). Således kan disse eksperimenter også give indsigt i adfærd INMCs efter skader.
Figur 1: Selektiv ablation af interneuromastceller ved laserbestråling. (A) Interneuromast celler mellem neuromaser primIL3 og primIL4 blev udvalgt til ablation. Disse celler viser en karakteristisk spindelform med aflange projektioner, der overlapper tilstødende celleorganer. (B)Præ-ablation billeddannelse identificeret celleorganer, der kunne ablated at producere et hul. c) Efter ablation bekræfter vellykket ablation som angivet ved fraværet af celleorganer i området omkring mellemrum. Skalabarer = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Post-ablation imaging viser celledød som reaktion på lasereksponering i GFP-mærkede interneuromastceller. Transmitteret lysfotomultiplier billeddannelse (T-PMT) angiver tilstedeværelsen af en nekrotisk celle med et granuleret udseende (omkranset) samt rekruttering af uregelmæssigt formede celler, der sandsynligvis er makrofager (*). Sammenlægning af GFP- og T-PMT-kanaler bekræfter, at celledøds- og makrofagaktivitet forekom på ablationsstedet. Skalabarer = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Særlige forhold i forbindelse med interneuromast-ablation. a) Præablation af GFP-mærkede interneuromastceller (grøn) og tdTomato-mærket lateral linjenerve (rød) i en dobbelttransgen Tg(ET20) NeuroD:tdTomato) larver. Celle organer i umiddelbar nærhed af den laterale linje nerve blev målrettet til ablation. (B) Post-ablation imaging viser ablation af målrettede celle organer med en intakt lateral linje nerve. Skalastænger = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ablation af sensoriske hårceller ved hjælp af konfokal mikroskopi. (A) Præ-ablation billeddannelse identificeret en GFP mærket sensorisk hårcelle (*) målrettet til ablation i dobbelt-transgene Tg (ET20; myo6b:βactin-GFP) zebrafisk. Transmitteret lys fotomultiplier rør (T-PMT) billeddannelse afslører normal hårcelle morfologi, med et rundt tværsnit. (B)Post-ablation imaging bekræfter vellykket ablation af den målrettede hårcelle. Et T-PMT-billede angiver uregelmæssigheder i hårcelleform og øget granularitet efter lasereksponering, hvilket tyder på celledød i stedet for fotobleaching. Skalastænger = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Logistisk regression modeller sandsynligheden for hul lukning som en funktion af hulbredden (i μm). En score på 0 repræsenterer fuldstændig hul lukning, mens en score på 1 repræsenterer ufuldstændige hul lukning. Resultaterne viser, at virkningen af mellemrumbredden på interneuromastcellers evne til at lukke de respektive huller er statistisk signifikant (p = 0,0453, n = 24 i alt; n = 12 lukkede huller, n = 12 ufuldstændigt lukkede huller). Klik her for at se en større version af dette tal.
Film 1: Time-lapse mikroskopi demonstrere hul lukning (~ 40 μm) efter 16 h. Billeder blev taget hver 15 min, og en maksimal intensitet z-projektion blev foretaget for alle timepoints. Klik her for at downloade denne video.
Film 2: Time-lapse mikroskopi af en INMC hul, der ikke lukker. De aflange og forgrenede fremskrivninger af de resterende INME'er vises. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Protokollen beskriver en alsidig metode til lasercelle ablation, der kan udføres på enhver konfokal mikroskop udstyret med en næsten ultraviolet laser (405 nm bølgelængde). Denne protokol omhandler begrænsninger af tidligere anvendte metoder såsom elektroablation (som forårsager mere udbredteskader 11) og pulserende UV-laser ablation (som kræver yderligere specialiseret udstyr12). Præ- og post-ablation konfokal billeddannelse giver hurtig feedback om succes eksperimentet. Efterfølgende time-lapse mikroskopi tilbyder en simpel analyse for regenerering i en celletype kritisk for sensorisk systemudvikling.
Det er af afgørende betydning at prescreen for transgene zebrafisk, der udtrykker GFP stærkt i neuromaker og INMCs. Larver med lys fluorescens og ca. jævn afstand af primI-afledte neuromaser er ideelle kandidater til laser ablation. Selv i disse fisk, der er lejlighedsvis lysdæmper INMCs, der kan ved første undslippe afsløring. Disse celler kan forblive bagud efter laser ablation, forhindrer dannelsen af en sand kløft mellem INMCs. Den digitale gevinst bør justeres for at afsløre disse lysdæmperceller under præ-ablation billeddannelse, således at de også kan målrettes med 405 nm laser (trin 8.2).
Tilsvarende laser målretning undertiden vil ikke helt ødelægge en celle; Snarere vil det blege fluorescens, hvilket resulterer i en manglende skabe en reel kløft. Disse celler vil generelt stige i fluorescens under timelaps mikroskopi. Forstærkningsjustering i post-ablation-billeddannelsestrinnet sammen med T-PMT-billeddannelse (Figur 2) er med til at sikre, at alle de celler, der er målrettet, er blevet fjernet effektivt. Det kræver ofte to eller tre individuelle celleablationer for at producere et mellemrum i INMC-strengen. Celledød kan påvises ved blebbing eller et granuleret udseende i de målrettede celler; selv om dette kan kræve en kort ventetid efter laser målretning (og i nogle tilfælde, tilsyneladende apoptotiske eller nekrotiske tal er observeret kort tid derefter).
En begrænsning af denne procedure er, at det kan kræve flere eksperimentelle forsøg, før laser betingelser er optimeret og INMC regenerering er en succes. Lasereffekten og den samlede dvæletid for laseren kan hver især kræve en mindre justering for forskellige prøver. Det er blevet konstateret, at overdreven laser ansøgning kan forringe muligheden for den laterale linje til at reparere sig selv. Dette omfatter både 1) overeksponering af individuelle celler til laserbestråling, formentlig forårsager yderligere skade på omgivende væv, samt 2) ablation af for mange celler i strengen, hvilket fører til et større hul. Brugerne skal opnå en balance mellem tilstrækkeligt bestrålende celler til at sikre deres ødelæggelse og ikke overeksponere cellerne, hvilket kan bremse eller forhindre regenerering. Med de relevante indstillinger, er det blevet konstateret, at INMCs kan fjernes uden synlige skader på den bageste laterale linje nerve, hvilket indikerer, at følgeskader er minimeret med denne protokol i modsætning til elektroablation11. I ingen tilfælde var nye neuromastrere danner i hullet observeret, formentlig fordi den laterale linje nerve forbliver intakt og underliggende gliaceller forbliver og hæmmer spredningen af INMCs6,7,8,11.
Det påvises, at denne metode til konfokal laserablation også kan anvendes på andre celletyper, især i dem, der overfladisk befinder sig i dyret, herunder sensoriske hårceller (Figur 4). En lignende protokol kan anvendes til at ablate hudceller til at undersøge sår reparation eller neuroner for axonal regenerering undersøgelser, som tidligere beskrevet13. Det forventes, at denne teknik vil blive et nyttigt supplement til den eksperimentelle repertoire af laboratorier, der besidder en konfokal mikroskop, men ingen andre specialiserede udstyr til laser ablation.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH R15 tilskud 1R15DC015352-01A1 og Pace University interne finansieringskilder. Fisk linjer var høflighed af Vladimir Korzh14, Katie Kindt15,16, og laboratoriet af A. James Hudspeth. Vi vil gerne takke A. James Hudspeth og medlemmer af hans gruppe for feedback på disse eksperimenter, og kolleger på Pace University for deres støtte. Logistik regressionsanalyse i RStudio blev især hjulpet af vores kollega Matthew Aiello-Lammens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C.
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
