Summary
Laserablation är en brett tillämplig teknik för att studera regenerering i biologiska system. Det presenterade protokollet beskriver användning av en standard laser-scanning confocal mikroskop för laser ablation och efterföljande time-lapse imaging av regenererande interneuromast celler i zebrafish laterala linjen.
Abstract
Hårceller är mekanosensoriska celler som förmedlar hörselkänslan. Dessa celler regenererar inte efter skador hos människor, men de fylls naturligt på hos ryggradsdjur som inte är däggdjursdjur som zebrafisk. Den zebrafisk laterala linjesystemet är en användbar modell för att karakterisera sensoriska hårcell förnyelse. Den laterala linjen består av hårcellsinnehållande organ som kallas neuromasts, som är sammanlänkade med en sträng av interneuromastceller (INMCs). INMCs fungerar som progenitorceller som ger upphov till nya neuromaster under utvecklingen. INMCs kan reparera luckor i laterala linjesystemet som skapats av celldöd. En metod beskrivs här för selektiv INMC-ablation med hjälp av ett konventionellt laserskanningskonfokalmikroskop och transgen fisk som uttrycker grönt fluorescerande protein i INMCs. Time-lapse mikroskopi används sedan för att övervaka INMC regenerering och bestämma graden av gap stängning. Detta representerar ett tillgängligt protokoll för cellablation som inte kräver specialiserad utrustning, till exempel en kraftfull pulsad ultraviolett laser. Ablation-protokollet kan tjäna bredare intressen, eftersom det kan vara användbart för ablation av ytterligare celltyper, med en verktygsuppsättning som redan är tillgänglig för många användare. Denna teknik kommer att ytterligare möjliggöra karakterisering av INMC regenerering under olika förhållanden och från olika genetiska bakgrunder, vilket kommer att främja förståelsen av sensorisk progenitor cell regeneration.
Introduction
Kärnan i de flesta progressiva hörselnedsättning ligger förstörelsen av sensoriska hårceller, som transduce intrinsic hörselstimuli i nervimpulser detekterbara av hjärnan. Cochlear hårcell död orsakar permanent hörselnedsättning, som vuxna däggdjur saknar förmåga att regenerera dessa celler efter skada. Omvänt kan ryggradsdjur som zebrafiskar som inte är däggdjur och som zebrafiskar som förlorats till akustiskt trauma eller ototoxisk förolämpning. Den zebrafisk mekanosensoriska laterala linjen är ett enkelt och lättmanipulerat organsystem som kan användas för att studera hårcellsregeneration1,2,3.
Den laterala linjen består av små sensoriska fläckar som kallas neuromasts, som är anslutna under utvecklingen av en sträng av långsträckta celler som kallas interneuromast celler (INMCs). Med tanke på deras proliferativ kapacitet som uppenbara stamceller som ger upphov till nya hårcellsinnehållande organ, är beteendet hos INMCs av stort intresse för samhället4,5. Mycket av forskningen som rör INMCs har kännetecknat undertryckande av deras spridning av närliggande Schwann celler som lindar runt den laterala linjen nerv, sannolikt genom en hämmare av Wnt / β-catenin signalering. 6,7,8. Medan regleringen av INMC spridning och differentiering till nya neuromasts har välbeskriven, har de mekanismer som styr INMC återväxt efter ablation inte klarlagts. Detta protokoll fungerar som ett sätt att ablating enskilda INMCs och analysera deras efterföljande regenerativ beteende.
En mängd olika metoder för att förstöra hårceller, stödja celler, och hela neuromasts har publicerats, tillsammans med metoder för övervakning av återhämtning. Kemisk ablation fungerar bra för hårceller, men doser av giftiga kemikalier som CuSO4 måste ökas avsevärt för att avlägsna andra laterala linjecelltyper9. Medan elektroablation under fluorescensmikroskopi är ett effektivt och enkelt sätt att förstöra INMCs att studera regenerering, är det svårt att rikta snävt och, därför, kommer sannolikt att producera betydande indirekta skador. Som ett resultat kan detta maskera aspekter av INMC-specifika beteenden10,11. Laser ablation protokoll har varit anställd, men de kräver användning av specialiserad utrustning inte nödvändigtvis närvarande i den genomsnittliga laboratorium eller bildframställning anläggning (dvs, kraftfulla pulsade UV-lasrar12). Den metod som beskrivs här kan utföras med någon laser-scanning confocal mikroskop utrustat med den gemensamma 405 nm laser, vanligtvis används för bildframställning DAPI och andra blå fluoroforer. En fördel med denna metod är att konfokal avbildning kan utföras omedelbart före och efter cellskador utan att engagera några ytterligare laserstyrsystem eller överföra till ett annat mikroskop utrustat med en pulsad laser.
En liknande metod har beskrivits för ablating nervceller i zebrafisken ryggmärgen13. Den tidigare metoden kräver dock en FRAP-modul för cellablation, vilket inte är ett krav för detta protokoll. Vidare, med tanke på olika celltypers skilda egenskaper (dvs. ljusstyrka för transgenfluorescens, djup i kroppen, och cellform), är det troligt att betydande modifieringar kommer att behövas beroende på vilken celltyp som används. Protokollet som beskrivs här är mer sannolikt att vara effektiva för mer ytliga celler, som stöds av en demonstration av sensoriska hårcell ablation med samma metod. Också beskrivs är en regenerering analys för att bedöma INMC återvinningsgrad efter ablation, som inte var ett inslag i den tidigare nämnda studien.
Det laserbaserade cellablationsprotokollet som beskrivs häri fångar upp INMCs regenerativa kapacitet genom optimering av laserförhållanden, avbildning för- och postablation och mikroskopi med timelapse- Dessa element går samman för att utförligt skildra INMC återväxt och gap stängning i sin helhet. Medan detta protokoll används här för att förstöra INMCs, Det kan tillämpas på annat arbete som kräver tillförlitlig och effektiv bedömning av cellulära ablation. Det är också en tillgänglig teknik, eftersom den kan genomföras på alla konfokalmikroskop utrustad med en 405 nm laser.
Protocol
Allt djurarbete godkändes av Pace University Institutional Animal Care and Use Committee enligt protokoll 2018-1.
1. Beredning av zebrafisklarver
- Ställ upp parning 3–5 dagar innan experimentet genomförs, så att larver kommer att vara 2 dagar efter befruktningen (dpf) till 4 dpf i ålder när de är monterade för laserablation.
OBS: Et(krt4:EGFP)sqEt20 (förkortat ET20) förstärkare fälla linje, där interneuromast celler är tydligt märkta med förstärkt grönt fluorescerande protein (eGFP), möjliggör relativt lätt cell identifiering och ablation11,14. För bekräftelse av laser ablation specificitet och flexibilitet, ET20 fisk föds upp med Tg(neuroD:tdTomato) fisk, där den laterala linjen nerven är märkt med rött fluorescerande protein eller med Tg(myo6b:βactin-GFP) för att märka sensoriska hårceller med GFP15,16. - Efter embryosamlingen följande dag, ruva embryon vid 28,5 °C i E3-medium som innehåller 0,0001% metylenblått tills de är färdiga att söva och montera.
2. Beredning av låg geleringsarokrona och trikainlösningar
- Till en 250 mL glas Erlenmeyer kolv, tillsätt 48 mL 1x E3 medium, 2 mL av 15 mM trikain stamlösning, och 0,5 g lågsmältande agaros.
- Mikrovågsugn lösningen på hög i 30 s och virvel (bär värmeskyddande handskar) för att lösa upp agaros. Upprepa 30 s uppvärmningscykler tills agaros är helt upplöst.
- Förvara agarosen i en inkubator som värms upp till 42 °C tills den är klar att användas.
3. Anesthetisering av zebrafisklarver
- Till ett koniskt rör på 50 mL, tillsätt 24 mL 1x E3 medium och 1 mL trikain stamlösning (15 mM) till en slutkoncentration på 600 μM. Virvel till mix.
- Ladda en av de sex brunnarna i en flatbottnad cellodlingsplatta med 8 mL E3 som innehåller 600 μM trikain.
- Använd en överföringspipett för att flytta zebrafisklarver till en 74 μm nätbottnad överföringsinsats.
- Överför det nätbottnad insatsen i brunnen på sex-brunnsplattan som innehåller lösningen E3 + tricain. Låt larverna stanna kvar i brunnen i minst 3 min eller tills de är helt sövda. Testa anestesi genom att knacka på skäret. Larver bör inte starta och simma som svar på kranen.
4. Fluorescerande screening av sövda zebrafisklarver
- Pipett en sövd larv per brunn på 12 väl hydrofoba-belagda diabilder för screening. Se till att det finns minimal krökning av menisken som bildas i varje brunn av bilden för att minska optisk distorsion vid screening. Detta kan göras genom att ta bort en liten volym E3 från varje brunn efter att larverna placerats.
- Under ett 10x-mål på ett upprätt mikroskop (utrustat med en kvicksilverbåglampa, metallhalogenlampa eller LED-ljuskälla och en lämplig filterkub), skärm för larver som uttrycker eGFP i neuromasterna och interneuromastcellerna i lateraltlinjesystemet.
- Välj larver med starkare uttryck vilket resulterar i ljusare eGFP, som förmodligen är homozygous för transgenen.
OBS: I ET20 linjen, eGFP uttrycks i en ring av mantelceller som omger varje neuromast samt den smala remsan av interneuromast celler som förbinder dessa organ. Starkare eGFP-uttryck (ljusare fluorescens) bidrar till effektivare ablation. - För att undersöka ablations specificitet, använd dubbeltransgena larver med både ET20- och Tg(neuroD:tdTomato)-transgenerna. Om screening för Tg(neuroD:tdTomato) bärare, använd RFP filter kuben inställd för att identifiera en klarröd patch bara posterior till örat som representerar den bakre laterala linjen ganglion.
- För att ablate hårceller i den laterala linjen neuromasts, använd Tg(myo6b:βactin-GFP) transgena linje och skärm för GFP lokalisering i mitten av varje neuromast.
- Välj larver med starkare uttryck vilket resulterar i ljusare eGFP, som förmodligen är homozygous för transgenen.
- Välj larver med stereotypa avstånd av neuromasterna. Skillnader i avståndet mellan neuromasts kan tyda på onormal neuromast nedfall under utveckling, vilket tyder på defekt flyttande beteende eller cell spridning i den laterala linjen primordium17. Sådana fel kan också påverka migrations- eller regenerativ beteende av INMCs efter ablation.
OBS: Vanliga defekter i avstånd inkluderar ett ovanligt stort avstånd mellan den främre mest neuromast som deponeras av den första migrerande primordium (prim1L1) och den andra neuromasten som deponeras av samma primordium (prim1L2), ofta förknippad med trängsel av de mer bakre neuromasterna.
5. Montering av larver för laserablation och bildframställning
- Pipett 3 - 4 sövda larver till en liten droppe E3/trikainlösning i mitten av en täckslipbottnad skål (35 mm fat med en 14 mm nummer 1,5 täckblad). Ta bort överflödig lösning så att larverna förblir i en liten droppe, bara tillräckligt stor för att innehålla dem.
- Överför skålen till scenen i ett binokulärstereomikroskop och manipulera zoomen och fokusera så att alla larver är i synfältet.
- Ta bort Erlenmeyerkolven som innehåller den låga smältpunktens agaros från den uppvärmda inkubatorn. Använd en överföringspipett för att överföra agaroslösning på täckglaset för att producera ett tunt lager. Dra bort överskott agarose tills vätskan bara fyller brunnen längst ner på skålen, var noga med att inte aspirera några larver.
- Snabbt ordna larverna i agaroslösningen med hjälp av en hårkniv eller hårslinga så att de är i linje med varandra och orienterade med rostral till vänster.
- Tryck försiktigt larverna ner mot glaset med hårkniven, så att de ligger i profil med sina högra sidor ner. Larver äldre än 3 dpf tenderar att flyta på grund av deras uppblåsta simma blåsor, så de kan behöva upprepade gånger pressas ner mot glaset tills agarose börjar gel.
- Efter ca 60 s kommer agarosen att börja stelna, och larverna kommer inte att kunna omorientas. Låt ca 5 minuter i rumstemperatur för att agaros på täcksligen ska stelna helt. När agaros har stelnat, använd en överföring pipett för att fylla skålen halvvägs med E3 som innehåller 1x trikain.
6. Att lokalisera blivande mål och avbildning före ablation
- Slå på strömmen till laserskanningskonfokalmikroskopisystemet och initiera genom det integrerade bildhanteringsprogrammet. Välj 63x Plan-Apochromat oljebadmål (numerisk bländare 1,40) eller liknande. Applicera nedsänkningsolja och säkra skålen i ett cirkulärt steg infoga så att larverna ansikte med sin rostrala aspekt till vänster.
- Under ljus-fält eller differentialinterferens kontrast belysning, välj en av de monterade larverna för bildbehandling. Justera fokus med fokusratten så att huden på sidan av fisken närmast täckslip är i fokus, igenkännlig genom fingeravtrycksliknande mönster av periderm celler.
- Väl i fokus, växla till epifluorescerande belysning i GFP-kanalen. Leta upp den bakre laterala linjen genom GFP uttryck längs den horisontella myoseptum. Ringar av fluorescerande celler indikerar neuromast mantelceller, och avlånga strängar av celler är interneuromast celler.
- Börjar med primIL1 neuromast, vanligtvis ligger bara dorsala till äggulan, använd scenen kontroll joystick eller andra steg rörelse kontroll för att visuellt skanna caudally längs den horisontella myoseptum.
- Följ strängen av interneuromast celler tills nå regionen mellan primIL3 och primIL4 (L3 och L4) neuromasts (Figur 1A).
OBS: Andra regioner kan också riktas, men denna del av stammen och svansen tenderar att vara närmast täckglaset och, därför, mest mottagliga för ablation. - Om bildframställning flera larver, ställa in den första etappen position, sedan inaktivera flera steg positioner alternativet genom att avmarkera lämplig kryssruta.
- Upprepa steg 6.4.1–6.4.2. för varje önskad etappposition (varje larv).
- Följ strängen av interneuromast celler tills nå regionen mellan primIL3 och primIL4 (L3 och L4) neuromasts (Figur 1A).
- När cellkroppar i L3–L4-regionen har identifierats, övergå till anskaffningsläget.
- Aktivera ett avbildningsspår från GFP med hjälp av lasern 488 nm eller 491 nm.
- Lägg till en överförd ljus (transmitted light photomultiplier tube eller T-PMT) kanal till den aktiverade 488 nm laserspår genom att aktivera T-PMT checkbox under "Imaging Setup" dropdown-menyn.
- Ställ in lasereffekten på 6%, pinhole storlek till 1 Airy enhet motsvarande, och digital vinst till 750 för imaging ET20 larver. Exakt förstärkning och lasereffekt kan variera för en viss larv, beroende på hur nära omslagsslien de är monterade och ljusstyrkan för fluorescens. Justera förstärkningen så att cellkroppar är mättade för att fånga annars dunkla projektioner och filipodia.
- Justera parametrarna till en ramstorlek på 1024 pixlar x 1024 pixlar, digital zoom på 0,7 (145,2 μm x 145,2 μm bildstorlek). Ställ i genomsnitt till 2 för att förbättra bildkvaliteten.
- Kontrollera rutan z-stack för att få upp menyn z-position dropdown. Medan snabb skanning, fokusera ut tills interneuromast cellerna är bara ur fokus. Ställ in den första skivan och fokusera sedan genom provet tills interneuromastcellerna återigen är ur fokus. Ställ in den sista segmentet. Se till att den omfattar en z-stapel på cirka 25 μm. Ställ in bildbehandlingsintervallet på 1 μm.
- Starta experiment för att fånga en pre-ablation z-stack (Bild 1B). Om etapppositioner har lagts till inaktiverar du alternativet för positioner så att endast den aktuella positionen avbildas. Spara filen när den är fångad.
7. Laserablation av cellkroppar
- Klicka på "Visa alla Verktyg". Det här alternativet finns högst upp i anskaffningsgränssnittet.
- Klicka på dropdown-menyn för "Imaging Set Up". I "Imaging Set up", klicka på "Lägg till ett nytt spår" (representerat som "+").
- I "Imaging Set Up", klicka på dropdown-menyn för "Dye". Välj DAPI som färgämne.
- Klicka på dropdown-menyn för "Kanaler" och avmarkera alla andra spår genom att oklicka på deras respektive kryssrutor. Se till att endast DAPI-spåret är markerat.
- I DAPI-spåret klickar du på 405 för "Laserinställningen". Öka lasereffekten till 75%. Unclick dapi-kanalen för att stänga av lasern medan skanning för kandidat cell organ för ablation.
- Med kroppen av en interneuromast cell centrerad i synfältet, zooma in skanningsramen till 20x–22x. Rampositionen kan behöva justeras för att hålla cellkroppen i mitten när zoomen används. Stoppa live-skanning så snart cellkroppen fyller synfältet.
OBS: Cellkroppen ska uppta hela synfältet. På denna zoomnivå kommer GFP blekning snabbt. Minimera laserexponeringstiden genom att arbeta snabbt. Använd zoom i stället för att välja en region av intresse för att öka lasereffektfördelningen över ett litet område. - Kontrollera 405 nm laser slutare rutan för att aktivera spåret. Justera lasereffekten till 75%. Ställ in en timer för 45 s. Aktivera kontinuerlig skanning och starta timern. Sluta skanna omedelbart vid 45 s.
8. Bildåtergivning efter ablation och timelapsemikroskopi för att studera regenerering
- Klicka på dropdown-menyn för" Kanaler". I kanaler, oklicka på "DAPI" spåret för att inaktivera ablationslasern. Klicka på dropdown-menyn för "Acquisition mode".
- I förvärvsläge klickar du på "Zooma".
- Minska zoomen till 0,7 antingen genom att använda skjutreglaget eller genom att skriva in "0,7."
- För att säkerställa lyckad cellablation öka förstärkningen till 900 och snabbt skanna synfältet.
OBS: Ingen GFP ska vara synlig inom den eller de riktade cellen eller cellerna. Om fluorescens fortfarande observeras, återgå till steg 7.1–7.3. - Använda samma eller liknande inställningar som de som beskrivs för pre-ablation imaging, fånga och spara en post-ablation bild (Bild 1C). Om bilden avslöjar rester av fluorescerande celler eller ytterligare cellkroppar som behöver tas bort, upprepa laserablationsstegen för att skapa ett synligt mellanrum i strängen av interneuromastceller.
- Inspektera T-PMT-kanalbilden för att ytterligare bekräfta mobilskador. Skadade celler kommer att ha ett granulärt utseende, och ofta kommer kärnorna att svälla eller bli oregelbundna till formen (Figur 2).
- För att säkerställa lyckad cellablation öka förstärkningen till 900 och snabbt skanna synfältet.
- Efter att ha fångat en pre-ablation bild, ablating cellerna som behövs, och fånga en post-ablation bild för varje enskild scenposition, ställa in time-lapse mikroskopi genom att aktivera både stegposition och tid alternativ för bildfångst. Ställ in tidsparametrarna till 24 h eller en annan önskad slutpunkt och 15 min intervall. Starta experiment för att skaffa bilder och spara den resulterande filen när den är klar (på följande dag).
- Om larver ska studeras ytterligare eller höjas, försiktigt ta bort dem från agarose med hjälp av fina trikåer, sedan överföra till E3 medium utan trikain för återhämtning. Om de inte ska användas vidare, är dödshjälp enligt det godkända djurprotokollet (snabb och ihållande nedsänkning i ett isbad en vanlig metod) och kassera dem enligt institutionens krav.
9. Bildanalys
- Öppna en post-ablation z-stack-fil i den föredragna bildbehandlingsprogramvaran (Table of Materials). Dela upp kanalerna så att varje kanal finns i en separat visningsruta.
- I GFP-kanalfönstret använder du linjeverktyget för att rita en rak linje mellan spetsarna på de återstående INMC:er. Detta kan få hjälp genom att bläddra uppåt och nedåt genom z-stacken eller genom att utföra en projektion med maximal intensitet innan linjen ritas.
- Använd verktyget "Mät" för att erhålla avståndet mellan INMC-ändarna i x- och y-planen.
- Bläddra igenom z-skivorna i den ursprungliga z-stapeln för att bestämma avståndet mellan INCM:er i z-planet.
- Beräkna det totala avståndet mellan INMC-slutar med hjälp av pythagorassatsen (en2 + b2 = c2). Hypotenusan är det sammanlagda distansera (eller mellanrumsstorlek).
- Ange den resulterande avståndsmätningen i ett kalkylbladsprogram för dataanalys.
- Gå igenom de timelapscopyfiler som samlats in i steg 8.2–8.3 med hjälp av antingen den integrerade bildhanteringsprogramvaran på konfokalsystemet eller fritt tillgänglig bildanalysprogramvara. Identifiera den tidspunkt vid vilken gapet mellan interneuromast celler fylldes i av cellprojektioner. Detta kan med hjälp av granskning av flera z-skivor för att bekräfta stängning av gapet i alla dimensioner.
- För att uppnå den mest exakta mätningen av tid till lucka stängning, använd post-ablation bild tidsstämpel (synlig i Finder eller Utforskaren) som noll tidspunkt; mättid från början av image-stacken för tidsförlopp kan resultera i att tid till stängning underskattas, beroende på hur lång tid som förflutit medan du förbödande för ytterligare steg positioner, etc.
- Härleda tillslutningshastigheten genom att helt enkelt dividera den ursprungliga gapstorleken (μm) med de timmar eller minuter som krävs för fullständig mellanrumsstängning.
Representative Results
För att ablate INMCs och registrera regenerering, screenas GFP-expressing zebrafish larver av ET20 transgena linjen var monterade på 2- eller 3-dagars efterbefruktning för ablation som beskrivs i steg 5.4. Flera fiskar kan monteras samtidigt så att flera tidsförlopp kan fångas i ett enda experiment. Regionen i den laterala linjen som ligger mellan primIL3- och primIL4-neuromasterna identifierades, och bilder före ablationen togs upp enligt beskrivningen i steg 6.5–6.7 (figur 1A,B).
Tre cellkroppar riktades för laserablation för att skapa en lucka i INMC-strängen på cirka 40 μm. Efter ablation skanning med hög förstärkning och efterföljande bildbehandling bekräftade att inga cellkroppar kvar i den avtilade regionen, vilket lämnar en lucka mellan avlånga prognoser av de intilliggande INMCs (Figur 1C). Celldöd visades ytterligare genom att undersöka T-PMT-kanalen efter ablation. Skadade och döende celler präglades av svullna och oregelbundet formade kärnor samt en granulat utseende (Figur 2, skisserat). I vissa fall visade time-lapse imaging också rekryteringen av stora amöeboid celler som var sannolikt makrofager (Figur 2, asterisk). Mörka områden som omger de ablated INMCs anges fotobleaching i överliggande periderm celler. Dessa celler verkade inte vara skadade eller förstördes av laserbestrålning i dessa experiment; snarare minskades deras fluorescens tillfälligt. Time-lapse mikroskopi avslöjar att dessa celler normalt återhämta sig efter ablation och inte ändra form eller på annat sätt visas skadade (opublicerade resultat, Volpe et al.).
För att stödja specificiteten av INMC förstörelse utfördes ablations i dubbel-transgenic ET20 och Tg(neuroD:tdTomato) larver där den laterala linjen nerv (som löper bara mikroner under de interneuromast cellerna) är märkt med röda fluorescerande protein. Ablationer av flera celler som skapade stora luckor i INMC-strängen hade liten eller ingen effekt på den laterala linjen nerv baserad på röd fluorescens (Figur 3). Flexibilitet av tekniken för ablating ytligt lokaliserade celler visades genom selektiv förstörelse av enskilda sensoriska hår celler inom neuromasts av laterala linjen. Med hjälp av i huvudsak samma protokoll som beskrivs ovan (avsnitt 7 och 8), enstaka hårceller i transgena Tg(myo6b:βactin-GFP) larver förstördes utan synbar skada på intilliggande celler (Figur 4). De ablated hårcellerna återhämtade sig inte fluorescens efter time-lapse mikroskopi, och deras kärnor var märkbart granulära och missbildade efter laserexponering (Figur 4B). I likhet med INMC ablationer, var uppenbara makrofager rekryteras ofta till laser exponering webbplats (opublicerade resultat, Volpe et al.).
Efter laser ablation och post-ablation bildfångst, gap storlek mättes med hjälp av fritt tillgängliga bildanalys programvara. Måttverktyget uppvisade mellanrumsstorlekar som sträcker sig från bara några mikrometer upp till 100 mikrometer, beroende på bredden på enskilda INMCs och hur många celler som valdes för ablation (Figur 5). Timelapse mikroskopi var anställd för att registrera INMC beteenden under regenerering. I 50 försök har 15 luckor (30 %) stängdes genom regenerering inom en 24 h-period. I de flesta fall gjorde INMCs som kunde återhämta sig det inom de första timmarna av bildbehandling. Återhämtning definierades som den tidspunkt vid vilken projektioner från angränsande celler kom i kontakt, som inträffade 16 h efter ablation för ett gap på cirka 40 μm (Film 1). Z-staplar undersöktes noggrant för att säkerställa att cell-cell kontakt inträffade inom en enda z-plan, undvika möjliga artefakter på grund av z-prognoser. Logistisk regressionsanalys visade att sannolikheten för gap stängning korrelerade med gap storlek (p = 0,0453), med mindre luckor är mer benägna att läka. Ett gap på 55,5 μm gav en avslutningssannolikhet på 50 % (figur 5).
I 70% av fallen kunde INMCs inte helt stänga gapet som skapas av ablation. Men även i dessa fall kunde vi övervaka bildandet av långa prognoser från angränsande INMCs, som liknar i vissa avseenden utvidga neuronal tillväxt kottar (Movie 2). Således kan dessa experiment också ge insikt i beteenden av INMCs efter skada.
Figur 1: Selektiv ablation av interneuromastceller genom laserbestrålning. (A) Interneuromast celler mellan neuromasts primIL3 och primIL4 valdes ut för ablation. Dessa celler visar en karakteristisk spindelform med avlånga projektioner som överlappar intilliggande cellkroppar. (B) Pre-ablation imaging identifierade cell organ som kunde ablated att producera en lucka. (C) Efter ablation imaging bekräftar framgångsrik ablation som anges av frånvaron av cellkroppar i gapet regionen. Skala barer = 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Efter ablationsavbildning visar celldöd som svar på laserexponering i GFP-märkta interneuromastceller. Överförd ljus fotomultiplier imaging (T-PMT) anger förekomsten av en nekrotisk cell med en granulat utseende (inringade) samt rekrytering av oregelbundet formade celler som är sannolikt makrofager (*). Sammanslagning av GFP och T-PMT kanaler bekräftar att celldöd och macrophage aktivitet inträffade på platsen för ablation. Skala barer = 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Specificitet för interneuromast ablation. (A) Pre-ablation GFP-märkta interneuromastceller (grön) och tdTomat-märkt lateral linjenerven (röd) i en dubbeltransgen Tg(ET20; NeuroD:tdTomato) larva. Cell organ i närheten av den laterala linjen nerv var riktade för ablation. (B) Efter ablation bildåtergivning visar ablation av riktade cell organ med en intakt laterala linjen nerv. Skalstång = 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Ablation av sensoriska hårceller med hjälp av konfokalmikroskopi. (A) Pre-ablation imaging identifierade en GFP märkt sensorisk hårcell (*) riktade för ablation i dubbel-transgenic Tg(ET20; myo6b:βactin-GFP) zebrafisk. Överförd ljus photomultiplier tube (T-PMT) imaging avslöjar normala hår cell morfologi, med ett runt tvärsnitt. (B) Efter-ablation imaging bekräftar framgångsrik ablation av den riktade hårcell. En T-PMT bild indikerar oegentligheter i hår cell form och ökad granularitet efter laser exponering, vilket tyder på celldöd snarare än photobleaching. Skalstång = 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Logistisk regression modeller sannolikheten för gap stängning som en funktion av gap bredd (i μm). En poäng på 0 representerar fullständig avstängning av luckor, medan en poäng på 1 representerar ofullständig avstängning. Resultaten visar att effekten av gapets bredd på interneuromastcellernas förmåga att stänga respektive mellanrum är statistiskt signifikant (p = 0,0453, n = 24 totalt; n = 12 slutna mellanrum, n = 12 ofullständigt slutna luckor). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Film 1: Time-lapse mikroskopi visar gap stängning (~ 40 μm) efter 16 h. Bilder togs var 15 min, och en maximal intensitet z-projektion gjordes för alla timepoints. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Film 2: Time-lapse mikroskopi av en INMC gap som inte nära. De avlånga och förgrenande prognoserna för de återstående INMC:er visas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Discussion
Protokollet beskriver en mångsidig metod för lasercellsablation som kan utföras på vilket konfokalmikroskop som helst utrustat med en nära-ultraviolett laser (405 nm våglängd). Detta protokoll behandlar begränsningar av tidigare anställda metoder såsom elektroablation (som orsakar mer utbredd skada11) och pulsade UV-laser ablation (som kräver ytterligare specialiserad utrustning12). Pre- och post-ablation confocal imaging ger snabb feedback angående framgång av experimentet. Efterföljande time-lapse mikroskopi erbjuder en enkel analys för regenerering i en cell typ kritisk för sensorisk systemutveckling.
Det är av avgörande betydelse att prescreen för transgena zebrafiskar som uttrycker GFP starkt i neuromaster och INMCs. Larver med ljus fluorescens och ungefär jämnt avstånd av de primI-härledda neuromasterna är idealiska kandidater för laserablation. Även i dessa fiskar, det finns ibland dimmer INMCs som vid första flykt upptäckt. Dessa celler kan ligga kvar efter laserablation, vilket förhindrar bildandet av en sann klyfta mellan INMCs. Den digitala förstärkningen bör justeras för att avslöja dessa dimmerceller under avbildning av pre-ablation så att de också kan riktas med 405 nm-lasern (steg 8.2).
På samma sätt kommer laserinriktning ibland inte helt förstöra en cell; snarare kommer det bleka fluorescensen, vilket resulterar i ett misslyckande att skapa en verklig lucka. Dessa celler kommer i allmänhet att öka i fluorescens under timelapse mikroskopi. Förstärkningsjustering i bildtagningssteget efter ablation tillsammans med T-PMT-avbildning (Bild 2) bidrar till att alla celler som är målinriktat har avlägsnats effektivt. Det kräver ofta två eller tre enskilda cell ablationer för att producera en lucka i INMC strängen. Celldöd kan detekteras genom blebbning eller ett granulärt utseende i de riktade cellerna; även om detta kan kräva en kort väntetid efter laserinriktning (och i vissa fall observeras uppenbara apoptotiska eller nekrotiska siffror kort därefter).
En begränsning av detta förfarande är att det kan kräva flera experimentella försök innan laser villkor optimeras och INMC regenerering är framgångsrik. Lasereffekten och den totala uppehållstiden för lasern kan var och en kräva smärre justering för olika prover. Det har konstaterats att överdriven laser ansökan kan försämra förmågan hos den laterala linjen att reparera sig själv. Detta omfattar både 1) överexponering av enskilda celler till laser bestrålning, förmodligen orsakar ytterligare skador på omgivande vävnader, samt 2) ablation av alltför många celler i strängen, vilket leder till en större lucka. Användarna måste uppnå en balans mellan tillräckligt bestrålande celler för att säkerställa deras destruktion och inte överexponera cellerna, vilket kan bromsa eller förhindra regenerering. Med lämpliga inställningar har det konstaterats att INMCs kan tas bort utan synliga skador på den bakre laterala linjen nerv, vilket tyder på att oavsiktlig skada minimeras med detta protokoll till skillnad från electroablation11. I inga fall var nya neuromasts bildas i gapet observeras, förmodligen på grund av den laterala linjen nerv förblir intakt och underliggande gliaceller kvar och hämma spridningen av INMCs6,7,8,11.
Det visas att denna metod för confokal laser ablation kan tillämpas på andra celltyper också, särskilt i de ytligt belägna inom djuret inklusive sensoriska hårceller (Figur 4). Ett liknande protokoll kan användas för att ablate hudceller att undersöka sår reparation eller nervceller för axonal regenerering studier, som tidigare beskrivits13. Det förväntas att denna teknik kommer att bli ett användbart komplement till den experimentella repertoaren av laboratorier som har ett konfokalmikroskop men ingen annan specialiserad utrustning för laserablation.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NIH R15 bidrag 1R15DC015352-01A1 och Pace University interna finansieringskällor. Fisk linjer var artighet av Vladimir Korzh14, Katie Kindt15,16, och laboratoriet för A. James Hudspeth. Vi vill tacka A. James Hudspeth och medlemmar i hans grupp för feedback på dessa experiment, och kollegor på Pace University för deras stöd. Logistisk regressionsanalys i RStudio fick särskilt hjälp av vår kollega Matthew Aiello-Lammens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C.
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
