Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.
Tweedimensionale (2D) celculturen bootsen in vivo tumorgroei niet naar tevredenheid na. Daarom werden driedimensionale (3D) cultuursferoïde modellen ontwikkeld. Deze modellen kunnen bijzonder belangrijk zijn op het gebied van neuro-oncologie. Inderdaad, hersentumoren hebben de neiging om de gezonde hersenomgeving binnen te dringen. We beschrijven hierin een ideale 3D glioblastoom sferoïde-gebaseerde test die we ontwikkelden om tumorinvasie te bestuderen. Wij bieden alle technische details en analytische tools om deze test succesvol uit te voeren.
In de meeste studies met behulp van primaire of commercieel beschikbare cellijnen, tests worden uitgevoerd op cellen geteeld op plastic oppervlakken als monolayer culturen. Het beheren van celcultuur in 2D betekent nadelen, omdat het geen in vivo 3D-celomgeving nabootst. In 2D-culturen is het hele celoppervlak direct in contact met het medium, waardoor de celgroei verandert en de beschikbaarheid van geneesmiddelen wordt gewijzigd. Bovendien activeert het niet-fysiologische kunststofoppervlak celdifferentiatie1. Driedimensionale cultuurmodellen zijn ontwikkeld om deze moeilijkheden te overwinnen. Ze hebben het voordeel van het nabootsen van de meercellige architectuur en heterogeniteit van tumoren2, en dus kan worden beschouwd als een meer relevant model voor vaste tumoren3. De complexe morfologie van sferoïden draagt bij aan een betere evaluatie van medicijnpenetrantie en resistentie4. De tumor heterogeniteit in de sferoïde beïnvloedt de verspreiding van zuurstof en voedingsstoffen, en de reactie op farmacologische middelen (Figuur 1A). Verspreiding van zuurstof wordt gewijzigd wanneer de sferoïde grootte 300 μm bereikt, wat leidt tot een hypoxische omgeving in het midden van de sferoïde (Figuur 1A, C). Metabolieten zijn ook minder penetrerendoor de cellagen en compenserende metabole reacties vinden plaats5. Wanneer de diameter van de sferoïde toeneemt, kunnen necrotische kernen worden waargenomen, waardoor verdere nabootsing van kenmerken die bij veel vaste vormen van kanker worden gevonden, waaronder het agressieve hersenkankerglioblastoom (GBM)6.
Verschillende 2D of 3D invasie testen voor glioblastoom zijn gemeld in de literatuur7,8. Tweedimensionale testen zijn voornamelijk voor het bestuderen van invasie in een horizontaal vlak op een dunne matrixlaag of in een Boyden kamer test9. Driedimensionale tests zijn beschreven met 3D sferoïde culturen met behulp van klassieke glioblastoom cellijnen10. Meer complexe varianten worden vertegenwoordigd door invasie van hersenorganoïden door tumorsferoïden in confrontatieculturen11. Het is echter nog steeds belangrijk om een gebruiksvriendelijke en reproduceerbare test te ontwikkelen die voor elk laboratorium beschikbaar is. We hebben een protocol ontwikkeld om glioblastoom stamcellen-achtige cellen te genereren uit patiëntmonsters. De kwantificering van deze tests is gemakkelijk beheersbaar en vereist alleen open-access online software. Kortom, tumorstukjes worden in kleine stukjes gesneden en enzymatisch verteerd. Enkele cellen afkomstig van de spijsvertering worden gekweekt in neurobasaal medium. Na 4-7 dagen vormen sferoïde structuren zich spontaan. Bij intracraniale implantatie in muizenmodellen vormen ze tumoren die een necrotische kern vertonen die wordt omringd door pseudo-palisadecellen12. Dit lijkt sterk op de kenmerken van GBM-patiënten.
In dit artikel beschrijven we ons protocol om sferoïden te produceren uit een bepaald aantal cellen om reproduceerbaarheid te garanderen. Hiervoor kunnen twee complementaire matrices worden gebruikt: Matrigel en collageen type I. Matrigel is verrijkt met groeifactoren en bootst het basale basale membraan van zoogdieren na dat nodig is voor celhechting en migratie. Aan de andere kant, collageen type I, een structureel element van stroma, is de meest voorkomende fibrillaire extracellulaire matrix en wordt gebruikt in cel invasie testen. Hierin illustreren we ons GBM sferoïde model door migratie- en proliferatietesten uit te voeren. Analyse werd niet alleen gedaan op vaste tijdpunten, maar ook door het monitoren van sferoïde expansie en celbeweging door live beeldvorming. Bovendien werd elektronenmicroscopie gedaan om morfologische details te visualiseren.
Tumor sferoïde testen zijn goed aangepast aan tumor kenmerken met inbegrip van proliferatie, invasie, en migratie, evenals celdood en drug reactie te bestuderen. Kankercellen dringen de 3D-matrix de vorming van een invasieve microtumor, zoals te zien in figuur 4B, C. Tijdens het invasieve proces kunnen matrix metalloproteinasen (MMP) matrices rondom tumorcellen13verteren , en MMP-remmers (bijvoorbeeld GM6001 of Rebimastat) de celinvasie schaden, maar…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon is een ontvanger van de beurs van het Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).
96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |