Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.
Culturas celulares bidimensionais (2D) não imitam o crescimento do tumor in vivo de forma satisfatória. Assim, foram desenvolvidos modelos esferóides de cultura tridimensional (3D). Esses modelos podem ser particularmente importantes no campo da neuro-oncologia. De fato, tumores cerebrais têm a tendência de invadir o ambiente cerebral saudável. Descrevemos aqui em um ensaio 3D baseado em glioblastoma baseado em esferóide sheroide que desenvolvemos para estudar a invasão de tumores. Fornecemos todos os detalhes técnicos e ferramentas analíticas para realizar este ensaio com sucesso.
Na maioria dos estudos usando linhas celulares primárias ou comercialmente disponíveis, os ensaios são realizados em células cultivadas em superfícies plásticas como culturas de monocamada. Gerenciar a cultura celular em 2D representa desvantagens, pois não imita um ambiente celular in vivo 3D. Em culturas 2D, toda a superfície celular está diretamente em contato com o meio, alterando o crescimento celular e modificando a disponibilidade de medicamentos. Além disso, a superfície plástica não fisiológica desencadeia a diferenciação celular1. Modelos de cultura tridimensional foram desenvolvidos para superar essas dificuldades. Eles têm a vantagem de imitar a arquitetura multicelular e a heterogeneidade dos tumores2, e, portanto, poderiam ser considerados um modelo mais relevante para tumores sólidos3. A morfologia complexa dos esferóides contribui para avaliar melhor a penetração e resistência da droga4. A heterogeneidade tumoral no esferóide impacta a difusão de oxigênio e nutrientes, e a resposta aos agentes farmacológicos (Figura 1A). A difusão de oxigênio é alterada quando o tamanho esferoide atinge 300 μm, induzindo um ambiente hipóxico no centro do esferóide(Figura 1A,C). Os metabólitos também são menos penetrantes através das camadas celulares e as reações metabólicas compensatórias ocorrem5. Quando o diâmetro do esferóide aumenta, núcleos necrosados podem ser observados, imitando ainda mais características encontradas em muitos cânceres sólidos, incluindo o agressivo glioblastoma de câncer cerebral (GBM)6.
Vários ensaios de invasão 2D ou 3D para glioblastoma foram relatados na literatura7,8. Ensaios bidimensionais são principalmente para estudar a invasão em um plano horizontal em uma fina camada de matriz ou em um ensaio de câmara de Boyden9. Ensaios tridimensionais foram descritos com culturas esferóides 3D usando linhas celulares glioblastoma clássicas10. Variantes mais complexas são representadas pela invasão de organóides cerebrais por esferóides tumorais em culturas de confronto11. No entanto, ainda é importante desenvolver um ensaio fácil de usar e reprodutível disponível para qualquer laboratório. Desenvolvemos um protocolo para gerar células-tronco de glioblastoma a partir de amostras de pacientes. A quantificação desses ensaios é facilmente gerenciável e requer apenas software on-line de acesso aberto. Resumidamente, os pedaços do tumor são cortados em pequenos pedaços e digeridos enzimticamente. As células únicas derivadas da digestão são cultivadas em meio neurobasal. Após 4-7 dias, estruturas esferóides formam-se espontaneamente. Após a implantação intracraniana em modelos de camundongos, formam tumores exibindo um núcleo necrosado cercado por células pseudo-palisading12. Isso se assemelha muito às características encontradas em pacientes GBM.
Neste artigo, descrevemos nosso protocolo de produção de esferóides a partir de um determinado número de células para garantir a reprodutibilidade. Duas matrizes complementares podem ser utilizadas para este fim: Matrigel e colágeno tipo I. Matrigel é enriquecido em fatores de crescimento e imita a membrana basal mamífera necessária para o apego celular e migração. Por outro lado, o colágeno tipo I, um elemento estrutural do estroma, é a matriz extracelular fibriária mais comum e é usado em ensaios de invasão celular. Aqui, ilustramos nosso modelo esferóide GBM realizando ensaios de migração e proliferação. A análise foi feita não apenas em pontos de tempo fixo, mas também por monitoramento da expansão esferóide e movimento celular por imagem ao vivo. Além disso, a microscopia eletrônica foi feita para visualizar detalhes morfológicos.
Os ensaios esferóides tumorais são bem adaptados para estudar características tumorais, incluindo proliferação, invasão e migração, bem como morte celular e resposta a medicamentos. As células cancerígenas invadem a matriz 3D formando um microtumor invasivo, como visto na Figura 4B,C. Durante o processo invasivo, as matrizes de metaloproteinases matriciais (MMP) digerem matrizes ao redor das células tumorais13, e os inibidores de MMP (por e…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon é bolsista do Hospital Universitário de Toulouse (CHU Toulouse).
96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |