Här beskriver vi en lätt att använda invasionsanalys för glioblastom. Denna analys är lämplig för glioblastom stamceller-liknande celler. Ett fijitenma makro för enkel kvantifiering av invasion, migration och spridning beskrivs också.
Tvådimensionella (2D) cell kulturer inte efterlikna in vivo tumör tillväxt tillfredsställande. Därför utvecklades tredimensionella (3D) kultur sfäroid modeller. Dessa modeller kan vara särskilt viktiga inom neuro-onkologi. Faktum är att hjärntumörer har en tendens att invadera den friska hjärnmiljön. Vi beskriver häri en idealisk 3D glioblastoma sfäroid-baserade analys som vi utvecklat för att studera tumör invasion. Vi tillhandahåller alla tekniska detaljer och analysverktyg för att framgångsrikt utföra denna analys.
I de flesta studier med primära eller kommersiellt tillgängliga cellinjer utförs analyser på celler som odlas på plastytor som monolagerkulturer. Hantera cellkultur i 2D representerar nackdelar, eftersom det inte efterliknar en in vivo 3D-cellmiljö. I 2D-kulturer är hela cellytan direkt i kontakt med mediet, förändrar celltillväxt och ändrar läkemedelstillgänglighet. Dessutom utlöser den ickefysiologiska plastytan celldifferentiering1. Tredimensionella kulturmodeller har utvecklats för att övervinna dessa svårigheter. De har fördelen av att härma den flercelliga arkitekturen och heterogeniteten hos tumörer2, och kan därför anses vara en mer relevant modell för solida tumörer3. Den komplexa morfologi av sfäroider bidrar till att bättre utvärdera läkemedlet penetrance och resistens4. Tumören heterogenitet i sfäroiden påverkar spridningen av syre och näringsämnen, och svaret på farmakologiska medel (figur 1A). Diffusion av syre ändras när sfäroidstorleken når 300 μm, vilket leder till en hypoxisk miljö i mitten av sfäroiden (figur 1A,C). Metaboliter är också mindre genomträngande genom cellskikten och kompensera metaboliska reaktioner sker5. När diametern på sfäroiden ökar, nekrotiska kärnor kan observeras, ytterligare härma egenskaper som finns i många fasta cancerformer, inklusive den aggressiva hjärncancer glioblastoma (GBM)6.
Flera 2D eller 3D invasion analyser för glioblastoma har rapporterats i litteraturen7,8. Tvådimensionella analyser är främst avsedda för att studera invasion i ett horisontellt plan på ett tunt matrisskikt eller i en Boyden kammare analys9. Tredimensionella analyser har beskrivits med 3D sfäroid kulturer med klassisk glioblastoma cellinjer10. Mer komplexa varianter representeras av invasion av hjärnan organoider av tumör sfäroider i konfrontation kulturer11. Det är dock fortfarande viktigt att utveckla en lätt att använda och reproducerbara analyser tillgängliga för alla laboratorium. Vi har utvecklat ett protokoll för att generera glioblastoma stamceller från patientprover. Kvantifieringen av dessa analyser är lätt hanterbar och kräver endast öppen online-programvara. Kortfattat skärs tumörbitar i små bitar och enzymmatiskt smält. Enstaka celler som härrör från matsmältningen odlas i neurobasal medium. Efter 4-7 dagar bildas sfäriska strukturer spontant. Vid intrakraniell implantation i möss modeller, de bildar tumörer uppvisar en nekrotisk kärna omgiven av pseudo-palisading celler12. Detta liknar nära de egenskaper som finns i GBM patienter.
I den här artikeln beskriver vi vårt protokoll för att producera sfäroider från ett fastställt antal celler för att säkerställa reproducerbarhet. Två kompletterande matriser kan användas för detta ändamål: Matrigel och kollagen typ I. Matrigel är berikad i tillväxtfaktorer och härmar däggdjur basala membran som krävs för cellen fastsättning och migration. Å andra sidan, kollagen typ I, ett strukturellt inslag av stroma, är den vanligaste fibrillary extracellulär matris och används i cell invasion analyser. Häri illustrerar vi vår GBM sfäroid modell genom att utföra migration och spridning analyser. Analys gjordes inte bara vid fasta tidpunkter utan också genom att övervaka sfäroid expansion och cell rörelse av levande bildbehandling. Dessutom gjordes elektronmikroskopi för att visualisera morfologiska detaljer.
Tumör sfäroid analyser är väl anpassade för att studera tumör egenskaper inklusive spridning, invasion, och migration, samt celldöd och läkemedelsrespons. Cancerceller invaderar 3D-matrisen och bildar en invasiv mikrotumör, vilket ses i figur 4B,C. Under den invasiva processen kan matrismetalloproteinaser (MMP) smälta matriser kring tumörceller13och MMP-hämmare (t.ex.14 Migration och invasion innebär överlappande …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon är en mottagare av stipendium från Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).
96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |