Palmitovlation indebærer inkorporering af en 16-carbon palmitat moiety til cysteinrester af målproteiner på en reversibel måde. Her beskriver vi en biokemisk tilgang, acyl-PEGyl udveksling gel shift (APEGS) assay, at undersøge palmitoylering tilstand af ethvert protein af interesse i mus hjerne lysates.
Aktivitetsafhængige ændringer i niveauet af synaptiske AMPA-receptorer (AMPARs) inden for postsynaptisk tæthed (PSD) menes at repræsentere en cellulær mekanisme til læring og hukommelse. Palmitoplation regulerer lokalisering og funktion af mange synaptiske proteiner, herunder AMPA-R’er, hjælpefaktorer og synaptiske stilladser på en aktivitetsafhængig måde. Vi identificerede synapse differentiering induceret gen (SynDIG) familie af fire gener (SynDIG1-4) kodning hjerne-specifikke transmembranproteiner, der forbinder med AMPARs og regulere synapse styrke. SynDIG1 palmitoladeres ved to cysteinrester på position 191 og 192 i den sideløbende transmembrane-region, der er vigtig for aktivitetsafhængig ekstuponitory synapseudvikling. Her beskriver vi en innovativ biokemisk tilgang, acyl-PEGyl udveksling gel shift (APEGS) assay, at undersøge palmitoylering tilstand af ethvert protein af interesse og demonstrere dens nytte med SynDIG familie af proteiner i musehjerne lysates.
S-palmitovlation er en reversibel posttranslationel ændring af målproteiner, der regulerer stabil membranforening, proteinhandel og proteinproteininteraktioner1. Det indebærer tilsætning af en 16-carbon palmitatmoiety til cysteinrester via thioester kobling katalyseret af palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Mange synaptiske proteiner i hjernen er palmitolaated, herunder AMPA-Rs og PSD-95, i en aktivitetsafhængig måde at regulere stabilitet, lokalisering, og funktion2,3,4. Ændringer i niveauet af synaptiske AMPARs i PSD via interaktion mellem hjælpefaktorer med synaptiske stilladser såsom PSD-95 ligger til grund for synaptisk plasticitet; således giver metoder til bestemmelse af synaptiske proteiners palmitotolationstilstand vigtig indsigt i mekanismer for synaptisk plasticitet.
Tidligere identificerede vi SynDIG-familien på fire gener (SynDIG1-4), der koder hjernespecifikke transmembranproteiner, der forbinder med AMPARs5. Overekspression eller knock-down af SynDIG1 i dissociated rotte hippocampal neuroner stiger eller falder, henholdsvis AMPA-R synapse størrelse og antal med ~ 50% som opdaget ved hjælp af immuncytokemi og elektrofysiologi5. Vi udnyttede acyl-biotin-vekslingen (ABE) til at vise, at SynDIG1 palmitoladeres ved to bevarede sammentædningscycycysrester (findes i alle SynDIG-proteiner) på en aktivitetsafhængig måde for at regulere stabilitet, lokalisering og funktion6. ABE-analysen er baseret på udveksling af biotin på cysteiner, der er beskyttet af ændringer og efterfølgende affinitetsrensning7. Her beskriver vi en innovativ biokemisk tilgang, acyl-PEGyl udveksling gel shift (APEGS) assay8,9,10,11,12, som ikke kræver affinitet rensning og i stedet udnytter ændringer i gel mobilitet til at bestemme antallet af ændringer for et protein af interesse. Protokollen er beskrevet til undersøgelse af endogene membranproteiner fra musehjernen, for hvilke der findes egnede antistoffer.
I vores tidligere arbejde, vi udnyttede ABE analyse til at vise, at SynDIG1 er palmitoyleret på to bevarede sammenstilling-transmembrane Cys rester (findes i alle SynDIG proteiner) i en aktivitetsafhængig måde at regulere stabilitet, lokalisering, og funktion6. En begrænsning er, at ABE-analysen kræver affinitetsrensning med agaroseharpikser, der er konjugeret til avidin moieties som det sidste trin i proceduren, hvilket resulterer i et betydeligt tab af signal, der komplicerer den kvantitati…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker K. Woolfrey for rådgivning og input på APEGS assay. Disse undersøgelser blev finansieret af forskningsbevillinger til E.D. fra Whitehall Foundation og NIH-NIMH (1R01MH119347).
Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |