Summary
Die Palmitoylierung beinhaltet die Umarbeitung einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cysteinrückständen von Zielproteinen in reversibler Weise. Hier beschreiben wir einen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines Proteins zu untersuchen, das für Maushirnlysate von Interesse ist.
Abstract
Aktivitätsabhängige Veränderungen in den Konzentrationen von synaptischen AMPA-Rezeptoren (AMPARs) innerhalb der postsynaptischen Dichte (PSD) wird angenommen, um einen zellulären Mechanismus für das Lernen und Gedächtnis darstellen. Die Palmitoylierung reguliert die Lokalisierung und Funktion vieler synaptischer Proteine, einschließlich AMPA-Rs, Hilfsfaktoren und synaptischen Gerüste auf aktivitätsabhängige Weise. Wir identifizierten die Synapsendifferenzierunginduzierte Gen (SynDIG) Familie von vier Genen (SynDIG1-4), die hirnspezifische Transmembranproteine kodieren, die mit AMPARs assoziiert werden und die Synapsenstärke regulieren. SynDIG1 wird bei zwei Cysteinrückständen an den Positionen 191 und 192 in der für die aktivitätsabhängige Exzitatoren-Synapsenentwicklung wichtigen Region der Juxta-Transmembran palmitoyiert. Hier beschreiben wir einen innovativen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines beliebigen Proteins zu untersuchen und seinen Nutzen mit der SynDIG-Proteinfamilie in Maushirnlysaten zu demonstrieren.
Introduction
S-Palmitoylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation von Zielproteinen, die eine stabile Membranverbindung, Proteinhandel und Protein-Protein-Wechselwirkungen reguliert1. Es beinhaltet die Zugabe einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cystein-Rückständen über Thioester-Verbindung, die durch Palmitoyl-Acyltransferase (PAT)-Enzyme katalysiert wird. Viele synaptische Proteine im Gehirn sind palmitoylated, einschließlich AMPA-Rs und PSD-95, in einer aktivitätsabhängigen Weise, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion2,,3,4zu regulieren. Veränderungen der Konzentrationen synaptischer AMPARs in der PSD über die Wechselwirkung von Hilfsfaktoren mit synaptischen Gerüsten wie PSD-95 liegen der synaptischen Plastizität zugrunde; Daher bieten Methoden zur Bestimmung des Palmitoylierungszustands von synaptischen Proteinen wichtige Einblicke in Mechanismen der synaptischen Plastizität.
Zuvor haben wir die SynDIG-Familie von vier Genen (SynDIG1-4) identifiziert, die hirnspezifische Transmembranproteine kodieren, die mit AMPARs5assoziiert werden. Überexpression oder Knock-down von SynDIG1 in dissoziierten Ratten Hippocampus-Neuronen erhöht oder verringert, bzw. AMPA-R Synapse Größe und Zahl um 50%, wie mit Immunzytochemie und Elektrophysiologie nachgewiesen5. Wir nutzten den Acyl-Biotin-Austausch (ABE)-Test, um zu zeigen, dass SynDIG1 bei zwei konservierten Juxta-Transmembran-Cys-Rückständen (in allen SynDIG-Proteinen) in einer aktivitätsabhängigen Weise palmitoylated ist, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion6zu regulieren. Der ABE-Test stützt sich auf den Austausch von Biotin auf Cysteins, die durch Modifikation und anschließende Affinitätsreinigung geschützt sind7. Hier beschreiben wir einen innovativen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS) Assay8,9,10,11,12, der keine Affinitätsreinigung erfordert und stattdessen Änderungen in der Gelmobilität nutzt, um die Anzahl der Modifikationen für ein Protein von Interesse zu bestimmen. Das Protokoll wird für die Untersuchung von endogenen Membranproteinen aus dem Maushirn beschrieben, für die geeignete Antikörper zur Verfügung stehen.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren folgten den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, Davis, genehmigt.
1. Vorbereitung von Maus-Gehirnmembranen
- Enthaupten Sie die Maus mit einem Guillotine-Apparat und sezieren Sie das Gehirn schnell (in <1 min, wenn möglich, um Palmitoylierungsänderungen zu minimieren, die während des Sezierens auftreten können). Homogenisieren Sie sofort in 10 ml Homogenisierungspuffer (Tabelle 1) in einem Glashomogenisator (ca. 12 Striche) auf Eis.
- Zentrifugenlysate für 15 min bei 1.400 x g bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre auf Eis. Das Pellet (ca. 6 Striche) in gleichem Homogenisierungspuffer und Zentrifugenvolumen bei 710 x g für 10 min bei 4 °C wieder aufsetzen.
- Kombinieren Sie die Überwälte aus Schritt 1.2 und Zentrifuge bei 40.000 x g für 20 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand (zytosolische Fraktion) und setzen Sie die Pelletmembran -Fraktion (P2) im Homogenisierungspuffer wieder auf.
HINWEIS: Proben können bei -80 °C für die spätere Verwendung blitzfest aufbewahrt und gelagert werden. - Führen Sie einen Bicinchoninsäure-Assay (BCA) durch, um den Proteinspiegel zu quantitieren. Beginnen Sie für den APEGS-Test mit einem Protein von 100 bis 200 mg (maximal 250 mg) in einem Volumen von 470 l Puffer A (Tabelle 1) in einem 1,5 ml-Rohr. Beschallung und Zentrifuge bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C, um unlösliches Protein zu entfernen. Übertragen Sie lösliches Protein in ein neues 1,5 ml-Rohr.
2. Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay
- Disulfidbindungen stören und freie Cysteins blockieren.
- Disulfidbindungen durch Inkubation in 25 mM Tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP; 25 l, addiert aus einer Lagerlösung; Tabelle 1) 60 min bei 55 °C.
- Blockfreie Cysteins mit 50 mM N-Ethylmaleimid (NEM; 12,5 l, addiert aus einer Stammlösung; Tabelle 1) bei Raumtemperatur für 3 h.
HINWEIS: Die Reaktion kann über Nacht verlängert werden.
- Führen Sie Chlorform-Methanol (CM)-Fällung durch.
- Übertragen Sie die Proteinlösung aus 1,5 ml Rohr auf ein Polypropylen- oder Glasrohr, das in einem schwingenden Schaufelrotor mit bescheidener Geschwindigkeit zentrifugiert werden kann. Ein 5 ml Rohr ist ideal. Vier Bände (2 ml) Methanol (MeOH) und Wirbel kurz hinzufügen.
- Fügen Sie zwei Bände (1 ml) Chloroform und Wirbel kurz hinzu.
- Fügen Sie drei Bände (1,5 ml) von dH2O und Wirbel kurz hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 3.000 x g für 30 min bei 25 °C in einem schwingenden Schaufelrotor.
- Entfernen und verwerfen Sie die obere Phase vorsichtig.
- Fügen Sie 3 Bände (1,5 ml) Von MeOH hinzu und mischen Sie sanft, aber gründlich, wobei Sie darauf achten, den undurchsichtigen Proteinpfannkuchen nicht zu fragmentieren.
- Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min bei 25 °C in einem schwingenden Schaufelrotor.
- Mit einer serologischen Glaspipune so viel wie möglich von der Oberphase entfernen, ohne den Proteinpfannkuchen zu stören.
- Spülen Sie das Pellet vorsichtig mit 1 ml MeOH ab.
- Das Pellet mindestens 10 min an der Luft trocknen.
HINWEIS: Getrocknetes Pellet kann bei -20 °C gelagert werden.
- Dekolleté von Palmitoyl-Thioester-Verbindungen mit Hydroxylamin (NH2OH, HAM) durchführen.
- Das Protein in 125 L Puffer A aussetzen und kurz beschallen. Zentrifuge bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C, um unlösliches Material zu entfernen. Übertragen Sie lösliches Protein in ein neues 1,5 ml-Rohr.
- Fügen Sie 375 l Puffer H (HAM+; Tabelle 1) oder Puffer T (HAM-; Tabelle 1) proben für 60 min bei 25 °C inkubieren.
- Wiederholen Sie den in Schritt 2.2 beschriebenen CM-Niederschlag.
HINWEIS: Getrocknetes Pellet kann bei -20 °C gelagert werden. - Fügen Sie mPEG zu ungeschützten Cysteins hinzu.
- Pellet in 100 l Puffer A mit 10 mM TCEP resuspendieren. Transfer in ein 1,5 ml Rohr.
HINWEIS: Es ist normal, dass während der CM-Fällungsschritte ein signifikanter Proteinverlust aufgetreten ist. Alle nachfolgenden Schritte werden in einem 1,5 ml-Rohr durchgeführt, wodurch das Proteinvolumen auf maximal 120 bis 130 l eingeendert wird. Dies reduziert den Proteinverlust während der endgültigen CM-Fällung. - Fügen Sie 20 mM mPEG-5k (25 l, hinzugefügt aus einer Lagerlösung; Tabelle 1) Proteinprobe und durch Pipettieren mischen. 60 min bei 25 °C mit End-over-End-Rotation inkubieren.
- Um mPEG-5k ohne eigene Rechtspersönlichkeit zu entfernen, führen Sie die CM-Fällung wie in Schritt 2.2 beschrieben unter Verwendung dieser bereinigten Volumina durch: 4 Volumen MeOH (500 l), 2 Chloroform-Volumen (250 l) und 3 Volumina von dH2O (375 l). Zentrifuge bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C.
- Entfernen Sie vorsichtig die obere Phase wie zuvor, um den dicken, flockigen Pfannkuchen zu vermeiden. 1 ml MeOH hinzufügen und sanft, aber gründlich mischen. Zentrifuge bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und spülen Sie das Pellet mit 1 ml MeOH ab. Zentrifuge bei >13.000 x g für 10 min bei 25 °C. Lufttrockenes Pellet.
HINWEIS: Getrocknetes Pellet kann bei -20 °C gelagert werden. - Setzen Sie das getrocknete Pellet in 50 l Puffer A (ohne TCEP oder ein Reduktionsmittel) wieder auf. Reservieren Sie 5 l für die BCA-Proteinquantitation. Nach der Quantifizierung eine entsprechende Menge an 4x Laemmli-Probenpuffer hinzufügen und je nach Protein potenziell 10 min auf 70 bis 100 °C erhitzen.
HINWEIS: Kochen kann die Aggregation einiger Membranproteine verursachen.
- Pellet in 100 l Puffer A mit 10 mM TCEP resuspendieren. Transfer in ein 1,5 ml Rohr.
3. Western Blot-Analyse von PEGylierten Proteinen
- Die Probe auf ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Gel13.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde 10% Polyacrylamid verwendet. - Verwenden Sie Standard-Trenn-, Übertragungs- und Detektionsprotokolle für Western Blotting14.
- Verwenden Sie Densitometrie14, um die relativen Mengen von PEGylated im Vergleich zu nicht PEGylylierten Proteinen zu bestimmen.
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Representative Results
Die Immunoblotting mit Antikörpern gegen das Protein von Interesse zeigt den palmitoylated Zustand (nicht, singly, doppelt, etc.) in Maus Gehirnlysaten, wie durch Mobilitätsverschiebung im Vergleich zu Proben, in denen HAM nicht enthalten war bestimmt. Zuvor hatten wir gezeigt, dass SynDIG1 an zwei Standorten mit dem ABE-Assay6palmitoylated wurde; Wir konnten jedoch nicht feststellen, ob beide Standorte im Hirngewebe verändert wurden. Hier zeigen wir, dass SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 und Prrt2 im Maushirn palmitoylated sind und dass sie zwei potenzielle Palmitoylierungsstellen haben (Abbildung 1). Interessanterweise hat jedes Protein einen anderen Palmitoylierungszustand im Maushirn basierend auf dem Signal für das nicht, singly und doppelt palmitoylated Protein. Die Densitometrie-Analyse von Flecken liefert quantitative Informationen über den palmitoylated Zustand.
Abbildung 1: Nachweis von PEGylated-Proteinarten in Mausmembranpräparaten. Mausgehirne wurden schnell seziert und sofort homogenisiert. P2-Membranfraktionen wurden dem APEGs-Assay unterzogen, wie in diesem Protokoll beschrieben. In diesem Experiment wurden postnatale Tag 18 (P18) mit einem 10% SDS-PAGE Gel getrennt und immunoblotted und mit Antikörpern gegen SynDIG1 (SD1), Prrt2 und SynDIG4 (SD4) untersucht. Symbole zeigen Protein, das nicht palmitoylated (•), palmitoylated singly (*) oder doppelt (**) ist. Das Vorhandensein schwacher Bänder in den HAM (-)-Bedingungen deutet entweder auf eine unvollständige Reduktion von Disulfidbindungen oder eine unvollständige Verstopfung freier Cysteins durch NEM hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Puffer | Komponenten | Arbeitskons. | Kommentare |
| Homogenisierung | 0,32 M Saccharose, 1 mM Tris pH 7,2, 1 mM MgCl2 | Fügen Sie PMSF- und Proteasehemmer unmittelbar vor der Anwendung hinzu. | |
| Puffer A | PBS pH 7,2, 5 mM EDTA, 4% SDS (w/v) | Fügen Sie PMSF- und Proteasehemmer unmittelbar vor der Anwendung hinzu. | |
| TCEP-Lösung | 500 mM TCEP in ddH2O (pH 7.2) | 25 mM | Fügen Sie 10 N NaOH hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen. |
| NEM-Lösung | 2,0 M NEM in 100% Ethanol | 50 mM | Frisch vorbereiten. |
| Puffer H (HAM+) | 1,33 M HAM, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (w/v) | 1,0 M | Frisch vorbereiten. |
| Puffer T (HAM-) | 1,33 M Tris-HCl, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (mit/v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k in ddH2O | 20 mM | Gut mischen. Hochviskos. |
Tabelle 1: Lösungen für APEGS-Assay. Homogenisierungspuffer und Puffer A können im Voraus vorbereitet werden; Proteaseinhibitoren und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) unmittelbar vor der Anwendung hinzufügen. Alle anderen Lösungen sollten frisch vorbereitet werden.
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Discussion
In unserer vorherigen Arbeit haben wir den ABE-Test verwendet, um zu zeigen, dass SynDIG1 bei zwei konservierten Juxta-Transmembran-Cys-Rückständen (in allen SynDIG-Proteinen) in einer aktivitätsabhängigen Weise palmitoyiert wird, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion6zu regulieren. Eine Einschränkung ist, dass der ABE-Test eine Affinitätsreinigung mit Agaroseharzen erfordert, die als letzter Schritt im Verfahren mit Avidin-Moieties konjugiert werden, was zu einem signifikanten Signalverlust führt, der die quantitative Analyse erschwert. Darüber hinaus kann der ABE-Assay nicht unterscheiden, ob ein Protein einmal oder an mehreren Stellen palmitoylated ist.
Hier verwenden wir den APEGS-Assay8,9,10,11,12, um den Palmitoylierungszustand der AMPAR-Hilfstransmembranproteine SynDIG1 und der zugehörigen Proteine SynDIG4 (auch bekannt als Prrt1) und Prrt2 aus Maushirnextrakten zu bestimmen; Der Assay kann jedoch auf jedes Membranprotein angewendet werden, für das ein hochwertiger und spezifischer Antikörper für western blotting zur Verfügung steht. Die Verwendung von Hirnmembranen von Wildtyp-Mäusen (WT) und Knockout (KO) bietet eine ideale Kontrolle für die Antikörperspezifität, wie wir für Antikörper gegen SynDIG115 und SynDIG416nachgewiesen haben. Die Durchführung des APEGS-Assays mit Gehirnlysaten von WT- und KO-Mäusen bietet eine wichtige Kontrolle für die Antikörperspezifität bei dieser Methode. Diese Methode könnte auch auf verschiedene Membranfraktionen angewendet werden, die durch Differentialzentrifugation gewonnen wurden, gefolgt vom APEGS-Assay, um die subzelluläre Lokalisation des Proteins von Interesse zu untersuchen.
Ein kritischer Schritt des APEGS-Assays sind CM-Fällungen, deren Zweck darin besteht, Chemikalien (NEM und HAM) von der Störung nachfolgender nachgeschalteter Reaktionen zu entfernen. Obwohl es möglich ist, CM-Fällungen in einem 1,5 ml-Rohr durchzuführen, sollte die Verwendung größerer Rohre und Volumen zu optimaleren Ergebnissen führen. Gleichzeitig, zum Teil wegen der mehrfachen CM-Fällungen, sollte man von Anfang bis Ende mit einem erheblichen Proteinverlust rechnen. Dies kann zu einer scheinbaren Variabilität des Gesamteniaminatspiegels im Minus- und Plus-HAM-Zustand führen.
Wie in Abbildung 1dargestellt, führt die Zugabe von mPEG-5k (5 kDa) nicht notwendigerweise zu einer linearen Verschiebung auf einem Immunoblot. Dies kann Vorteile bei der Auflösung von Proteinen haben, die an mehreren Standorten palmitoylated sind. Darüber hinaus deutet das Vorhandensein von Bändern an Mobilitätsverschiebungsstandorten in den HAM-Negativbedingungen entweder auf eine unvollständige Reduzierung von Disulfidbindungen oder eine unvollständige Verstopfung freier Cysteins durch NEM hin. Alternativ können scheinbar verschobene Bänder im HAM-negativen Zustand darauf hindeuten, dass freie Cysteins innerhalb eines bestimmten Proteins schwer zu blockieren sind. Daher könnte eine zusätzliche Optimierung des Blockierungsschritts erforderlich sein, wenn im Gegensatz zu SynDIG1, SynDIG4 und Prrt2, bei dem der Großteil des Proteins entweder sionhaft oder doppelt palmitoylated ist, nur ein kleiner Prozentsatz des Gesamtproteins palmitoylated ist (Abbildung 1).
Diese Methode ist nicht auf Mausgehirnlysate beschränkt. Zum Beispiel wurde diese Methode verwendet, um auf depalmitoylierende Enzyme für PSD-95 in heterologen Zellen9zu untersuchen. Die Expression von Proteinen in heterologen Zellen ermöglicht auch die Bestimmung des genauen Ortes der Modifikation über eine standortgesteuerte Mutagenese. Diese Methode informierte auch die Rolle des synaptischen Gerüsts AKAP150 in der synaptischen Plastizität17,18, was eine breite Anwendung in der Neurowissenschaft demonstrierte.
Es ist wichtig zu beachten, dass der APEGS-Assay nicht exklusiv für 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moieties ist, da der Assay andere langkettige Fettacyl-Verbindungen erkennt, die Spaltung und Ersatz durch mPEG unterliegen. Um palmitate Modifikation schlüssig zu etablieren erfordert zusätzliche Experimente wie metabolische Etikettierung mit tritiiertem Palmitat.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken K. Woolfrey für die Beratung und den Input zum APEGS-Assay. Diese Studien wurden durch Forschungsstipendien an E.D. von der Whitehall Foundation und dem NIH-NIMH (1R01MH119347) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
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