Summary
パルミトイル化は、16炭素パルミチン酸部分を、可逆的に標的タンパク質のシステイン残基に取り込む必要があります。ここでは、生化学的アプローチ、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、マウス脳ライセートに関心のある任意のタンパク質のパルミトイル化状態を調べる。
Abstract
シナプス後密度(PSD)内のシナプスAMPA受容体(AMPA)のレベルにおける活動依存的変化は、学習および記憶のための細胞メカニズムを表していると考えられている。パルミトイル化は、AMPA-Rs、補助因子、シナプス足場を含む多くのシナプスタンパク質の局在化と機能を活動依存的に調節します。我々は、AMPAに関連付け、シナプス強度を調節する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)のシナプス分化誘導遺伝子(SynDIG)ファミリーを同定した。SynDIG1は、活性依存性励起シナプスの発達に重要な並置膜貫通領域の位置191および192に位置する2つのシステイン残基でパルミトレート化される。ここでは、革新的な生化学的アプローチであるアシルPEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、目的のタンパク質のパルミトリューション状態を調査し、マウス脳リセート中のSynDIGファミリーのタンパク質との有用性を実証する。
Introduction
S-パルミトリューションは、安定した膜会合、タンパク質の密売、およびタンパク質とタンパク質相互作用を調節する標的タンパク質の可逆的な翻訳後修飾である。パルミトイルアシルトランスセファーゼ(PAT)酵素によって触媒チオエステルリンケージを介してシステイン残基に16-炭素パルミチン酸部分を添加することを含む。脳内の多くのシナプスタンパク質は、安定性、局在化,、および機能,2、3、4を調節する活動依存的な方法で、AMPA-RsおよびPSD-95を含むパルミトレート化される。24PSD-95のようなシナプス足場との補助因子の相互作用によるPSD中のシナプスAMPプラスチックのレベルの変化は、シナプス可塑性を下にしている。したがって、シナプスタンパク質のパルミトイル化状態を決定する方法は、シナプス可塑性のメカニズムに関する重要な洞察を提供する。
以前は、AMPA5と関連する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)の5SynDIGファミリーを同定した。解約されたラット海馬ニューロンにおけるSynDIG1の過剰発現またはノックダウンは、それぞれ増加または減少し、AMPA-Rシナプスサイズおよび数は免疫細胞化学および電気生理学を用いて検出された〜50%ずつ増加または減少する。我々は、アシルビオチン交換(ABE)アッセイを利用して、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(全SynDIGタンパク質に見られる)でパルミトレートされ、安定性、局在化、機能6を調節する活性依存的な方法で実証した。ABEアッセイは、改変とその後の親和性精製によって保護されたシステインに対するビオチンの交換に依存する7。ここでは、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイ,88、9、10、11、1210,11という革新的な生化学的アプローチについて説明します。,912プロトコルは、適切な抗体が利用可能なマウス脳からの内因性膜タンパク質の調査のために記述されている。
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Protocol
すべての動物の手順は、国立衛生研究所(NIH)が定めたガイドラインに従い、カリフォルニア大学デービス校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。
1. マウス脳膜の調製
- ギロチン装置を使用してマウスの首を切り落とし、脳を急速に解剖する(可能であれば、解剖中に起こり得るパルミトイル化の変化を最小限に抑えるために、可能であれば、1分)。10 mLの均質化バッファー (表 1)をガラスホモジナイザー(〜12ストローク)で氷上で直ちに均質化する。
- 遠心分離機は4°Cで1,400 x gで15分間にリセートする。上清を氷上の新しいチューブに移します。ペレットを均一な体積の均質化バッファーと遠心分離機の 710 x gで 4 °C で 10 分間再懸濁します。
- ステップ1.2の上清と遠心分離機を40,000 x gで4°Cで20分間組み合わせます。
- 上清(細胞質画分)を捨て、ペレット化膜(P2)分を均質化緩衝液中で再懸濁する。
メモ:サンプルは、フラッシュ冷凍し、後で使用するために-80°Cで保存することができます。 - タンパク質レベルを定量化するために、ブチンチオン酸(BCA)アッセイを行います。APEGSアッセイの場合、1.5 mLチューブ内のバッファA(表1)の470 μLの体積で~100〜200mgのタンパク質(最大250mg)から始めます。25°Cで10分間、13,000 x gの超音波処理と遠心分離機を用いて不溶性タンパク質を除去します。可溶化したタンパク質を新しい1.5 mLチューブに移します。
2. アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイ
- ディスルフィド債を破壊し、自由なシステインをブロックする。
- 25 mMトリス(2-カルボクセチル)ホスフィン(TCEP;25 μL、ストック溶液から添加)でインキュベートすることにより、ジスルフィド結合を破壊する。表 1)55°Cで60分間。
- 50 mM N-エチルマライムミド(NEM;12.5 μL)を含む無料システインをブロックし、ストック溶液から添加する。表 1)室温で3時間。
注:反応は一晩延長することができます。
- クロロホルムメタノール(CM)沈殿を行う。
- 1.5 mLチューブからポリプロピレンまたはガラスチューブにタンパク質溶液を移し、適度な速度で揺れるバケットローターで遠心分離することができます。5 mLの管は理想的である。メタノール(MeOH)と渦の4つのボリューム(2 mL)を短時間追加します。
- クロロホルムと渦の2つのボリューム(1 mL)を簡単に追加します。
- dH2Oと渦の3つのボリューム(1.5 mL)を短時間追加します。
- 3,000 x gで 30 分間、25 °C のスイング バケット ローターでサンプルを遠心します。
- 上のフェーズを慎重に削除して破棄します。
- 3巻(1.5mL)のMeOHを加え、不透明なプロテインパンケーキを断片化しないように注意して、穏やかに、しかし徹底的に混ぜます。
- 3,000 x gで25°Cで10分間、揺れるバケットローターで遠心分離機。
- ガラス血清学的ピペットを使用して、タンパク質パンケーキを邪魔することなく、できるだけ多くのトップフェーズを取り除きます。
- 慎重にMeOHの1 mLでペレットをすすいでください。
- ペレットを少なくとも10分間空気乾燥します。
注:乾燥ペレットは-20°Cで保存することができます。
- パルミトイルチオエステル結合とヒドロキシルアミン(NH2OH,HAM)の切断を行う。
- タンパク質沈殿を125 μLのバッファーAと超音波処理で短時間再懸濁します。25°Cで10分間13,000xgの遠心分離機を用い、不溶性物質を除去する。 g可溶化したタンパク質を新しい1.5 mLチューブに移します。
- バッファH(HAM+;)の375 μLを加える;表 1)またはバッファー T (HAM-;表 1)25°Cで60分間サンプルをインキュベートする。
- ステップ2.2に記載のCM沈殿を繰り返す。
注:乾燥ペレットは-20°Cで保存することができます。 - 保護されていないシステインに mPEG を追加します。.
- 10 mM TCEPを含むバッファAの100 μLにペレットを再懸濁します。1.5 mLチューブに移します。
注: CM沈殿工程中にタンパク質の著しい損失が発生するのは正常です。以降のすべてのステップは1.5 mLチューブで行われ、タンパク質の体積を最大120〜130μLに制限します。これにより、最終的なCM沈殿時のタンパク質損失が減少します。 - 20 mM mPEG-5k (25 μL、ストックソリューションから追加)表 1)タンパク質サンプルにし、ピペットによって混合します。エンドオーバー回転で25°Cで60分間インキュベートします。
- 非法人mPEG-5kを除去するには、ステップ2.2で説明したCM沈殿を、MeOH(500 μL)の4体積、クロロホルム(250μL)、3体積のdH2O(375 μL)を用いて行います。2遠心分離機で >13,000 x g 25 °Cで10分。
- 厚くて凝集したパンケーキを避けて、以前と同じくらい慎重に上相を取り除きます。MeOHを1mL加え、やさしく混ぜます。遠心分離機で >13,000 x g 25 °Cで10分。
- 上清を慎重に取り除き、1 mLのMeOHでペレットをすすきます。遠心分離機で >13,000 x g 25 °Cで10分。空気乾燥ペレット。
注:乾燥ペレットは-20°Cで保存することができます。 - 乾燥したペレットをバッファーAの50 μL(TCEPまたは任意の還元剤なしで)再懸濁します。BCAタンパク質定量のために5 μLを予約してください。定量後、適切な量の4xレムリサンプルバッファーを追加し、目的のタンパク質に応じて、サンプルを70-100°Cに加熱して10分間加熱する可能性があります。
注意:沸騰は、いくつかの膜タンパク質の凝集を引き起こす可能性があります。
- 10 mM TCEPを含むバッファAの100 μLにペレットを再懸濁します。1.5 mLチューブに移します。
3. PEGylatedタンパク質のウェスタンブロット分析
- 試料をドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲル13に載せる。
注:このプロトコルでは10%ポリアクリルアミドが使用されました。 - ウェスタンブロッティング14の標準分離、転送、および検出プロトコルを使用します。
- 密度測定14を用い、PEGylatedと非PEGylate化タンパク質の相対的量を決定する。
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Representative Results
目的のタンパク質に対する抗体を用いた免疫ブロッティングは、HAMが含まれていないサンプルと比較して移動性シフトによって決定されるマウス脳ライゼにおけるパルミトレート状態(非、独り、二重など)を明らかにする。以前は、SynDIG1がABEアッセイ6を用いて2つのサイトでパルミトレートされていることを実証しました。しかし、両方の部位が脳組織で改変されたかどうかは判断できませんでした。ここでは、SynDIG1、SynDIG4/Prrt1、およびPrrt2がマウス脳でパルミトレートされ、2つの潜在的なパルミトレーション部位があることを示します(図1)。興味深いことに、各タンパク質は、非、1つの、かつ二重にパルミトレートされたタンパク質のシグナルに基づいて、マウス脳内で異なるパルミトイル化状態を有する。ブロットのデンシトメトリー分析は、パルミトレート状態に関する定量的情報を提供します。
図1:マウス膜調製物におけるPEGylatedタンパク質種の検出マウスの脳を迅速に解剖し、即座に均質化した。P2膜画分は、このプロトコルに記載されているように、APGアッセイを行った。この実験では、出生後18日目(P18)を10%SDS-PAGEゲルを使用して分離し、免疫ブロットを使用してSynDIG1(SD1)、Prrt2、SynDIG4(SD4)に対する抗体でプローブした。記号は、パルミトレート(•)、パルミトレート(*)、または二重(**)のタンパク質を示す。HAM(-)条件におけるかすかなバンドの存在は、二硫化結合の不完全な減少またはNEMによる遊離システインの不完全な閉塞のいずれかを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| バッファー | コンポーネント | 作業conc. | コメント |
| 均質 化 | 0.32 Mスクロース、1 mMトリスpH 7.2、1 mM MgCl2 | PMSFとプロテアーゼ阻害剤を使用する直前に添加します。 | |
| バッファ A | PBS pH 7.2, 5 mM EDTA, 4% SDS (w/v) | PMSFとプロテアーゼ阻害剤を使用する直前に添加します。 | |
| TCEP ソリューション | 500 mM TCEP イン ddH2O (pH 7.2) | 25mM | pH を増やすために 10 N NaOH を加えます。 |
| NEM ソリューション | 2.0 M NEM 100% エタノール | 50mM | 新鮮な準備をします。 |
| バッファ H (ハム+) | 1.33 M HAM, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.2% トリトン X-100 (w/v) | 1.0 M | 新鮮な準備をします。 |
| バッファ T (HAM-) | 1.33 M トリス-HCl、pH 7.0、5 mM EDTA、0.2% トリトンX-100(w/v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k イン ddH2O | 20mM | よく混ぜます。非常に粘性。 |
表1:APEGSアッセイに使用されるソリューション。ホモジナイゼーションバッファーとバッファ A は、事前に準備できます。しかし、使用直前にプロテアーゼ阻害剤およびフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を添加する。他のすべてのソリューションは、新鮮な準備をする必要があります。
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Discussion
前の研究では、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(すべてのSynDIGタンパク質に見られる)で、安定性、局在化、機能を調節する活性依存的な方法でパルミトレートされていることを実証するためにABEアッセイを利用しました。制限は、ABEアッセイは、手順の最終ステップとしてアビジン部分に結合したアガロース樹脂との親和性精製を必要とし、定量分析を複雑にするシグナルの大幅な損失をもたらすことです。さらに、ABEアッセイでは、タンパク質が一度、または複数の部位でパルミトレートされるかどうかを区別することはできません。
ここでは、APEGSアッセイ88、9、10、11、1210,11,12を使用して、AMPAR補助膜貫通タンパク質SynDIG1および関連タンパク質SynDIG4(Prrt1とも呼ばれる)およびマウス脳抽出物からのPrrt2のパルミトリューション状態を決定します。,9しかし、このアッセイは、ウェスタンブロッティングに適した高品質で特異的な抗体が利用可能な任意の膜タンパク質に適用することができます。野生型(WT)およびノックアウト(KO)マウスからの脳膜の使用は、SynDIG115およびSynDIG416に対する抗体について実証したように、抗体特異性に理想的な制御を提供する。WTおよびKOマウスからの脳ライセートでAPEGSアッセイを行うことは、この方法における抗体特異性に対する重要なコントロールを提供する。この方法は、差動遠心分離を介して得られた異なる膜画分に適用され、その後APEGSアッセイを用いて、目的のタンパク質の細胞内局在化を調べることができる。
APEGSアッセイの重要なステップの1つはCM沈殿であり、その目的は、その後の下流反応に干渉する化学物質(NEMおよびHAM)を除去することです。1.5 mLチューブでCM沈殿を行うことは可能ですが、より大きなチューブとボリュームを使用すると、より最適な結果が得られます。同時に、複数のCM沈殿の一部のために、最初から最後までタンパク質の大幅な損失を期待する必要があります。これにより、マイナスと加えたHAM条件の総タンパク質レベルに明らかな変動が生じる可能性があります。
図1に示すように、mPEG−5k(5kDa)の添加は、必ずしも免疫ブロット上の直線的なシフトを生じるとは限らない。これは、複数の部位でパルミトレートされるタンパク質を分解する上で利点を有することができる。さらに、HAM陰条件における移動性シフト位置におけるバンドの存在は、二硫化結合の不完全な減少またはNEMによる遊離システインの不完全な閉塞のいずれかを示す。あるいは、HAM陰性条件下での明らかなシフトバンドは、特定のタンパク質内の遊離システインをブロックすることが困難であることを示す可能性がある。したがって、タンパク質の大部分が単一または二重にパルミトレートされるSynDIG1、SynDIG4、およびPrrt2とは対照的に、総タンパク質のわずかな割合だけがパルミトレートされている場合、ブロッキングステップの追加の最適化が必要になる可能性があります(図1)。
この方法は、マウスの脳のライセートに限定されません。例えば、この方法は、異種細胞9で発現するPSD-95に対する脱パルミトイル化酵素のスクリーニングに使用されてきた。異種細胞におけるタンパク質の発現は、部位特異的突然変異誘発を介した修飾の正確な部位の決定も可能にする。この方法はまた、シナプス可塑性17、18,18におけるシナプス足場AKAP150の役割を知らせ、神経科学における広範な応用を実証した。
APEGSアッセイは、mPEGによる切断および置換の対象となる他の長鎖脂肪アシル結合を検出するので、APEGSアッセイは16炭素のパルミテート部分に排他的ではないことを注意することが重要です。パルミテ修飾を決定的に確立するには、トリティア化パルミテートによる代謝標識などの追加実験が必要です。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、APEGSアッセイに関するアドバイスとインプットをK.ウールフリーに感謝する。これらの研究は、ホワイトホール財団とNIH-NIMH(1R01MH119347)からE.D.への研究助成金によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
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