Summary
Palmitoylation comporta l'incorporazione di una moiety palmitativa 16-carbonio ai residui di cisteina delle proteine bersaglio in modo reversibile. Qui, descriviamo un approccio biochimico, l'analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse nei lismi cerebrali dei topi.
Abstract
Si ritiene che le alterazioni dipendenti dall'attività nei livelli dei recettori sinaptici degli AMPA (AMPA) all'interno della densità post-sinaptica (PSD) rappresentino un meccanismo cellulare per l'apprendimento e la memoria. Palmitoylation regola la localizzazione e la funzione di molte proteine sinaptiche tra cui AMPA-R, fattori ausiliari e scaffold sinaptici in modo dipendente dall'attività. Abbiamo identificato la famiglia di geni indotti a differenziazione delle sinapsi (SynDIG) di quattro geni (SynDIG1-4) che codificano le proteine transmembrane specifiche del cervello che si associano agli AMPAR e regolano la forza della sinapsi. SynDIG1 è palmitoylated a due residui di cisteina situati nelle posizioni 191 e 192 nella regione juxta-transmembrane importante per lo sviluppo di sinapsi eccitatoria dipendenti dall'attività. Qui, descriviamo un approccio biochimico innovativo, l'analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse e dimostrare la sua utilità con la famiglia SynDIG di proteine in lisato cerebrale del topo.
Introduction
S-palmitoylation è una modifica post-traduzionale reversibile delle proteine bersaglio che regola l'associazione stabile della membrana, il traffico di proteine e le interazioni proteina-proteina1. Si tratta dell'aggiunta di una moiety di palmitato di 16 carbonio ai residui di cisteina tramite il collegamento di tioester catalizzato da enzimi palmitoyl acyltransferasi (PAT). Molte proteine sinaptiche nel cervello sono palmitoylated, tra cui AMPA-Rs e PSD-95, in modo dipendente dall'attività per regolare la stabilità, localizzazione, e la funzione2,3,4. Alterazioni dei livelli di AMPAR sinaptici nel PSD attraverso l'interazione di fattori ausiliari con scaffold sinaptici come PSD-95 sono alla base della plasticità sinaptica; pertanto, i metodi per determinare lo stato di palmitoylation delle proteine sinaptiche forniscono importanti informazioni sui meccanismi della plasticità sinaptica.
In precedenza, abbiamo identificato la famiglia SynDIG di quattro geni (SynDIG1-4) che codificano proteine transmembrane specifiche del cervello che si associano agli AMPAR5. La sovraespressione o l'abbattimento di SynDIG1 nei neuroni ippocampali di ratto dissociati aumenta o diminuisce, rispettivamente, la dimensione e il numero della sinapsi AMPA-R del 50% come rilevato utilizzando l'immunocitochimica e l'elettrofisiologia5 . Abbiamo utilizzato il saggio Acyl-biotin exchange (ABE) per dimostrare che SynDIG1 è palmitoylated a due residui di Cis axta-transmembrana conservati (trovati in tutte le proteine SynDIG) in modo dipendente dall'attività per regolare la stabilità, la localizzazione e la funzione6. Il test ABE si basa sullo scambio di biotina su cistein protetti dalla modifica e dalla successiva purificazione dell'affinità7. Qui, descriviamo un approccio biochimico innovativo, il acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay8,9,10,11,12, che non richiede la purificazione dell'affinità e utilizza invece cambiamenti nella mobilità del gel per determinare il numero di modifiche per una proteina di interesse. Il protocollo è descritto per lo studio delle proteine della membrana endogena dal cervello del topo per il quale sono disponibili anticorpi adatti.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali hanno seguito le linee guida stabilite dai National Institutes of Health (NIH) e sono state approvate dal Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università della California, Davis.
1. Preparazione delle membrane cerebrali del topo
- Decapitare il mouse utilizzando un apparato di ghigliottina e sezionare rapidamente il cervello (in <1 min, se possibile, per ridurre al minimo i cambiamenti di palmitoylation che possono verificarsi durante la procedura di dissezione). Omogeneizzare immediatamente in 10 mL di buffer di omogeneizzazione (Tabella 1) in un omogeneizzatore di vetro (12 colpi) sul ghiaccio.
- Centrifuga lisa per 15 min a 1.400 x g a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo sul ghiaccio. Risospendere il pellet (6 colpi) in un volume uguale di buffer di omogeneizzazione e centrifugare a 710 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Unire i supernatanti dal punto 1.2 e centrifugare a 40.000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi.
- Eliminare il supernatante (frazione citosolica) e risospendere la frazione di membrana pellettata (P2) nel buffer di omogeneizzazione.
NOTA: I campioni possono essere congelati flash e conservati a -80 gradi centigradi per un uso successivo. - Eseguire un saggio di acido bicinchoninico (BCA) per quantificare i livelli di proteine. Per il saggio APEGS, iniziare con una proteina da 100-200 mg (massimo 250 mg) in un volume di 470 -L di tampone A (tabella 1)in un tubo da 1,5 mL. Sonicare e centrifugare a >13,000 x g per 10 min a 25 s per rimuovere le proteine insolubili. Trasferire le proteine solubilizzate in un nuovo tubo da 1,5 mL.
2. Acyl-PEGyl exchange gel-shift (APEGS) assay
- Interrompere i legami disulfide e bloccare i cistein liberi.
- Interrompere i legami disulfide incubando in 25 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP; 25 -L, aggiunto da una soluzione di stock; Tabella 1) per 60 min a 55 gradi centigradi.
- Bloccare i cistein liberi con 50 mM N-ethylmaleimide (NEM; 12,5 l, aggiunto da una soluzione di stock; Tabella 1) a temperatura ambiente per 3 h.
NOTA: la reazione può essere estesa durante la notte.
- Eseguire la precipitazione del metanolo cloroformio (CM).
- Trasferire la soluzione proteica da tubo da 1,5 mL a un tubo di polipropilene o vetro che può essere centrifugato in un rotore a benna oscillante a velocità modesta. Un tubo da 5 mL è l'ideale. Aggiungere brevemente quattro volumi (2 mL) di metanolo (MeOH) e vortice.
- Aggiungere brevemente due volumi (1 mL) di cloroformio e vortice.
- Aggiungere brevemente tre volumi (1,5 mL) di dH2O e vortice.
- Centrifugare i campioni a 3.000 x g per 30 min a 25 gradi centigradi in un rotore a benna oscillante.
- Rimuovere e scartare con attenzione la fase superiore.
- Aggiungere 3 volumi (1,5 mL) di MeOH e mescolare delicatamente ma accuratamente, facendo attenzione a non frammentare la frittella proteica opaca.
- Centrifuga a 3.000 x g per 10 min a 25 gradi centigradi in un rotore a benna oscillante.
- Utilizzando un pipet sierologico di vetro, rimuovere la maggior parte della fase superiore possibile senza disturbare la frittella proteica.
- Risciacquare con cura il pellet con 1 mL di MeOH.
- Asciugare a secco il pellet per almeno 10 min.
NOTA: Il pellet essiccato può essere conservato a -20 gradi centigradi.
- Eseguire la scissione dei collegamenti palmitoyl-thioester con l'idrossilamina (NH2OH, HAM).
- Risospendere il precipitato proteico in 125 - L di tampone A e sonicare brevemente. Centrifuga a >13,000 x g per 10 min a 25 gradi centigradi per rimuovere il materiale insolubile. Trasferire le proteine solubilizzate in un nuovo tubo da 1,5 mL.
- Aggiungere 375 l di tampone H (HAM; Tabella 1) o buffer T (HAM-; Tabella 1) e incubare i campioni per 60 min a 25 .
- Ripetere la precipitazione CM descritta nel passaggio 2.2.
NOTA: Il pellet essiccato può essere conservato a -20 gradi centigradi. - Aggiungere mPEG acistein non protetti.
- Risospendere il pellet in 100 litri di buffer A contenente 10 mM TCEP. Trasferire su un tubo da 1,5 mL.
NOTA: È normale che si sia verificata una significativa perdita di proteine durante le fasi di precipitazione della CM. Tutti i passaggi successivi saranno eseguiti in un tubo da 1,5 mL, vincolando il volume di proteine ad un massimo di 120.130 . Questo ridurrà la perdita di proteine durante le precipitazioni CM finali. - Aggiungere 20 mPEG-5k (25 l, aggiunto da una soluzione di stock; Tabella 1) campione e mescolare le proteine pipettando. Incubare per 60 min a 25 gradi centigradi con rotazione end-over-end.
- Per rimuovere mPEG-5k non incorporato, eseguire la precipitazione CM come descritto al punto 2.2 utilizzando questi volumi regolati: 4 volumi di MeOH (500 , 2 volumi di cloroformio (250 ) e 3 volumi di dH2O (375 L). Centrifuga a >13,000 x g per 10 min a 25 gradi centigradi.
- Rimuovere con attenzione la fase superiore come prima, evitando la spessa frittella flocculenta. Aggiungere 1 mL di MeOH e mescolare delicatamente ma accuratamente. Centrifuga a >13,000 x g per 10 min a 25 gradi centigradi.
- Rimuovere con cura il supernatante e sciacquare il pellet con 1 mL di MeOH. Centrifuga a >13,000 x g per 10 min a 25 gradi centigradi. Pellet secco all'aria.
NOTA: Il pellet essiccato può essere conservato a -20 gradi centigradi. - Risospendere il pellet essiccato in 50 o l of tampone A (senza TCEP o qualsiasi agente di riduzione). Riserva 5 L per la quantificazione della proteina BCA. Dopo la quantificazione, aggiungere una quantità appropriata di tampone di 4x Laemmli e, a seconda della proteina di interesse, riscaldare potenzialmente il campione a 70-100 gradi centigradi per 10 minuti.
NOTA: L'ebollizione può causare l'aggregazione di alcune proteine della membrana.
- Risospendere il pellet in 100 litri di buffer A contenente 10 mM TCEP. Trasferire su un tubo da 1,5 mL.
3. Analisi macchia occidentale delle proteine PEGylated
- Caricare il campione su un gel di elettroforresi gel (SDS-PAGE) di sodio dodecyl13.
NOTA: In questo protocollo è stato utilizzato 10% di poliacrilammide. - Utilizzare protocolli standard di separazione, trasferimento e rilevamento per il blotting occidentale14.
- Utilizzare densitometria14 per determinare le quantità relative di proteine PEGylated e nonPEGylated.
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Representative Results
L'immunoblorazione con anticorpi contro la proteina di interesse rivela lo stato palmitoylated (non, subente, doppiamente, ecc.) in lisa cervelli di topo come determinato da spostamento di mobilità rispetto a campioni in cui HAM non era incluso. In precedenza, avevamo dimostrato che SynDIG1 era palmitoylated in due siti utilizzando il asdetto ABE6; tuttavia, non siamo riusciti a determinare se entrambi i siti sono stati modificati nel tessuto cerebrale. Qui mostriamo che SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 e Prrt2 sono palmitoylated nel cervello del topo e che hanno due potenziali siti di palmitoylation (Figura 1). È interessante notare che ogni proteina ha uno stato di palmitoylazione diverso nel cervello del topo in base al segnale per la proteina non, puntuale e doppiamente palmitoylated. L'analisi Densitometria delle macchie fornisce informazioni quantitative sullo stato palmitoylated.
Figura 1: Rilevamento di specie proteiche PEGylated nei preparati a membrana murinale. I cervelli dei topi sono stati sezionati rapidamente e omogeneizzati immediatamente. Le frazioni di membrana P2 sono state sottoposte all'analisi degli APiEG come descritto in questo protocollo. In questo esperimento, il giorno postnatale 18 (P18) sono stati separati utilizzando un gel SDS-PAGE del 10% e immunoblotted e sondato con anticorpi contro SynDIG1 (SD1), Prrt2 e SynDIG4 (SD4). I simboli indicano una proteina che non è palmitoylated, palmitoylated subente ('), o doppiamente.'. La presenza di bande deboli nelle condizioni HAM (-) indica una riduzione incompleta dei legami disulfidi o il blocco incompleto dei cistein e cistein liberi da parte di NEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer | Componenti | Lavoro conc. | Commenti |
| Omogeneizzazione | 0,32 M di saccarosio, 1 mM Tris pH 7.2, 1 mM MgCl2 | Aggiungere gli inibitori di PMSF e proteasi immediatamente prima dell'uso. | |
| Buffer A | PBS pH 7,2, 5 mM EDTA, 4% SDS (w/v) | Aggiungere gli inibitori di PMSF e proteasi immediatamente prima dell'uso. | |
| Soluzione TCEP | 500 mM TCEP in ddH2O (pH 7.2) | 25 mM | Aggiungere 10 N NaOH per aumentare il pH. |
| Soluzione NEM | 2,0 M NEM in 100% etanolo | 50mm | Preparatevi freschi. |
| Buffer H (HAM) | 1,33 M HAM, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (w/v) | 1,0 M | Preparatevi freschi. |
| Buffer T (HAM-) | 1,33 M Tris-HCl, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 (w/v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k in ddH2O | 20 mM | Mescolare bene. Altamente viscoso. |
Tabella 1: Soluzioni utilizzate per il saggio APEGS. Buffer di omogeneizzazione e buffer A possono essere preparati in anticipo; tuttavia, aggiungere gli inibitori della proteasi e il fluoruro fenilmethylsulfonyl (PMSF) immediatamente prima dell'uso. Tutte le altre soluzioni devono essere preparate fresche.
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Discussion
Nel nostro lavoro precedente, abbiamo utilizzato il saggio ABE per dimostrare che SynDIG1 è palmitoylated a due residui di Cis axta-transmembrana conservati (che si trovano in tutte le proteine SynDIG) in modo dipendente dall'attività per regolare la stabilità, la localizzazione e la funzione6. Una limitazione è che l'analisi ABE richiede la purificazione dell'affinità con resine agarose coniugate alle moieties avidin e che come fase finale della procedura, con conseguente significativa perdita di segnale che complica l'analisi quantitativa. Inoltre, il saggio ABE non può distinguere se una proteina è palmitoylated una volta o in più siti.
Qui usiamo il saggio APEGS8,9,10,11,12 per determinare lo stato di palmitoylation delle proteine transmembrane ausiliarie AMPAR SynDIG1 e le relative proteine SynDIG4 (noto anche come Prrt1) e Prrt2 da estratti cerebrali di topo; tuttavia, il saggio può essere applicato a qualsiasi proteina della membrana per la quale è disponibile un anticorpo di alta qualità e specifico adatto per il gonfiore occidentale. L'uso di membrane cerebrali da topi di tipo selvaggio (WT) e knockout (KO) fornisce un controllo ideale per la specificità degli anticorpi, come abbiamo dimostrato per gli anticorpi contro SynDIG115 e SynDIG416. Esecuzione del saggio APEGS con lisaceri cerebrali da wT e KO topi fornisce un controllo importante per la specificità degli anticorpi in questo metodo. Questo metodo potrebbe essere applicato anche a diverse frazioni di membrana ottenute tramite centrifugazione differenziale seguita dal saggio APEGS per studiare la localizzazione subcellulare della proteina di interesse.
Una fase critica del test APEGS è precipitazioni CM, il cui scopo è quello di rimuovere le sostanze chimiche (NEM e HAM) di interferire con le successive reazioni a valle. Anche se è possibile eseguire precipitazioni CM in un tubo da 1,5 mL, l'uso di tubi e volumi più grandi dovrebbe produrre risultati più ottimali. Allo stesso tempo, in parte a causa delle precipitazioni multiple di CM, ci si dovrebbe aspettare una sostanziale perdita di proteine dall'inizio alla fine. Ciò potrebbe comportare un'apparente variabilità nei livelli totali di proteine nelle condizioni meno e plus HAM.
Come illustrato nella Figura 1, l'aggiunta di mPEG-5k (5 kDa) non produce necessariamente uno spostamento lineare su un immunoblot. Questo può avere vantaggi nella risoluzione di proteine che sono palmitoylated in più siti. Inoltre, la presenza di bande nei luoghi di spostamento della mobilità nelle condizioni negative HAM indica una riduzione incompleta dei legami disulfidi o un blocco incompleto dei cistein liberi da parte di NEM. In alternativa, apparenti bande spostate nella condizione negativa HAM potrebbero indicare che i cistein liberi all'interno di una particolare proteina sono difficili da bloccare. Pertanto, potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione della fase di blocco se solo una piccola percentuale della proteina totale è palmitoylated in contrasto con SynDIG1, SynDIG4 e Prrt2 in cui la maggior parte della proteina è o sfusa o doppiamente palmitylated (Figura 1).
Questo metodo non è limitato a lismi cervello topo. Ad esempio, questo metodo è stato utilizzato per lo screening per gli enzimi depalmitoylating per PSD-95 espressi in cellule eterologie9. L'espressione delle proteine nelle cellule eterologie consente anche di determinare l'esatto sito di modifica attraverso la mutagenesi diretta dal sito. Questo metodo ha anche informato il ruolo dell'impalcatura sinaptica AKAP150 nella plasticità sinaptica17,18, dimostrando un'ampia applicazione nelle neuroscienze.
È importante notare che il saggio APEGS non è esclusivo di moieties palmitate 16-carbonio come l'analisi rileverà altri collegamenti acillo grasso a catena lunga che sono soggetti a scissione e sostituzione da mPEG. Per stabilire la modifica del palmitato in modo conclusivo richiede ulteriori sperimentazioni come l'etichettatura metabolica con palmitato tritiated.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano K. Woolfrey per consigli e contributi sul saggio APEGS. Questi studi sono stati finanziati da sovvenzioni di ricerca per l'EdS della Whitehall Foundation e del NIH-NIMH (1R01MH1119347).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
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