Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ

Published: March 29, 2020 doi: 10.3791/61018
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology, UC Davis School of Medicine

Summary

البالميتويلية ينطوي على دمج البالميتات 16 الكربون moiety لمخلفات السيستين من البروتينات المستهدفة بطريقة قابلة للعكس. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين من الفائدة في تحلل الدماغ الماوس.

Abstract

ويعتقد أن التعديلات التي تعتمد على النشاط في مستويات مستقبلات AMPA متشابك (AMPARs) داخل كثافة postynaptic (PSD) تمثل آلية خلوية للتعلم والذاكرة. البمنية ينظم توطين وظيفة العديد من البروتينات متشابك بما في ذلك AMPA-Rs, العوامل المساعدة وسقالات متشابك بطريقة تعتمد على النشاط. حددنا التمايز المتسبب في المشبك (SynDIG) الأسرة من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغ محددة التي ترتبط مع AMPARs وتنظيم قوة المشبك. SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا السيستين تقع في موقفين 191 و 192 في منطقة التجاور عبر الغشاء المهم لتطوير المشبك مثير يعتمد على النشاط. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين الفائدة وإظهار فائدتها مع عائلة SynDIG من البروتينات في تحلل الدماغ الماوس.

Introduction

S-palmitoylation هو تعديل عكسها بعد الترجمة من البروتينات المستهدفة التي تنظم الارتباط غشاء مستقر، والاتجار البروتين، والتفاعلات البروتين والبروتين1. وهو ينطوي على إضافة البالميتات 16 الكربون moiety إلى بقايا السيستين عبر ربط ثيويستر حفز هاميسمنس البالميتوسيل acyltransferase (بات) الإنزيمات. العديد من البروتينات متشابك في الدماغ هي palmitoylated، بما في ذلك AMPA-Rs و PSD-95، بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، والتعريب، وظيفة2،3،4. التعديلات في مستويات AMPARs متشابك في PSD عن طريق التفاعل بين العوامل المساعدة مع السقالات متشابك مثل PSD-95 يكمن اللدونة متشابك; وبالتالي ، فإن طرق تحديد حالة palmitoylation من البروتينات متشابك يوفر نظرة ثاقبة هامة في آليات اللدونة متشابك.

في السابق ، حددنا عائلة SynDIG من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغي المحددة التي ترتبط مع AMPARs5. الإفراط في التعبير أو ضرب أسفل SynDIG1 في الخلايا العصبية فرس النهر الفئران المنفصلة يزيد أو يقلل، على التوالي، AMPA-R حجم الاشتباك العصبي وعدد من قبل ~ 50٪ كما تم الكشف عنها باستخدام الكيمياء المناعية والفيزيولوجيا الكهربائية5. لقد استعينا في تبادل acyl-biotin (ABE) للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا Cys التجاور يُحفظ (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار والتوطين والوظيفة6. يعتمد ازى ABE على تبادل البيوتين على السيستين اتى محمية بالتعديل وتنقية التقارب اللاحقة7. هنا، ونحن نصف نهج البيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويلهلام تبادل (APEGS) كمية88،9،,10،,11،,12،والتي لا تتطلب تنقية تقارب وبدلا من ذلك يستخدم التغييرات في التنقل هلام لتحديد عدد من التعديلات لبروتين الفائدة. يوصف البروتوكول للتحقيق في بروتينات الأغشية الذاتية من دماغ الماوس التي تتوفر لها أجسام مضادة مناسبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات الحيوانية المبادئ التوجيهية التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا، ديفيس.

1. إعداد أغشية الدماغ الماوس

  1. قطع رأس الماوس باستخدام جهاز المقصلة وتشريح الدماغ بسرعة (في < 1 دقيقة، إذا كان ذلك ممكنا، للحد من التغيرات palmitoylation التي قد تحدث أثناء إجراء تشريح). التجانس على الفور في 10 مل من التجانس عازلة(الجدول 1)في التجانس الزجاج (~ 12 السكتات الدماغية) على الجليد.
  2. جهاز الطرد المركزي يصل إلى 15 دقيقة عند 1400 × غرام عند 4 درجات مئوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد على الجليد. إعادة تعليق بيليه (~ 6 السكتات الدماغية) في حجم متساو من العازلة التجانس والطرد المركزي في 710 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  3. الجمع بين المواد الخارقة من الخطوة 1.2 والطرد المركزي في 40،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  4. تجاهل supernatant (الكسر الخلوي) وإعادة تعليق غشاء بيليه (P2) كسر في التجانس المخزن المؤقت.
    ملاحظة: يمكن تجميد العينات وتخزينها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقًا.
  5. إجراء حمض بيينكدونينيك (BCA) فحص لكميات مستويات البروتين. بالنسبة للفحص APEGS، ابدأ ببروتين 100-200 ملغ (بحد أقصى 250 ملغ) في حجم 470 ميكرولتر من المخزن المؤقت A(الجدول 1)في أنبوب 1.5 مل. سونيكات والطرد المركزي في > 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 25 درجة مئوية لإزالة البروتين غير قابل للذوبان. نقل البروتين السفولوبيلية إلى أنبوب جديد 1.5 مل.

2. Acyl-PEGyl تبادل هلام التحول (APEGS) saysay

  1. تعطيل سندات الكبريتيد ومنع السيستينات الحرة.
    1. تعطيل سندات الكبريتيد عن طريق احتضان في 25 mm tris (2-carboxyethyl) فوسفين (TCEP; 25 ميكرولتر, وأضاف من محلول الأسهم; الجدول 1) لمدة 60 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
    2. كتلة السيستينات الحرة مع 50 mM N-ethylmaleimide (NEM; 12.5 ميكرولتر, وأضاف من محلول الأسهم; الجدول 1) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة.
      ملاحظة: يمكن تمديد رد الفعل بين عشية وضحاها.
  2. إجراء هطول الأمطار الميثانول الكلوروفورم (CM).
    1. نقل محلول البروتين من أنبوب 1.5 مل إلى أنبوب البولي بروبلين أو الزجاج التي يمكن طردها المركزي في دوار دلو يتأرجح بسرعة متواضعة. أنبوب 5 مل مثالية. إضافة أربعة مجلدات (2 مل) من الميثانول (MeOH) والدوامة لفترة وجيزة.
    2. إضافة مجلدين (1 مل) من الكلوروفورم والدوامة لفترة وجيزة.
    3. إضافة ثلاثة مجلدات (1.5 مل) من dH2O والدوامة لفترة وجيزة.
    4. طرد العينات في 3000 × ز لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية في دوار دلو يتأرجح.
    5. إزالة بعناية وتجاهل المرحلة العليا.
    6. أضف 3 مجلدات (1.5 مل) من MeOH واخلط بلطف ولكن بدقة ، مع الحرص على عدم تجزئة فطيرة البروتين المبهمة.
    7. الطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 10 دقيقة في 25 درجة مئوية في دوار دلو يتأرجح.
    8. باستخدام أنبوب مصلي زجاجي، وإزالة أكبر قدر من المرحلة العليا ممكن دون إزعاج فطيرة البروتين.
    9. شطف بعناية بيليه مع 1 مل من MeOH.
    10. يجفف الهواء البيليه لمدة 10 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه المجفف ة عند -20 درجة مئوية.
  3. تنفيذ انشقاق من وصلات palmitoyl-thioester مع هيدروكسيلامين (NH2OH, HAM).
    1. إعادة تعليق البروتين عجل في 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت A وسونيكات لفترة وجيزة. الطرد المركزي في > 13,000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية لإزالة المواد غير القابلة للذوبان. نقل البروتين السفولوبيلية إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    2. إضافة 375 ميكرولتر من المخزن المؤقت H (HAM+; الجدول 1) أو T المخزن المؤقت (HAM-; الجدول 1) وعينات الاحتضان لمدة 60 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  4. كرر هطول الأمطار CM الموصوفة في الخطوة 2.2.
    ملاحظة: يمكن تخزين بيليه المجفف ة عند -20 درجة مئوية.
  5. إضافة mPEG إلى السيستينات غير المحمية.
    1. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت A التي تحتوي على 10 mM TCEP. نقل إلى أنبوب 1.5 مل.
      ملاحظة: من الطبيعي أن يحدث فقدان كبير للبروتين خلال خطوات هطول الأمطار CM. سيتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في أنبوب 1.5 مل، مما يحد من حجم البروتين إلى حد أقصى 120-130 ميكرولتر. وهذا سوف يقلل من فقدان البروتين خلال هطول الأمطار CM النهائي.
    2. إضافة 20 mM mPEG-5k (25 ميكرولتر، وأضاف من محلول الأسهم؛ الجدول 1) لعينة البروتين وتخلط عن طريق الأنابيب. احتضان لمدة 60 دقيقة في 25 درجة مئوية مع نهاية على نهاية التناوب.
    3. لإزالة mPEG-5k غير المدمجة، قم بإجراء هطول الأمطار CM كما هو موضح في الخطوة 2.2 باستخدام هذه الأحجام المعدلة: 4 مجلدات من MeOH (500 ميكرولتر)، ومجلدين من الكلوروفورم (250 ميكرولتر)، و3 مجلدات من dH2O (375 ميكرولتر). الطرد المركزي في > 13,000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    4. إزالة بعناية المرحلة العليا كما كان من قبل، وتجنب سميكة، فطيرة flocculent. إضافة 1 مل من MeOH وتخلط بلطف ولكن بدقة. الطرد المركزي في > 13,000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    5. إزالة بعناية supernatant وشطف بيليه مع 1 مل من MeOH. الطرد المركزي في > 13,000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية. الهواء بيليه الجافة.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه المجفف ة عند -20 درجة مئوية.
    6. إعادة تعليق بيليه المجففة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (دون TCEP أو أي عامل الحد). احجز 5 ميكرولتر لكمية بروتين BCA. بعد الكمية، أضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت عينة 4x Laemmli، واعتمادا على البروتين ذات الأهمية، يحتمل تسخين العينة إلى 70-100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: قد يسبب الغليان تجميع بعض بروتينات الغشاء.

3. تحليل لطخة الغربية من البروتينات PEGylated

  1. تحميل العينة على كبريتات الصوديوم dodecyl polyacrylamide هلام electrophoresis (SDS-PAGE) هلام13.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول تم استخدام 10٪ polyacrylamide.
  2. استخدام بروتوكولات الفصل والنقل والكشف القياسية للنشاف الغربي14.
  3. استخدام قياس الكثافة14 لتحديد الكميات النسبية من البروتينات PEGylated مقابل البروتينات غير PEPEGylated.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunoblotting مع الأجسام المضادة ضد البروتين من الفائدة يكشف عن حالة palmitoylated (غير ، singly ، doublly ، الخ) في تحليل الدماغ الماوس كما يحددها تحول التنقل مقارنة مع العينات التي لم يتم تضمين HAM. سابقا، كنا قد أظهرت أن SynDIG1 كان palmitoylated في موقعين باستخدام ABE اساي6. ومع ذلك، لم نتمكن من تحديد ما إذا كان كلا الموقعين قد تم تعديلهما في أنسجة الدماغ. هنا نظهر أن SynDIG1 ، SynDIG4/Prrt1 ، وPrrt2 هي palmitoylated في دماغ الماوس وأن لديهم اثنين من مواقع البهيتول المحتملة(الشكل 1). ومن المثير للاهتمام، كل بروتين لديه حالة النخيل مختلفة في الدماغ الماوس على أساس إشارة لغير، بشكل جيد ومضاعف البروتين palmitoylated. تحليل قياس الكثافة من البوات يوفر معلومات كمية حول حالة palmitoylated.

Figure 1
الشكل 1: الكشف عن أنواع البروتين PEGylated في الاستعدادات غشاء الماوس. تم تشريح أدمغة الماوس بسرعة وتجانسها على الفور. خضعت كسور غشاء P2 إلى السهو APEGs كما هو موضح في هذا البروتوكول. في هذه التجربة، تم فصل يوم ما بعد الولادة 18 (P18) باستخدام جل SDS-PAGE 10٪ ومناعة وبحثت مع الأجسام المضادة ضد SynDIG1 (SD1) وPrrt2 و SynDIG4 (SD4). تشير الرموز إلى البروتين الذي لا يُغب (•)، أو البهفيلي (*)، أو مضاعف (**). وجود عصابات خافتة في شروط HAM (-) يشير إما إلى انخفاض غير كامل لسندات الكبريتيد أو انسداد غير كامل للسيستينات الحرة من قبل NEM. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المخزن المؤقت مكونات عمل الـ(كون) تعليقات
التجانس 0.32 M السكروز، 1 mM تريس درجة الحموضة 7.2، 1 mM MgCl2 أضف مثبطات PMSF وبروتياز قبل الاستخدام مباشرة.
المخزن المؤقت أ PBS درجة الحموضة 7.2، 5 mM EDTA، 4٪ SDS (ث / v) أضف مثبطات PMSF وبروتياز قبل الاستخدام مباشرة.
حل TCEP 500 mM TCEP في ddH2O (درجة الحموضة 7.2) 25 متر مربع إضافة 10 N NaOH لزيادة درجة الحموضة.
حل NEM 2.0 M NEM في الإيثانول 100٪ 50 متر متر تحضير الطازجة.
المخزن المؤقت H (HAM+) 1.33 M HAM، درجة الحموضة 7.0، 5 mM EDTA، 0.2٪ تريتون X-100 (ث/v) 1.0 متر تحضير الطازجة.
المخزن المؤقت T (HAM-) 1.33 M Tris-HCl، درجة الحموضة 7.0، 5 mM EDTA، 0.2٪ تريتون X-100 (ث/ v)
mPEG-5k 100 mM mPEG-5k في ddH2O 20 متر متر مربع تخلط جيدا. لزج للغاية.

الجدول 1: الحلول المستخدمة في القول بـ APEGS. يمكن إعداد المخزن المؤقت التجانس والمخزن المؤقت A في وقت مسبق; ومع ذلك، إضافة مثبطات البروتياز والفينيل ميثيل سولفونيل فلوريد (PMSF) مباشرة قبل الاستخدام. وينبغي إعداد جميع الحلول الأخرى طازجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في عملنا السابق، استعملنا في ABE للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من المخلفات السّيّز ة التجاور المُحافظ عليها (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، التوطين، والوظيفة6. وهناك قيد هو أن مقافي ABE يتطلب تنقية تقارب مع راتنجات agarose مترافقة مع مويزات avidin كخطوة نهائية في الإجراء ، مما أدى إلى فقدان كبير للإشارة التي تعقد التحليل الكمي. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن يميز saysay ABE ما إذا كان البروتين هو palmitoylated مرة واحدة أو في مواقع متعددة.

هنا نستخدم APEGS القول8,9,10,11,12 لتحديد حالة palmitoylation من البروتينات عبر الغشاء المساعد AMPAR SynDIG1 والبروتينات ذات الصلة SynDIG4 (المعروف أيضا باسم Prrt1) وPrrt2 من مستخلصات الدماغ الماوس; ومع ذلك ، يمكن تطبيق الفحص على أي بروتين غشاء يتوفر له جسم مضاد عالي الجودة ومحدد مناسب للنشاف الغربي. استخدام أغشية الدماغ من نوع البرية (WT) وخروج المغلوب (KO) الفئران يوفر التحكم المثالي لخصوصية الأجسام المضادة كما أظهرنا للأجسام المضادة ضد SynDIG115 و SynDIG416. إجراء القول APEGS مع الليسات الدماغ من WT وKO الفئران يوفر سيطرة هامة لخصوصية الأجسام المضادة في هذه الطريقة. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على كسور غشاء مختلفة تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي التفاضلية تليها APEGS القول للتحقيق في توطين تحت الخلية من البروتين الفائدة.

إحدى الخطوات الحرجة من قياس APEGS هي هطول الأمطار CM ، والغرض منها هو إزالة المواد الكيميائية (NEM و HAM) من التدخل في ردود الفعل اللاحقة في المصب. على الرغم من أنه من الممكن إجراء هطول الأمطار CM في أنبوب 1.5 مل، واستخدام أنابيب أكبر وكميات ينبغي أن تسفر عن نتائج أكثر مثالية. في الوقت نفسه ، ويرجع ذلك جزئيا إلى هطول الأمطار CM متعددة ، ينبغي للمرء أن يتوقع خسارة كبيرة من البروتين من البداية إلى النهاية. وهذا قد يؤدي إلى تقلب واضح في مستويات البروتين الإجمالي في ظروف نقص وزائد HAM.

كما هو موضح في الشكل 1، فإن إضافة mPEG-5k (5 كيلو) لا تنتج بالضرورة تحولًا خطيًا على المناعي. هذا يمكن أن يكون لها مزايا في حل البروتينات التي هي palmitoylated في مواقع متعددة. وعلاوة على ذلك، فإن وجود نطاقات في مواقع التحول الحركي في الظروف السلبية لـ HAM يشير إما إلى انخفاض غير كامل في سندات الكبريتيد أو إلى انسداد غير كامل للسيستينات الحرة من قبل NEM. بدلا من ذلك، قد العصابات تحول واضح في حالة لحم الخنزير السلبية تشير إلى أن السيستينات الحرة داخل بروتين معين من الصعب منعها. وبالتالي ، قد تكون هناك حاجة إلى تحسين إضافي لخطوة الحجب إذا كانت نسبة صغيرة فقط من إجمالي البروتين هي palmitoylated على النقيض من SynDIG1 ، SynDIG4 ، وPrrt2 حيث غالبية البروتين إما بشكل سيني أو مضاعف(الشكل 1).

لا تقتصر هذه الطريقة على عمليات التليس في دماغ الماوس. على سبيل المثال، وقد استخدمت هذه الطريقة لفحص لإنزيمات depalmitoylating لPSD-95 أعرب في الخلايا غير المتجانسة9. التعبير عن البروتينات في الخلايا غير المتجانسة يسمح أيضا لتحديد الموقع الدقيق للتعديل عن طريق موقع الطفرات الموجهة. وقد أبلغت هذه الطريقة أيضا دور السقالة متشابك AKAP150 في اللدونة متشابك17,18,مما يدل على تطبيق واسع في علم الأعصاب.

من المهم أن نلاحظ أن القول APEGS ليست حصرية ل16 الكربون palmitate moieties كما أن ازه ستكشف عن غيرها من الروابط acyl السلسلة الطويلة التي تخضع للانشقاق والاستعاضة عن mPEG. لإنشاء تعديل palmitate يتطلب بشكل قاطع تجارب إضافية مثل وضع العلامات الأيضية مع النخيل الثلاثي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر ك. Woolfrey للحصول على المشورة والمدخلات على APEGS اقولها. تم تمويل هذه الدراسات من خلال منح بحثية لـ E.D. من مؤسسة وايتهول وNIH-NIMH (1R01MH119347).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydroxylamine (HAM) ThermoFisher 26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) NOF ME-050MA MW ~5000 kDa
Microfuge Eppendorf 5415R or equivalent equipment
N-ethylmalemide (NEM) Calbiochem 34115 Highly toxic.
Optical imager for densitometry Azure Biosystems Sapphire Biomolecular Imager or equivalent equipment
Polypropylene tubes with cap Fisher Scientific 14-956-1D
Serological pipets (glass) Fisher Scientific 13-678-27D
Table top centrifuge Beckman Allegra X-15R or equivalent equipment
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) EMD Millipore 580560

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
  2. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
  3. Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
  4. Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
  5. Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
  6. Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
  7. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
  8. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
  9. Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
  10. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
  11. Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
  12. Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
  14. Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
  15. Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
  16. Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
  17. Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
  18. Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).

Tags

الكيمياء الحيوية، القضية 157، الدماغ، المشبك، palmitoylation، مستقبلات AMPA، SynDIG1، SynDIG4، Prrt1، Prrt2، APEGS القول
Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Speca, D. J., Diaz, E. Acyl-PEGyl… More

Speca, D. J., Diaz, E. Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (157), e61018, doi:10.3791/61018 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter