Summary
La palmitoylación implica la incorporación de una mitad de palmitato de 16 carbonos a los residuos de cisteína de proteínas diana de una manera reversible. Aquí, describimos un enfoque bioquímico, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitoylación de cualquier proteína de interés en los cascos cerebrales de ratón.
Abstract
Alteraciones dependientes de la actividad en los niveles de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro de la densidad postsináptica (PSD) se cree que representan un mecanismo celular para el aprendizaje y la memoria. La palmitoylation regula la localización y la función de muchas proteínas sinápticas, incluyendo AMPA-R, factores auxiliares y andamios sinápticos de una manera dependiente de la actividad. Identificamos la familia de genes inducidos por la diferenciación de la sinapsis (SynDIG) de cuatro genes (SynDIG1-4) que codifican proteínas transmembranas específicas del cerebro que se asocian con los ACAR y regulan la fuerza de la sinapsis. SynDIG1 se palmitoylated en dos residuos de cisteína ubicados en las posiciones 191 y 192 en la región de la yuxta-transmembrana importante para el desarrollo de sinapsis excitatoria dependiente de la actividad. Aquí, describimos un enfoque bioquímico innovador, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitilación de cualquier proteína de interés y demostrar su utilidad con la familia de proteínas SynDIG en los cascos cerebrales de ratón.
Introduction
La S-palmitoylation es una modificación post-traduccional reversible de las proteínas diana que regula la asociación estable de membranas, el tráfico de proteínas y las interacciones proteína-proteína1. Implica la adición de una mitad de palmitato de 16 carbono a los residuos de cisteína a través del enlace tioéster catalizado por las enzimas palmitoyl acyltransferase (PAT). Muchas proteínas sinápticas en el cerebro son palmitoylated, incluyendo AMPA-Rs y PSD-95, de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización, y la función2,3,4. Las alteraciones en los niveles de LOS AFOR sinápticos en el PSD a través de la interacción de factores auxiliares con andamios sinápticos como el PSD-95 subyace en la plasticidad sináptica; por lo tanto, los métodos para determinar el estado de palmitoylación de las proteínas sinápticas proporcionan una visión importante de los mecanismos de plasticidad sináptica.
Anteriormente, identificamos la familia SynDIG de cuatro genes (SynDIG1-4) que codifican proteínas transmembranas específicas del cerebro que se asocian con los AmpARs5. La sobreexpresión o desmontaje de SynDIG1 en las neuronas del hipocampo de ratas disociadas aumenta o disminuye, respectivamente, el tamaño y el número de la sinapsis AMPA-R en un 50 % según se detecte mediante inmunocitoquímica y electrofisiología5. Utilizamos el ensayo de intercambio de acilina de acilo (ABE) para demostrar que SynDIG1 está palmitoylated en dos residuos conservados de Cys transmembrana yuxta (encontrados en todas las proteínas SynDIG) de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización y función6. El ensayo ABE se basa en el intercambio de biotina en cisteínas protegidas por la modificación y posterior purificación de afinidad7. Aquí, describimos un enfoque bioquímico innovador, el ensayo de cambio de gel de intercambio acyl-PEGyl (APEGS)8,9,10,11,12, que no requiere purificación de afinidad y en su lugar utiliza cambios en la movilidad del gel para determinar el número de modificaciones para una proteína de interés. El protocolo se describe para la investigación de proteínas de membrana endógenas del cerebro del ratón para los que se dispone de anticuerpos adecuados.
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Protocol
Todos los procedimientos de animales siguieron las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis.
1. Preparación de membranas cerebrales de ratón
- Decapitar el ratón usando un aparato de guillotina y diseccionar el cerebro rápidamente (en <1 min, si es posible, para minimizar los cambios de palmitoylación que pueden ocurrir durante el procedimiento de disección). Homogeneizar inmediatamente en 10 ml de tampón de homogeneización(Tabla 1) en un homogeneizador de vidrio (12 golpes) sobre hielo.
- Centrifugar los lysates durante 15 min a 1.400 x g a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo sobre hielo. Resuspenda el pellet (6 golpes) en un volumen igual de tampón de homogeneización y centrífuga a 710 x g durante 10 min a 4 oC.
- Combine los sobrenadores del paso 1.2 y centrífuga a 40.000 x g durante 20 min a 4 oC.
- Deseche el sobrenadante (fracción citosólica) y resuspenda la fracción de membrana peletada (P2) en el tampón de homogeneización.
NOTA: Las muestras pueden congelarse y almacenarse a -80 oC para su uso posterior. - Realizar un ensayo de ácido bicincino (BCA) para cuantificar los niveles de proteína. Para el ensayo APEGS, comience con una proteína de 100 a 200 mg (máximo 250 mg) en un volumen de 470 ml de tampón A(Tabla 1) en un tubo de 1,5 ml. Sonicar y centrifugar a >13.000 x g durante 10 min a 25oC para eliminar la proteína insoluble. Transfiera la proteína solubilizada a un nuevo tubo de 1,5 ml.
2. Ensayo de intercambio de gel de Acyl-PEGyl (APEGS)
- Interrumpe los enlaces de disulfuro y bloquea las cisteínas libres.
- Interrumpir los enlaces de disulfuro mediante la incubación en 25 mM tris(2-carboxiletyl)fosfina (TCEP; 25 l, añadido a partir de una solución de stock; Tabla 1) durante 60 min a 55oC.
- Bloquear las cisteínas libres de bloques con 50 mM de N-etilmaleimida (NEM; 12,5 l, añadidos a partir de una solución de stock; Tabla 1) a temperatura ambiente durante 3 h.
NOTA: La reacción se puede extender durante la noche.
- Realice precipitaciones de metanol de cloroformo (CM).
- Transfiera la solución proteica de un tubo de 1,5 ml a un tubo de polipropileno o de vidrio que se puede centrifugar en un rotor de cubo oscilante a una velocidad modesta. Un tubo de 5 ml es ideal. Agregue cuatro volúmenes (2 ml) de metanol (MeOH) y vórtice brevemente.
- Agregue brevemente dos volúmenes (1 ml) de cloroformo y vórtice.
- Agregue brevemente tres volúmenes (1,5 ml) de dH2O y vórtice.
- Centrifugar las muestras a 3.000 x g durante 30 min a 25 oC en un rotor de cucharón oscilante.
- Retire y deseche cuidadosamente la fase superior.
- Añadir 3 volúmenes (1,5 ml) de MeOH y mezclar suavemente pero a fondo, teniendo cuidado de no fragmentar el panqueque de proteína opaca.
- Centrífuga a 3.000 x g durante 10 min a 25oC en un rotor de cucharón oscilante.
- Usando una pipa serológica de vidrio, eliminar la mayor parte de la fase superior posible sin alterar el panqueque de proteína.
- Enjuague cuidadosamente el pellet con 1 ml de MeOH.
- Seque al aire el pellet durante al menos 10 min.
NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 oC.
- Realizar escote de enlaces palmitóilo-tioester con hidroxilamina (NH2OH, HAM).
- Resuspenda el precipitado proteico en 125 ml de tampón A y sonice brevemente. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC para eliminar el material insoluble. Transfiera la proteína solubilizada a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Añadir 375 sl de tampón H (HAM+; Tabla 1) o tampón T (HAM-; Tabla 1) e incubar muestras durante 60 min a 25oC.
- Repita la precipitación CM descrita en el paso 2.2.
NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 oC. - Añadir mPEG a las cisteas desprotegidas.
- Resuspenda el gránulo en 100 ml de tampón A que contenga 10 mM TCEP. Transfiera a un tubo de 1,5 ml.
NOTA: Es normal que se haya producido una pérdida significativa de proteína durante los pasos de precipitación de CM. Todos los pasos subsiguientes se realizarán en un tubo de 1,5 ml, limitando el volumen de proteína a un máximo de 120 a 130 l. Esto reducirá la pérdida de proteínas durante la precipitación final del CM. - Añadir 20 mM mPEG-5k (25 l, añadidos desde una solución de stock; Tabla 1) a la muestra de proteínas y mezclar por pipeteo. Incubar durante 60 min a 25oC con rotación de extremo sobre extremo.
- Para eliminar mPEG-5k no incorporado, realice la precipitación CM como se describe en el paso 2.2 utilizando estos volúmenes ajustados: 4 volúmenes de MeOH (500 l), 2 volúmenes de cloroformo (250 l) y 3 volúmenes de dH2O (375 ol). Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC.
- Retire cuidadosamente la fase superior como antes, evitando el panqueque grueso y floculante. Añadir 1 mL de MeOH y mezclar suavemente pero a fondo. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC.
- Retire cuidadosamente el sobrenadante y enjuague el pellet con 1 ml de MeOH. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC. Pellets secos al aire.
NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 oC. - Resuspenda el gránulo seco en 50 ml de tampón A (sin TCEP ni ningún agente reductor). Reservar 5 l para la cuantificación de proteínas BCA. Después de la cuantificación, añadir una cantidad adecuada de 4x Tampón de muestra de Laemmli y, dependiendo de la proteína de interés, potencialmente calentar la muestra a 70 o 100 oC durante 10 min.
NOTA: La ebullición puede causar la agregación de algunas proteínas de membrana.
- Resuspenda el gránulo en 100 ml de tampón A que contenga 10 mM TCEP. Transfiera a un tubo de 1,5 ml.
3. Análisis de manchas occidentales de proteínas PEGylated
- Cargue la muestra en un gel de electroforesis de gel de poliacrilamida dodecilo sulfato sódico (SDS-PAGE)13.
NOTA: En este protocolo se utilizó 10% poliacrilamida. - Utilice protocolos estándar de separación, transferencia y detección para western blotting14.
- Utilice densitometría14 para determinar las cantidades relativas de proteínas PEGylated frente a proteínas no PEGylated.
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Representative Results
La inmunoblotación con anticuerpos contra la proteína de interés revela el estado palmitilado (no, por separado, doblemente, etc.) en los efectos cerebrales del ratón según lo determinado por el cambio de movilidad en comparación con las muestras en las que no se incluyó el HAM. Anteriormente, habíamos demostrado que SynDIG1 estaba palmitoylated en dos sitios utilizando el ensayo ABE6; sin embargo, no pudimos determinar si ambos sitios fueron modificados en el tejido cerebral. Aquí mostramos que SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 y Prrt2 están palmitoylados en el cerebro del ratón y que tienen dos posibles sitios de palmitoylación(Figura 1). Curiosamente, cada proteína tiene un estado de palmitoylación diferente en el cerebro del ratón basado en la señal de la proteína no, solosa y doblemente palmitoylated. El análisis de densitometría de las manchas proporciona información cuantitativa sobre el estado palmitoylated.
Figura 1: Detección de especies de proteínas PEGylated en preparaciones de membranas de ratón. Los cerebros de los ratones se diseccionaron rápidamente y se homogeneizaron inmediatamente. Las fracciones de membrana P2 fueron sometidas al ensayo APEGs como se describe en este protocolo. En este experimento, el día postnatal 18 (P18) se separaron utilizando un gel 10% SDS-PAGE e inmunoblotted y sondeado con anticuerpos contra SynDIG1 (SD1), Prrt2 y SynDIG4 (SD4). Los símbolos indican proteínas que no están palmitoylated (•), palmitiladas por separado (*), o doblemente (**). La presencia de bandas tenues en las condiciones ham (-) indica una reducción incompleta de los enlaces de disulfuro o un bloqueo incompleto de cisteínas libres por Parte de NEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Búfer | Componentes | Trabajando conc. | Comentarios |
| Homogeneización | 0.32 M sacarosa, 1 mM Tris pH 7.2, 1 mM MgCl2 | Añadir inhibidores de la PMSF y la proteasa inmediatamente antes de su uso. | |
| Zona de influencia A | PBS pH 7,2, 5 mM EDTA, 4% SDS (w/v) | Añadir inhibidores de la PMSF y la proteasa inmediatamente antes de su uso. | |
| Solución TCEP | 500 mM TCEP en ddH2O (pH 7.2) | 25 mM | Agregue 10 N NaOH para aumentar el pH. |
| Solución NEM | 2.0 M NEM en etanol 100% | 50 mM | Prepárense frescos. |
| Zona de influencia H (HAM+) | 1.33 M HAM, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 (w/v) | 1.0 M | Prepárense frescos. |
| Búfer T (HAM-) | 1.33 M Tris-HCl, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 (w/v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k en ddH2O | 20 mM | Mezcla bien. Muy viscoso. |
Tabla 1: Soluciones utilizadas para el ensayo APEGS. El búfer de homogeneización y el búfer A se pueden preparar con antelación; sin embargo, añadir inhibidores de la proteasa y fluoruro de fenilmetilsulfonil (PMSF) inmediatamente antes de su uso. Todas las demás soluciones deben prepararse frescas.
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Discussion
En nuestro trabajo anterior, utilizamos el ensayo ABE para demostrar que SynDIG1 está palmitoylated en dos residuos conservados de Cys transmembrana yuxta (encontrados en todas las proteínas SynDIG) de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización y función6. Una limitación es que el ensayo ABE requiere purificación de afinidad con resinas de agarosa conjugadas con mitades de avidina como el paso final en el procedimiento, lo que resulta en una pérdida significativa de señal que complica el análisis cuantitativo. Además, el ensayo ABE no puede distinguir si una proteína se palmitoylate una vez o en varios sitios.
Aquí utilizamos el ensayo APEGS8,9,10,11,12 para determinar el estado de palmitilación de las proteínas transmembranas auxiliares AMPAR SynDIG1 y las proteínas relacionadas SynDIG4 (también conocido como Prrt1) y Prrt2 de extractos de cerebro de ratón; sin embargo, el ensayo se puede aplicar a cualquier proteína de membrana para la que esté disponible un anticuerpo de alta calidad y específico adecuado para la hinchazón occidental. El uso de membranas cerebrales de ratones de tipo salvaje (WT) y knockout (KO) proporciona un control ideal para la especificidad de anticuerpos como hemos demostrado para anticuerpos contra SynDIG115 y SynDIG416. La realización del ensayo APEGS con atatos cerebrales de ratones WT y KO proporciona un control importante para la especificidad de anticuerpos en este método. Este método también podría aplicarse a diferentes fracciones de membrana obtenidas a través de centrifugación diferencial seguida por el ensayo APEGS para investigar la localización subcelular de la proteína de interés.
Un paso crítico del ensayo APEGS es las precipitaciones CM, cuyo propósito es eliminar los productos químicos (NEM y HAM) de interferir con las reacciones posteriores aguas abajo. Aunque es posible realizar precipitaciones CM en un tubo de 1,5 ml, el uso de tubos y volúmenes más grandes debe producir resultados más óptimos. Al mismo tiempo, en parte debido a las múltiples precipitaciones CM, uno debe esperar una pérdida sustancial de proteína de principio a fin. Esto podría resultar en una variabilidad aparente en los niveles totales de proteínas en las condiciones menos y más HAM.
Como se ilustra en la Figura 1, la adición de mPEG-5k (5 kDa) no produce necesariamente un cambio lineal en un inmunoblot. Esto puede tener ventajas en la resolución de proteínas que se palmitoylacan en múltiples sitios. Además, la presencia de bandas en los lugares de cambio de movilidad en las condiciones negativas del HAM indica una reducción incompleta de los enlaces de disulfuro o un bloqueo incompleto de las cisteínas libres por parte de NEM. Alternativamente, las bandas aparentes cambiadas en la condición negativa del HAM podrían indicar que las cisteínas libres dentro de una proteína en particular son difíciles de bloquear. Por lo tanto, podría ser necesaria una optimización adicional del paso de bloqueo si sólo un pequeño porcentaje de proteína total se palmitoylate en contraste con SynDIG1, SynDIG4 y Prrt2 en los que la mayor parte de la proteína es solista o doblemente palmitoylated(Figura 1).
Este método no se limita a los lysates cerebrales de ratón. Por ejemplo, este método se ha utilizado para detectar enzimas despalmitoylantes para PSD-95 expresadas en células heólogas9. La expresión de proteínas en células hetólogas también permite determinar el sitio exacto de modificación a través de la mutagénesis dirigida por el sitio. Este método también informó el papel del andamio sináptico AKAP150 en la plasticidad sináptica17,,18, demostrando una amplia aplicación en neurociencia.
Es importante tener en cuenta que el ensayo APEGS no es exclusivo de las mitades de palmitato de 16 carbonos, ya que el ensayo detectará otros enlaces de acilo graso de cadena larga que están sujetos a escote y reemplazo por mPEG. Para establecer la modificación del palmitato de manera concluyente se requiere experimentación adicional, como el etiquetado metabólico con palmitato tritizado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a K. Woolfrey por su consejo y aportación sobre el ensayo APEGS. Estos estudios fueron financiados por becas de investigación a E.D. de la Fundación Whitehall y el NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
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