Palmitolerisering innebär införlivande av en 16-karbon palmitat moiety till cysteinrester av målproteiner på ett reversibelt sätt. Här beskriver vi en biokemisk metod, acyl-PEGyl utbyte gel skift (APEGS) analys, att undersöka palmitoylering tillstånd av något protein av intresse för mus hjärnan lysates.
Aktivitetsberoende förändringar i nivåerna av synaptiska AMPA-receptorer (AMPARs) inom den postsynaptiska densiteten (PSD) tros representera en cellulär mekanism för inlärning och minne. Palmitolering reglerar lokalisering och funktion av många synaptiska proteiner inklusive AMPA-Rs, hjälpfaktorer och synaptiska byggnadsställningar på ett aktivitetsberoende sätt. Vi identifierade synaps differentiering inducerad gen (SynDIG) familj av fyra gener (SynDIG1-4) kodning hjärnan-specifika transmembrane proteiner som associerar med AMPARs och reglera synaps styrka. SynDIG1 är palmitoylerad vid två cysteinrester belägna vid positionerna 191 och 192 i regionen juxta-transmembrane som är viktig för verksamhetsberoende excitatorisk synapsutveckling. Här beskriver vi en innovativ biokemisk metod, acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) analys, att undersöka palmitolering tillstånd av något protein av intresse och visa dess nytta med SynDIG familj av proteiner i mus hjärnan lysates.
S-palmitoylation är en reversibel post-translationell modifiering av målproteiner som reglerar stabil membranassociation, proteinhandel och protein-proteininteraktioner1. Det innebär tillsats av en 16-kol palmitat moiety till cystein rester via thioester länkage katalyseras av palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Många synaptiska proteiner i hjärnan är palmitoylerade, inklusive AMPA-Rs och PSD-95, på ett aktivitetsberoende sätt att reglera stabilitet, lokalisering och funktion2,3,4. Förändringar i nivåerna av synaptiska AMPARs i PSD via interaktion av hjälpfaktorer med synaptiska byggnadsställningar såsom PSD-95 ligger till grund för synaptisk plasticitet; Således ger metoder för att bestämma palmitoleriseringstillståndet hos synaptiska proteiner viktig insikt i mekanismer för synaptisk plasticitet.
Tidigare har vi identifierat SynDIG-familjen av fyra gener (SynDIG1-4) kodande hjärnspecifika transmembranproteiner som associerar med AMPARs5. Överuttryck eller knock-down av SynDIG1 i dissocierade råtta hippocampus nervceller ökar eller minskar, respektive, AMPA-R synaps storlek och antal med ~ 50% som detekteras med hjälp av immuncytokemi och elektrofysiologi5. Vi använde acyl-biotin utbyte (ABE) analys för att visa att SynDIG1 är palmitoylerade vid två bevarade juxta-transmembrane Cys rester (finns i alla SynDIG proteiner) på ett verksamhetsberoende sätt att reglera stabilitet, lokalisering och funktion6. ABE-analysen bygger på utbyte av biotin mot cysteiner som skyddas genom modifiering och efterföljande rening av affinitet7. Här beskriver vi en innovativ biokemisk metod, acyl-PEGyl utbyte gel skift (APEGS) analys8,9,10,11,12, som inte kräver affinitet rening och i stället använder förändringar i gel rörlighet för att bestämma antalet ändringar för ett protein av intresse. Protokollet beskrivs för undersökning av endogena membranproteiner från mushjärna för vilka lämpliga antikroppar finns tillgängliga.
I vårt tidigare arbete använde vi ABE-analysen för att visa att SynDIG1 är palmitoylerat vid två bevarade juxta-transmembrane Cys rester (finns i alla SynDIG-proteiner) på ett aktivitetsberoende sätt för att reglera stabilitet, lokalisering och funktion6. En begränsning är att ABE-analysen kräver affinitetsrening med agarose hartser konjugerade till avidin moieties som det sista steget i förfarandet, vilket resulterar i betydande förlust av signal som komplicerar kvantitativ analys. D…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar K. Woolfrey för råd och input på APEGS-analysen. Dessa studier finansierades genom forskningsanslag till E.D. från Whitehall Foundation och NIH-NIMH (1R01MH119347).
Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |