Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid
Summary
Questo protocollo descrive un efficace approccio di ibridazione in situ per rilevare i livelli di espressione dell’mRNA e i modelli spaziali dei geni bersaglio nel fluido coelomico del nudus Sipunculus.
Abstract
L’ibridazione in situ (ISH) è una tecnica molto informativa per presentare modelli di distribuzione cellulare di geni specifici (ad esempio, mRNA e ncRNA) nei tessuti. Il verme sipunculid Sipunculus nudus è una risorsa di pesca cruciale in quanto ha alti valori nutrizionali e medicinali. Attualmente, la ricerca sulla biologia molecolare di Sipunculus nudus è ancora agli inizi. Lo scopo di questo articolo è quello di sviluppare un metodo sensibile per localizzare mRNA specifico nel liquido coelomico del nucleo sipunculus. Il protocollo include passaggi dettagliati di ISH, tra cui l’antisensesità con etichette di digossigenina e la preparazione del risonante senso, la raccolta e la preparazione della sezione dei fluidi coelomici, l’ibridazione specifica di riboprobe, l’incubazione degli anticorpi, i trattamenti di post-colorazione. Vengono dimostrati i risultati rappresentativi ottenuti da un esperimento riuscito con questo metodo. Il protocollo dovrebbe essere applicabile anche ad altre specie di Sipuncula.
Introduction
ISH, utilizzando una sonda di acido nucleico etichettata per rilevare il DNA specifico o la sequenza di RNA di interesse, è un metodo utile per descrivere il modello di espressione spaziale dei geni bersaglio nei tessuti morfologicamente conservati1,2,3. Normalmente, la sequenza bersaglio viene generata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR), e quindi utilizzata come modello per sintetizzare la sonda RNA antisense/sense etichettata con digossigenina uridina-5′-triplodiato. I campioni vengono fissati e permeabilizzati prima dell’incubazione con riboprobe. Dopo aver lavato via la sonda in eccesso, l’ibridazione viene visualizzata dall’immunosofochimica utilizzando un anticorpo anti-digoxygenina, che è alcalino fosforo coniugato3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; ordine Sipunculida: Sipunculidae) è un verme marino non segmentato, coelomate e bilateralmente simmetrico7,8. Sipunculus nudus è una specie cosmopolita ampiamente distribuita nelle acque costiere tropicali e temperate. È anche un’importante risorsa di pesca marina nel sud della Cina a causa dei suoi alti valori nutrizionali e medicinali9,10. Tuttavia, Sipunculus nudus in biologia molecolare è ancora agli inizi. Per comprendere appieno il ruolo biologico dei geni, lo studio dei modelli di espressione dei geni a una risoluzione cellulare è di grande interesse. Nell’organismo non modello Sipunculus nudus, il metodo ISH, che è un metodo ideale per rilevare i modelli di espressione dei geni, non è ancora stato stabilito. Il suo fluido coelomico contiene diversi tipi di cellule, tra cui granulociti, cellule dell’urna, cellule vescicolari, cellule germinali, eritrociti, ecc11. Il doppio sesso/mab-3 correlato fattore di trascrizione-1 (dmrt1), utilizzato come gene rappresentativo in questo metodo, è un regolatore trascrizionale altamente conservato di determinazione sessuale e differenziazione nella maggior parte delle specie che vanno dagli invertebrati ai mammiferi12,13. In una serie di specie (ad es. porgy nero, ecc.) 14, dmrt1 è stato espresso nelle cellule di Sertoli, che circondano le cellule germinali, la cui funzione è simile alle cellule trofoblaste di Sipunculus nudus. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il dmrt1 di Sipunculus nudus sia espresso in cellule trofoblaste di spermatozeugmata, e il risultato del metodo ISH ha chiaramente confermato l’ipotesi.
Questo protocollo descrive per la prima volta ISH, con sonde antisenso/mRNA antisenso etichettate con digossigenina, per determinare i modelli di espressione dell’mRNA nel suo striscio fluido coelomico. Vengono fornite le condizioni di reazione ottimali, che consentono una visualizzazione molto sensibile dell’espressione dell’mRNA ad alta risoluzione. Il metodo ISH sviluppato potrebbe essere potenzialmente applicato in più specie di Sipunculida diverse da Sipunculus nudus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studi precedenti hanno dimostrato che ish è adatto per rilevare più RNA bersaglio16,17,18. In questo protocollo, abbiamo descritto un metodo ISH ad alta risoluzione per rilevare l’mRNA nel fluido coelomico e sottolineare le condizioni di ibridazione ottimizzate nel sipunculus nudus. I segnali evidenti di dmrt1 che abbiamo osservato hanno dimostrato la riuscita applicazione di questo protocollo nella rilevazio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Young Scientists Fund della National Natural Science Foundation of China (Grant no.
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
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