In situ Hybridisatie voor Sipunculus nudus Coelomic Fluid
Summary
Dit protocol beschrijft een effectieve in situ hybridisatie benadering om de mRNA expressie niveaus en ruimtelijke patronen van doelgenen in Sipunculus nudus coelomic vloeistof te detecteren.
Abstract
In situ hybridisatie (ISH) is een zeer informatieve techniek om cellulaire distributiepatronen van specifieke genen (bijvoorbeeld mRNA en ncRNA) in weefsels te presenteren. De sipunculid worm Sipunculus nudus is een cruciale visbestanden omdat het hoge voedingswaarden en medicinale waarden heeft. Momenteel staat het onderzoek naar de moleculaire biologie van Sipunculus nudus nog in de kinderschoenen. Het doel van dit artikel is het ontwikkelen van een gevoelige methode voor het lokaliseren van specifieke mRNA in Sipunculus nudus coelomic vloeistof. Het protocol omvat gedetailleerde stappen van ISH, met inbegrip van digoxigenin-gelabeld antisense en zin riboprobe voorbereiding, coelomic vloeistof collectie en sectie voorbereiding, specifieke riboprobe hybridisatie, antilichaam incubatie, kleuring en post-coloration behandelingen. De representatieve resultaten verkregen uit een succesvol experiment met behulp van deze methode worden aangetoond. Het protocol moet ook van toepassing zijn op andere Sipuncula-soorten.
Introduction
ISH, met behulp van een gelabelde nucleïnezuursonde om de specifieke DNA- of RNA-sequentie van belang te detecteren, is een nuttige methode om het ruimtelijke expressiepatroon van doelgenen in morfologisch bewaarde weefsels te beschrijven1,2,3. Normaal gesproken wordt de doelsequentie gegenereerd door polymerase kettingreactie (PCR) en vervolgens gebruikt als sjabloon om de antisense/sense RNA-sonde te synthetiseren met digoxigenin uridine-5′-trifosfaat. Monsters worden vastgemaakt en permeabilized voor incubatie met riboprobe. Na het afwassen van de overtollige sonde, hybridisatie wordt gevisualiseerd door immunohistochemie met behulp van een anti-digoxygenin antilichaam, dat is alkalische fosfatase-geconjugeerd3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; order Sipunculida: Sipunculidae) is een niet-gesegmenteerde, coelomaat en bilateraal symmetrische mariene worm7,8. Sipunculus nudus is een kosmopolitische soort op grote schaal verspreid in tropische en gematigde kustwateren. Het is ook een belangrijke mariene visbestanden in het zuiden van China vanwege de hoge voedingswaarden en geneeskrachtige waarden9,10. Echter, Sipunculus nudus in moleculaire biologie staat nog in de kinderschoenen. Om de biologische rol van genen volledig te begrijpen, is het onderzoek naar genenexpressiepatronen bij een cellulaire resolutie van groot belang. In het niet-modelorganisme Sipunculus nudusis de ISH-methode, een ideale methode om de genenexpressiepatronen te detecteren, nog niet vastgesteld. De coelomic vloeistof bevat verschillende celtypes, waaronder granulocyten, urncellen, vesiculaire cellen, kiemcellen, erythrocyten,enz. De dubbele seks /mab-3 gerelateerde transcriptie factor-1 (dmrt1), gebruikt als een representatief gen in deze methode, is een sterk geconserveerde transcriptie regulator van geslachtsbepaling en differentiatie in de meeste soorten, variërend van ongewervelde dieren tot zoogdieren12,13. In een reeks soorten (d.w.z. zwarte porgy, enz.) 14, dmrt1 werd uitgedrukt in de Sertoli cellen, rond de kiemcellen, waarvan de functie is vergelijkbaar met trofoblast cellen van Sipunculus nudus. Daarom veronderstelden we dat dmrt1 van Sipunculus nudus wordt uitgedrukt in trofoblastcellen van spermatozeugmata, en het resultaat van de ISH-methode bevestigde de hypothese duidelijk.
Dit protocol beschrijft voor het eerst ISH, met digoxigenin-gelabelde antisense/sense mRNA-sondes, om mRNA-expressiepatronen in zijn coelomic vloeistofuitstrijkje te bepalen. De optimale reactieomstandigheden worden geleverd, die een zeer gevoelige visualisatie van mRNA-expressie bij hoge resolutie mogelijk maken. De ontwikkelde ISH-methode kan mogelijk worden toegepast in meer Sipunculida-soorten anders dan Sipunculus nudus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere studies toonden aan dat ISH geschikt is voor het opsporen van meerdere doel-RNAs16,17,18. In dit protocol beschreven we een ISH-methode met hoge resolutie om het mRNA in coelomic vloeistof te detecteren en de geoptimaliseerde hybridisatieomstandigheden in Sipunculus nudus te benadrukken. De voor de hand liggende signalen van dmrt1 die we waarnamen toonden de succesvolle toepassing van dit protocol bij d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Young Scientists Fund van de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (2016J01161), de Wetenschappelijke Onderzoeksfondsen van de Huaqiao University (15BS306) en het Innovatieve Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek van de Huaqiao University.
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O’Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
