Summary
Her præsenterer vi protokoller til analyse af knoglerremodellering i en lab-on-a-chip platform. En 3D-printet mekanisk belastningsenhed kan parres med platformen for at fremkalde osteocyte mechanostransduktion ved at deformere den cellulære matrix. Platformen kan også bruges til at kvantificere knogleremodelleringsfunktionelle resultater fra osteoklaster og osteoblaster (resorption/dannelse).
Abstract
Bone remodeling er en stramt reguleret proces, der er nødvendig for skeletvækst og reparation samt tilpasning til ændringer i det mekaniske miljø. Under denne proces, mechanosensitive osteocytter regulere de modsatrettede reaktioner mellem katabolske osteoklaster og anabolske osteoblaster. For bedre at forstå de meget indviklede signalveje, der regulerer denne proces, har vores laboratorium udviklet en grundlæggende lab-on-a-chip (LOC) platform til analyse af funktionelle resultater (dannelse og resorption) af knogleremodellering inden for et lille system. Som knogle remodeling er en langvarig proces, der opstår i størrelsesordenen uger til måneder, vi udviklede langsigtede celle dyrkning protokoller i systemet. Osteoblaster og osteoklaster blev dyrket på funktionelle aktivitetssubstrater i LOC og opretholdt i op til syv uger. Derefter blev chips skilt ad for at muliggøre kvantificering af knogledannelse og resorption. Derudover har vi designet en 3D-printet mekanisk lasteenhed, der parrer med LOC-platformen og kan bruges til at fremkalde osteocyte mechanotransduktion ved at deformere cellulære matrix. Vi har optimeret celledyrkningsprotokoller for osteocytter, osteoblaster og osteoklaster i LOC-platformen og har behandlet problemer med sterilitet og cytotoksicitet. Her præsenterer vi protokollerne til fremstilling og sterilisering af LOC, såning celler på funktionelle substrater, inducerende mekanisk belastning, og demontering loc at kvantificere slutpunkt resultater. Vi mener, at disse teknikker lægger grunden til at udvikle en sand orgel-on-a-chip til knogleremodellering.
Introduction
Bone er en meget dynamisk væv, der kræver indviklet koordinering blandt de tre store celletyper: osteocytter, osteoblaster, og osteoklaster. Flercellulære interaktioner mellem disse celler er ansvarlige for knogletab, der opstår under lammelse og langvarig ubevægelighed og for knogledannelse, der opstår som reaktion på vækst og motion. Osteocytter, den mest rigelige knoglecelletype, er meget følsomme over for mekaniske stimuli anvendes på knoglen. Mekanisk stimulation ændrer osteocyt metabolisk aktivitet og fører til en stigning i centrale signalering molekyler1,2. Gennem denne proces, kendt som mechanotransduktion, osteocytter kan direkte koordinere aktiviteterne i osteoblaster (knogledannende celler) og osteoklaster (knogle resorbing celler). Vedligeholdelse knogle homøostase kræver en stram regulering mellem knogledannelse og knogle resorption satser; men, forstyrrelser i denne proces kan resultere i sygdomstilstande såsom osteoporose eller osteopetrose.
Kompleksiteten af interaktioner mellem disse tre celletyper egner sig godt til undersøgelse udnytte mikrofluidiske og lab-on-a-chip (LOC) teknologier. Med henblik herpå har vores laboratorium for nylig etableret proof of concept af en LOC platform til analyse af knogleresorption og dannelse (funktionelle resultater) i knoglen remodeling processen. Platformen kan bruges til undersøgelse af cellulære interaktioner, ændrede lastning miljøer, og investigational drug screening. I de seneste år er forskellige mikrofluidiske enheder blevet udviklet til at undersøge de molekylære signalveje, der regulerer knogleremodellering; Mange af disse systemer kvantificerer imidlertid ommodelleringen ved hjælp af indirekte markører , der er tegn på funktionel aktivitet3,4,5,6,7. En fordel ved vores system er, at det kan bruges til direkte kvantificering af funktionelle resultater. Knogleremodellering er en langsigtet proces. Som sådan kræver direkte kvantificering af knoglersorption og dannelse et dyrkningssystem , der kan opretholdes i mindst flere uger til månederne 8,9,10,11. Således, når udviklingen af LOC platform, vi etableret langsigtede dyrkning protokoller er nødvendige for dannelse og resorption og har opretholdt celler i systemet i op til syv uger11. Derudover har vi indarbejdet passende dyrkningssubstrater for begge celletyper i platformen; osteoklaster blev dyrket direkte på knoglen, og osteoblaster, som er kendt for at være plastik klæbende, blev dyrket på polystyren diske. Endvidere har vi behandlet spørgsmål vedrørende sterilitet, langsigtet cytotoksicitet og spåndeenhed til remodeling analyse11,12.
LOC-platformen kan også bruges til at fremkalde osteocyt mechanotransduktion gennem matrixdeformation. En 3D trykt mekanisk lastning enhed blev udviklet til at parre med LOC og anvende en statisk ud af flyet udaf flyet udistention at strække cellerne13. For at imødekomme denne mekaniske belastning blev dybden af brønden i LOC øget. Denne lille skala, enkel mekanisk lastning enhed kan nemt produceres af laboratorier med begrænset teknisk erfaring, og vi har tidligere delt tegninger af 3D trykte komponenter13. I det nuværende arbejde demonstrerer vi nogle af de nye teknikker, der er nødvendige for en vellykket brug af LOC. Specifikt demonstrerer vi spånfremstilling, cellesåning på funktionelle substrater, mekanisk belastning og spåndemontering til remodellering af kvantificering. Vi mener, at forklaringen på disse teknikker drage fordel af et visuelt format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip maske forberedelse
BEMÆRK: Trin 1.1 - 1.3 skal kun udføres én gang efter første modtagelse af spånmasken. De sikrer, at masken ikke bøjer under brug. Udformningen af mikrofluidiske masker blev tidligere beskrevet11,14. Masker er designet internt og fremstillet kommercielt ved hjælp af stereolitografi med høj opløsning (Figur 1A).
- Dæk oversiden af masken med plastfolie for at beskytte denne overflade mod klæbemiddel. Fastgør spånmasken til et akrylark i lige størrelse ved hjælp af sprayklæbemiddel. Klem stykkerne sammen natten over, så limen kan hærdehelt. Når limen er tør, skal plastfolien fjernes fra toppen af masken.
- Fastgør bunden af akrylarket til en 3D-printet nivelleringsboks (supplerende figur 1, supplerende filer 1-4) ved hjælp af dobbeltklæbende tape. Tryk hårdt for at sikre en stram binding.
- Luk eventuelle små åbninger i nærheden af den aftagelige væg i nivelleringsboksen med en vandtæt fugemasse. Lad fugemassen hærde i 24 timer.
- Rengør overfladen af masken med 70% ethanol (EtOH). Anbring nivelleringsboksen med den ønskede spånmaske i ovnen. Brug en digital vinkelmåler til at sikre, at toppen af masken er i niveau. Juster nivelleringsskruerne, hvis det er nødvendigt.
2. PDMS fabrikation
BEMÆRK: Der anvendes et lavbrøndsspåndesign (1 mm) til funktionelle aktivitetsanalyser (dannelse og resorption), og der anvendes et deep-well (10 mm) spåndesign til mekaniske belastningsundersøgelser. Bunden af dybbrønden dannes ved at fastgøre en separat tynd PDMS-membran (Figur 1B).
- Låglag (lag 1)
- 63 g PDMS prepolymer og 6,3 g hærdningsmiddel (10:1 ratio) i en plastikkop. Bland grundigt med en engangscellespatel og degas i en vakuumekssikkator i 30 min.
- Hæld langsomt blandingen i den forberedte nivelleringskasse. PdMS må sidde i 30 min. og derefter bages ved 45 °C i 18 timer.
- Løsn kanterne af PDMS med en tilspidset laboratoriespatel og fjern polymerarket fra nivelleringsboksen.
- Skær individuelle låg til størrelse (70 mm x 34 mm) ved hjælp af en skalpel og en 3D trykt skabelon.
- Punch adgang huller gennem hvert låg med en biopsi punch (1 mm diameter).
- Overflade rense låg med emballage tape.
BEMÆRK: Hvis lågene ikke anvendes med det samme, skal de pakkes ind i emballagetap og opbevares ved stuetemperatur (RT).
- Godt og microchannel lag (Lag 2)
- Kombiner PDMS prepolymer og hærdningsmiddel (10:1 ratio) i en plastikkop. Den lavvandede-godt design kræver 43 g prepolymer og 4,3 g hærdning agent, og deep-well design kræver 227 g prepolymer og 22,7 g hærdning agent. Bland polymeren kraftigt og afgas i 30 min.
BEMÆRK: Dette forudsætter en maskedimension på 152,4 mm x 152,4 mm. - Hæld langsomt blandingen over passende fornødet maske. PdMS må sidde i 30 min. og derefter bages ved 45 °C i 18 timer.
- Løsn kanterne af PDMS med en tilspidset laboratoriespatel og skræl forsigtigt polymeren væk fra masken. Brug en skalpel og 3D trykt skabelon til at skære de enkelte chips.
BEMÆRK: Ved belastningsundersøgelser er det vigtigt, at spåndimensionerne (70 x 34 mm) er præcise, og at brønden er placeret i midten af spånen. - Surface rengør PDMS med emballagetape.
BEMÆRK: Hvis spånerne ikke anvendes med det samme, skal hver chip pakkes ind i emballagetape og opbevares på RT.
- Kombiner PDMS prepolymer og hærdningsmiddel (10:1 ratio) i en plastikkop. Den lavvandede-godt design kræver 43 g prepolymer og 4,3 g hærdning agent, og deep-well design kræver 227 g prepolymer og 22,7 g hærdning agent. Bland polymeren kraftigt og afgas i 30 min.
- Tynd PDMS-membran (lag 3)
BEMÆRK: Dette lag bruges kun til deep-well design.- Der tilsættes 12,7 g PDMS prepolymer og 1,3 g hærdningsmiddel (10:1 ratio) til en plastikkop. Bland kraftigt og afgas i 30 min.
- Hæld langsomt polymer i forberedt nivelleringboks og skrab plastikkoppen grundigt for at fjerne så meget PDMS som muligt.
- Brug cellespatel til at sprede PDMS over hele overfladen.
BEMÆRK: Hvis polymeren ikke spredes manuelt, vil overfladespændingen være tilstrækkelig til at forhindre polymeren i at danne et ensartet ark. - PdMS må sidde i 30 min. og derefter bages ved 45 °C i 18 timer.
- Løsn kanterne af PDMS med en tilspidset spatel, og fjern forsigtigt PDMS-arket fra nivelleringsboksen. Skær individuelle membraner, der matcher dimensionerne af lag 2.
- Mål membrantykkelsen i midten af membranen ved hjælp af calipre. Alle membraner, der er uden for den ønskede tykkelse (0,5 mm ± 0,1 mm).
- Rengør omhyggeligt membraner med emballagetape og placer dem på et stykke paraffinfilm.
BEMÆRK: Hvis membranerne ikke anvendes med det samme, skal toppen af membranen dækkes med emballagetape og opbevares på RT.
3. Funktionelle aktivitetssubstrater
BEMÆRK: Polystyrenskiver og benwafere skal fastgøres til bunden af brønde, der vil blive anvendt til henholdsvis osteoblast- og osteoklastkulturer.
- Polystyrenskiver (Figur 1C)
- Placer afdækningstape på bagsiden af en vævkultur behandlet polystyren coverslip. Skær cirkulære skiver fra dækstrækket med en skærpet korkborer (5,4 mm i diameter). Sænk diskene ned i 70% EtOH og lad natten over.
- Skrub forsigtigt oversiden af disken med en bomuldsspidsapplikator dyppet i 70% EtOH. Sørg for, at diskens yderkant rengøres grundigt.
- Hold disken nede med to par pincet, og fjern afdækningstapen. Placer den behandlede skive nedad, og rengør bagsiden med en bomuldsspidsapplikator.
- Dyp træenden af en bomuldstippet applikator i en afgasset blanding af uhærdet PDMS og læg en lille mængde polymer på bunden af den ønskede brønd.
BEMÆRK: Resterende uhærdet PDMS kan opbevares ved -20 °C. - Placer polystyrenskiven, behandlet side op, i brønden og tryk forsigtigt ned på disken med en vatpind. Sørg for, at der ikke kommer uhærdet PDMS i kontakt med den behandlede side af disken.
BEMÆRK: Hvis PDMS kommer i kontakt med diskens behandlede overflade, skal du fjerne disken fra brønden og gentage trin 3.1.4 og 3.1.5 med en ny disk. - Lad spånen sidde på en plan overflade i 30 min og bages derefter ved 65 °C i 4 timer.
- Benvafler
- Brug pincet til at placere en knoglewafer (6 mm diameter, 0,4 mm tyk) på bunden af en 100 mm skål. Hold waferen stabil med pincetog forsigtigt etch et 'X' på bagsiden af wafer med en skalpel.
BEMÆRK: Under billeddannelsesprocessen anvendes »X« til at skelne mellem bagsiden af waferen og den overflade, hvorpå cellerne blev seedet. - Brug træenden af en bomuldsspidsapplikator til at tilføje en lille mængde uhærdet PDMS til bunden af den ønskede brønd. Placer knoglewafer, markeret side ned, i brønden og bruge en bomuld tippet applikator til at trykke wafer ned.
- Lad spånen sidde på en plan overflade i 30 min og bages derefter ved 65 °C i 4 timer.
- Brug pincet til at placere en knoglewafer (6 mm diameter, 0,4 mm tyk) på bunden af en 100 mm skål. Hold waferen stabil med pincetog forsigtigt etch et 'X' på bagsiden af wafer med en skalpel.
4. Spånsamling og sterilisering
- Aktiver overfladerne på lag 1 og lag 2 med en plasmarenser i 30 s ved hjælp af en medium radiofrekvens (RF) effektindstilling (svarende til ca. 10,2 W).
- Juster adgangshullerne i lag 1 med mikrokanalerne i lag 2, og tryk de to lag godt sammen.
- Gentag trin 4.1 med lag 2 og lag 3 for at få det dybe design. Under plasmabehandlingen skal du bruge dobbeltklæbende tape til at fastgøre paraffinfilmen i lag 3 til en flad overflade.
- Brug en skalpel til at trimme overskydende materiale fra PDMS membranen. Skræl forsigtigt arket af paraffinfilm væk fra bunden af spånen
- Bag spånen ved 65 °C i 10 minutter for at øge bindingsstyrken mellem PDMS-lagene.
- Sæt vinklede dispenserspidser (18 Gauge, 0,5 i, 90°) ind i adgangshullerne i låget. Fastgør dispenseringsspidserne til låget med en epoxy i to dele. Brug en mikropipettespids til at påføre epoxyen omkring hver dispenseringsspids.
- Når epoxyen er helt hærdet, skal spånen rengøres med 70% EtOH og placeres i et biosikkerhedsskab. Udfør alle efterfølgende trin i biosikkerhedsskabet.
- Tilslut en 5 ml sprøjte til dispenseringsspidserne med steril silikoneslange (1/32'' ID, ~10 cm i længden) og fyld hele chippen med 70% EtOH i mindst 30 s. For lavvandede-godt design, administrere alle væsker med en sprøjte pumpe indstillet til en strømningshastighed på 4 ml / t. For deep-well design, administrere alle væsker ved langsomt at dispensere sprøjten i hånden.
- Fjern EtOH fra spånen, og steriliser spånen med UV-lys natten over.
- Spånen vaskes 3 gange med dH2O. Fyld spånen med dH2O, tag slangen ud af dispenserspidserne og inkuberes i mindst 48 timer ved 37 °C.
5. Mekanisk indlæsningsanordning samling
BEMÆRK: Design- og fabrikationsprocesserne for den 3D-printede mekaniske læsseanordning (figur 2A-C) er tidligere beskrevet, og alle designfiler til trykte komponenter er tidligere blevet leveret13.
- Autoklave alle komponenter i ilægningsanordningen i 30 min ved 121 °C.
BEMÆRK: For at undgå vridning af trykte komponenter skal hvert stykke pakkes individuelt i folie og placeres på en hård flad overflade under autoklaveringsprocessen. Metalhardware kan pakkes sammen. Gennemfør alle efterfølgende trin i et biosikkerhedsskab. - Anbring en kompressionsfjeder rundt om pladens skaft, og sæt pladen ind i det centrale hul i bunden af bunden (figur 2D).
- Fastgør drejeblokken til bunden af basen ved hjælp af fire selvskærende skruer.
- Placer en anden kompressionsfjeder rundt om den centrale skrue. Sæt skruen i det sekskantede hul i bunden af skiven, og skru samlingen ind i det gevindhul i midten af drejeblokken.
- Skru fire mandlige-kvindelige standoffs i bunden af basen.
- Fjern slæk fra enheden ved at dreje skiven mod uret, indtil toppen af pladen er under toppen af basen. Drej derefter langsomt drejeknappen med uret, indtil toppen af pladen er i vater, med toppen af basen.
6. Eksperimenter
BEMÆRK: Protokoller for forsøg med funktionel aktivitet blev tidligere fremlagt11,12.
- Belastningsundersøgelser (figur 3)
- Efter trin 4.9 skal du bruge en 5 ml sprøjte til at fjerne dH2O fra deep-well chippen. Pels bunden af brønden med 200 μL 0,15 mg/ml type I kollagen (CTI) i 0,02 M eddikesyre i 1 time.
- Skyl spånen tre gange med Dulbeccos fosfat-bufferede saltvand med calcium og magnesium (DPBS++).
- Spår spånholderen og frøet med MLO-Y4-osteocytter ved en massefylde på 2 x 104 celler/ml i et minimum af essentielt alfamedium (MEMα) suppleret med 5% kalveserum, 5% fosterkvægserum og 1% penicillin/streptomycin.
- Tag slangen ud af dispenserspidserne, og anbring spånen i en dybbrøndskulturskål (150 mm x 25 mm). Inkuberceller ved 37 °C og 5% CO2 i 72 timer.
- Fastgør sterile slanger til dispenseringsspidser og brug en 5 ml sprøjte til at fjerne brugt kulturmedium fra spånen. Afgiv langsomt i frisk kulturmedium for at genopfylde spånen.
- Anbring spånholderen i den rektangulære indsat oven på ladeanordningens bund. Før slangen gennem rillerne på låget til ilægningsanordningen, og fastgør låget til bunden med fire pandehovedskruer og sekskantede møtrikker.
BEMÆRK: For at sikre, at låget forbliver i vater, skal du først fastgøre to skruer, der er placeret diagonalt fra hinanden, før de resterende to skruer fastgøres. - Anvend belastning på cellerne ved at dreje skiven med uret, indtil den ønskede platenforskydning er nået.
BEMÆRK: Enheden er konstrueret således, at en rotation af skiven svarer til en platenforskydning på 1 mm. Det stammefelt, der blev genereret på toppen af PDMS-membranen, var tidligere modelleret som en funktion af platenforskydning ved hjælp af finite element analysis (FEA)13. - Anbring ilægningsanordningen i en tom P1000 mikropipettespidsboks. Cellerne inkuberes med påført belastning i 15 min.
BEMÆRK: Den indlæsningstidsperiode, der bruges her, tjener som eksempel. Der kan anvendes alternative indlæsningstider. - Efter inkubation endegør belastningen fra cellerne ved at dreje drejeknappen mod uret, indtil pladen vender tilbage til den oprindelige udgangsposition. Tag låget af apparatet, og anbring spånholderen i kulturpladen med dyb brønd. Inkubercellerne i en 90-min efterbelastningsrestitutionsperiode.
BEMÆRK: Igen tjener den restitutionsperiode, der bruges her, som et eksempel. Alternative restitutionstider kan bruges. Til langtidsundersøgelser fodres cellerne hver 72. - Brug en 5 ml sprøjte til at fjerne det konditionerede medium fra spånen.
BEMÆRK: Dette medium kan gemmes og opbevares ved -80 °C. - Fjern chippen fra spånholderen, og brug en tilspidset spatel til at bryde bindingen mellem PDMS-låget og brøndlaget.
BEMÆRK: Cellulære analyser kan nu udføres efter enhver protokol, der er etableret for en cellekulturplade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den lavvandede-godt konfiguration kan bruges til at analysere funktionelle aktivitet af osteoblaster og osteoklaster. Knogledannelse via osteoblaster og resorption via osteoklaster kræver dyrkningstider i størrelsesordenen flere uger til måneder. Knogledannelse fra MC3T3-E1 pre-osteoblaster blev kvantificeret ved hjælp af alizarinrøde og von Kossa pletter11,15. På dag 49 var det gennemsnitlige overfladeareal, der var plettet med alizarinrød, 10,7 % ± 2,2 % (gennemsnit ± standardfejl i middelværdien)11. Det gennemsnitlige overfladeareal, der var plettet med von Kossa, var 6,4 % ± 1,6 %11. Figur 4A viser typiske dannelsesresultater fra osteoblastkulturer på dag 49, der er plettet med alizarinrød og von Kossa. Knogleresorption fra RAW264.7 pre-osteoklaster blev kvantificeret ved hjælp af toluidinblå farvning 11,15. Ved dag 30 var det gennemsnitlige overfladeareal, der var plettet med toluidinblåt, 30,4 % ± 4,5 %11. Figur 4B viser typiske knogleresorptionsresultater fra osteoklastkulturer, der er plettet med toluidinblåt på dag 30. Scanning elektron mikroskopi blev udført for at kontrollere tilstedeværelsen af resorption gruber. Typiske resultater er vist i figur 4C. Disse resultater viser, at celler i enheden forbliver levedygtige og funktionelt aktive i mindst syv uger.
En 3D-printet læsseenhed er designet og fremstillet til at rumme den dybe chipkonfiguration. Sammen kan dette system fremkalde osteocyte mechanotransduktion ved at strække cellerne via en statisk ud-af-plan udspilning. 48 h inkubation af chippen beskrevet i trin 4.9 har vist sig at være en kritisk proces for at opretholde celle levedygtighed og typisk morfologi. Figur 5A viser repræsentative billeder af MLO-Y4 osteocytter ved 72 h seedet i chips med og uden denne inkubationstid. Under belastningen blev osteocytter udsat for en belastningsgradient, der blev fremkaldt på pdmsmembranen, hvor cellerne var seedet (supplerende video 1). De tilsvarende stammer, der blev genereret under denne proces, blev modelleret med FEA13, og den gennemsnitlige ækvivalente stamme, der blev produceret på toppen af PDMS-membranen, blev bestemt. Figur 5B viser forholdet mellem gennemsnitlig ækvivalent stamme og forskydning af platen for værdier mellem 1 og 2 mm. Figur 5Cviser et repræsentativt varmekort over den inducerede stammegradient . I dette eksempel genererede en platenforskydning på 1,5 mm en gennemsnitlig ækvivalent stamme på 12,29% på toppen af membranen. Denne model viser også, at de stammer, der induceres nær midten af brønden, er relativt lave og gradvist øgeradialt udad, med maksimale stammer genereret direkte over den ydre kant af pladen. Efter lastning, celle levedygtighed blev analyseret med laktat dehydrogenase farvning og annexin V og døde celle analyse14,16. Typiske resultater er vist i henholdsvis figur 5D,E.
Figur 1: Mikrofluidisk enhed. (A) Fremstilling og nivellering af spånmasken. (Venstre) Skematisk af deep-well chip maske, der blev designet in-house ved hjælp af CAD-software. (I midten) Billede af den dybe chipmaske, der blev trykt kommercielt ved hjælp af stereolitografi med høj opløsning. (Højre) Masken er placeret i en 3D-printet nivelleringboks for at sikre, at masken forbliver plan under støbning af lag 2 af chips. (B) Skematisk skitser af lavvandede-godt og dyb-godt design af enheden. (Øverst) Den lavvandede-godt design blev brugt til at analysere funktionelle aktivitet (dannelse og resorption) af osteoblaster og osteoklaster. Denne konfiguration er dannet ud fra to PDMS-lag. Et funktionelt aktivitetssubstrat blev fastgjort til bunden af kulturen godt før forsegling af lagene sammen. Polystyren skiver og knogle wafers blev brugt til osteoblast og osteoklast kulturer, henholdsvis. (Nederst) Den dybe brønd design blev brugt til at anvende mekanisk belastning til osteocytter. Denne konfiguration består af tre PDMS-lag. Bunden af kulturen godt er dannet af de deformerbare PDMS membran (lag 3). CC) Fremstillingstrin for polystyrenskiven, der anvendes til osteoblastkulturer. Bagsiden af en vævskultur behandlet coverslip blev markeret med afdækningstape. Individuelle skiver blev skåret ud med en kork-borer. Disken blev rengjort med ethanol og en vatpind. Båndbagsiden blev fjernet, og disken var fastgjort til bunden af PDMS-kulturen godt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Konstruktion og montering af den mekaniske lasteanordning. (A) Billede af den samlede mekaniske lasteanordning. Når den kombineres med PDMS-chippens deep-well-design, strækker lastenheden cellerne ved at anvende en ud af planudspilning på en deformerbar membran. (B) Adskilt-visning af enheden. Alle dele vist med blåt blev 3D trykt med en varmebestandig polymælkesyreglødetråd. Al hardware er rustfrit stål. (C) Skruestikmekanisme på læsseanordningen. Rotation af den centrale skrue (orange) skubber pladen (grøn) opad gennem basen. Den opadgående bevægelse af platen deformerer PDMS membranen af deep-well chip, hvor cellerne er blevet seedet. (D) Indlæsningsanordningens monteringsproces. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mekanisk belastningseksperiment. Alle væsker blev administreret og fjernet fra spånen ved hjælp af en 5 ml sprøjte tilsluttet adgangsslangen. Et kritisk skridt i denne proces er 48 h inkubation med sterilt destilleret vand før cellesåning. Uden denne inkubationsceller viste lav levedygtighed og atypisk morfologi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Typiske funktionelle aktivitetsresultater. (A) Typiske dannelsesresultater plettet med alizarinrød (venstre) og von Kossa (til højre) fra inducerede MC3T3-E1 osteoblastkulturer på dag 49. Hele skivebilleder måler 5,4 mm i diameter. (B) Typiske osteoklastresorptionsresultater fra RAW264.7 preosteoklaster induceret med receptoraktivator af nuklear faktor kappa-B ligand (RANKL). Celler blev dyrket på knoglevafler og plettet med toluidinblå på dag 30. (C) Typiske scanning elektron mikroskopi billeder kontrollere tilstedeværelsen af resorption gruber på knogle vafler. Skalalinjen i det øverste billede repræsenterer 200 μm og skalalinjen i det nederste billede repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Virkninger af mekanisk induceret belastning på osteocytter. (A) Billeder af MLO-Y4 osteocytter ved 72 timer i dybbrøndschippen fremstillet med (venstre) og uden (højre) en 48 timers inkubation med destilleret vand før cellesåning. (B) Finite element analyse blev brugt til at modellere den gennemsnitlige ækvivalente stamme genereret på toppen af de deformerbare PDMS membran baseret på forskydning af lastning enhed platen. Resultater fra forskydninger på mellem 1,0 mm og 2,0 mm vises. (C) Varmekort over den modellerede stammegradient, der er fremkaldt på PDMS-membranen, til en platenforskydning på 1,5 mm. (D) Typiske resultater af en laktatdehydrogenaseplet af lægemiddelinducerede osteocytter, der blev strakt ved hjælp af en forskydning på 1,5 mm platen. En lettere cellefarvning observeres nær brøndens yderkant, hvilket svarer til placeringen af højere stammeværdier, der indikerer celleskader og/eller død. (E) Repræsentative flowcytometriresultater af belastningsinduceret apoptose angivet ved et bilag I V og dødcelleanalyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: 3D trykt nivelleringsboks med aftagelig væg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Udjævningsboks CAD-fil 1. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Supplerende fil 2: Udjævningsboks CAD-fil 2. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Supplerende fil 3: Udjævningsboks CAD-fil 3. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Supplerende fil 4: Opstilling af udjævningsbokshardware. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Supplerende video 1: Mekanisk indlæsningsanordning. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver grundlaget for fremstilling af en knogleremodellering LOC platform for dyrkning osteocytter, osteoklaster, og osteoblaster. Ved at ændre dybden og størrelsen af brønden i chippen blev der udviklet flere konfigurationer til stimulering af osteocytter med mekanisk belastning og kvantificering af funktionelle resultater af knogleombygning (figur 1B).
Under spånsamling var optimering af plasmaoxidationsprotokollen afgørende for at eliminere lækageproblemer. Vi fandt, at udsætte PDMS overflader til 30 s ilt plasma genereret ved hjælp af en medium RF magt indstilling (trin 4.1), svarende til ca 10,2 W, var tilstrækkelig til at skabe en stærk binding mellem lagene. Obligationens integritet faldt, når der blev anvendt længere eksponeringstider eller en højere RF-effektindstilling. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter , der bemærkede en overeksponering af PDMS til iltplasma øget overflade ruhed og reduceret klæbeevne17,18.
Desuden var opretholdelsen af høj cellelevedygtighed og typisk cellemorfologi kritisk afhængig af PDMS-hærdningsprocessen. PDMS-polymeren består af krydsforbundne dimethylsiloxanoligomerer. Denne krydsbindingsproces er både tids- og temperaturafhængig. men selv med omfattende hærdning polymeren undlader at fuldt polymerisere19. De resterende oligomerer har vist sig at udvaske sudaf bulkpolymeren i det omgivende cellekulturmedium og er endda blevet fundet i membranerne i celler dyrket på polymeroverfladen20. Flere grupper har rapporteret cytotoksiske effekter fra ikke-krydsforbundne PDMS-oligomerer21,22,23. For at løse denne bekymring i vores system optimerede vi PDMS-hærdningsprocessen. Selvom hærdningshastigheden for PDMS er temperaturafhængig, begrænsede materialeegenskaberne af vores spånmasker vores hærdningstemperatur til 45 °C. Som sådan besluttede vi, at spånerne skulle bages i mindst 18 timer. Endvidere har vi konstateret, at inkubering af spåner med dH2O i mindst 48 timer før cellesåning (trin 4.9) var nødvendigt for at reducere cytotoksiske virkninger. Figur 5A viser MLO-Y4 osteocytter dyrket i spåner med og uden denne inkubationstid.
Den dybe brønd konfiguration, som var designet til at rumme mekanisk belastning ansøgning, kræver, at chippen skal fremstilles fra tre separate lag. I modsætning til lavvandede-godt konfiguration, fabrikere godt og membran portioner som et enkelt stykke for deep-well konfiguration forårsaget membranen til at fordreje. Dette kan skyldes en forskel i hærdningshastigheder mellem de tykke og tynde dele af spånen. For at løse dette problem blev membranlaget konstrueret separat og bundet til bunden af spånen efter hærdningsprocessen. For at generere et separat membranlag med ensartet tykkelse er det afgørende, at nivelleringsboksen er helt i niveau, før PDMS tilføjes (trin 1.4). Som sådan anbefales det at bruge en digital vinkelmåler for at sikre en høj grad af nøjagtighed. Derudover er det i trin 2.3.2 vigtigt at fjerne så meget PDMS fra plastikkoppen som muligt. Uoverensstemmelser på dette trin vil føre til høje afvigelser i membrantykkelser, og i sidste ende høje afvigelser i den gennemsnitlige substrat stamme bruges til at fremkalde osteocyt mechanotransduktion.
Vores knogleremodelleringsplatform giver en høj grad af alsidighed. Dette system kan bruges til at undersøge en række faktorer, der regulerer knogle remodeling, såsom belastning-induceret mechanotransduktion, multicellulære signalering, inflammation, eller narkotika effekter. For eksempel blev systemet brugt til at analysere de kombinerede virkninger af mekanisk belastning og betændelse på knogleremodellering i et lægemiddel induceret miljø14. Mekanisk belastning blev anvendt på bisfosfonatbehandlede osteocytter. Proteinanalyse af det konditionerede medium afslørede en signifikant stigning i niveauet af leptin og osteonectin og et betydeligt fald i ccl21- og CD36-niveauerne sammenlignet med osteocytter, der ikke var mekanisk belastet14.
De protokoller, der præsenteres her, danner grundlag for dyrkning af hver celletype inden for LOC samt metoder til at fremkalde mekanisk belastning og kvantificere funktionel aktivitet. Bevæger sig fremad, arbejder vi hen imod en ægte knogle organ-on-a-chip. Derudover mener vi, at bruge vores system til at udvikle matematiske modellering systemer i høj grad kunne forbedre vores forståelse af de komplekse multicellulære signalprocesser, der regulerer knogle remodeling24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation under Grant Nos. (CBET 1060990 og EBMS 1700299). Dette materiale er også baseret på arbejde, der støttes af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. (2018250692). Eventuelle udtalelser, resultater, konklusioner eller anbefalinger udtrykt i dette materiale er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
