Summary
Здесь мы представляем протоколы для анализа костной ремоделирования в лаборатории на чипе платформы. 3D печатных механических погрузочных устройств может быть в паре с платформой, чтобы вызвать остеоцит механотрансдукции путем деформации клеточной матрицы. Платформа также может быть использована для количественной оценки костной ремоделирования функциональных исходов остеокластов и остеобластов (резорбция/образование).
Abstract
Реконструкция костей является жестко регулируемым процессом, который необходим для роста и ремонта скелета, а также адаптации к изменениям в механической среде. В ходе этого процесса механочувствительные остеоциты регулируют противоположные реакции между катаболическими остеокластами и анаболическими остеобластами. Чтобы лучше понять очень сложные сигнальные пути, которые регулируют этот процесс, наша лаборатория разработала фундаментальную платформу лаборатории на чипе (LOC) для анализа функциональных результатов (формирование и резорбция) ремоделирования костей в рамках мелкомасштабной системы. Поскольку ремоделирование костей является длительным процессом, который происходит на порядок от нескольких недель до нескольких месяцев, мы разработали долгосрочные протоколы культивирования клеток в системе. Остеобласты и остеокласты выращивались на субстратах функциональной активности в пределах LOC и поддерживались до семи недель. После этого, чипы были разобраны, чтобы обеспечить количественную оценку формирования костей и резорбции. Кроме того, мы разработали 3D-печатное механическое устройство погрузки, которое сочетается с платформой LOC и может быть использовано для индуцирования остеоцитов механотрансдукции путем деформации клеточной матрицы. Мы оптимизировали протоколы культивирования клеток для остеоцитов, остеобластов и остеокластов на платформе LOC и рассмотрели проблемы стерильности и цитотоксичности. Здесь мы представляем протоколы для изготовления и стерилизации LOC, посева ячеек на функциональных субстратов, вызывая механическую нагрузку, и разборки LOC для количественной оценки конечных результатов. Мы считаем, что эти методы закладывают основу для разработки истинного органа-на-чип для костной ремоделирования.
Introduction
Кость является высокодинамической тканью, которая требует сложной координации между тремя основными типами клеток: остеоцитами, остеобластами и остеокластастами. Многоклеточные взаимодействия между этими клетками отвечают за потерю костной массы, которая происходит во время паралича и долгосрочной неподвижности, а также за формирование костей, которое происходит в ответ на рост и физические упражнения. Остеоциты, наиболее распространенный тип костных клеток, очень чувствительны к механическим раздражителям, применяемым к кости. Механическая стимуляция изменяет метаболическую активность остеоцитов и приводит к увеличению ключевых сигнальных молекул1,,2. Благодаря этому процессу, известному как механотрансдукция, остеоциты могут непосредственно координировать деятельность остеобластов (костяных образующих клеток) и остеокластов (клетки костного resorbing). Поддержание костного гомеостаза требует жесткой регуляции между формированием костей и скоростью резорбции костей; однако, сбои в этом процессе могут привести к заболеваниям, таким как остеопороз или остеопетроз.
Сложность взаимодействия между этими тремя типами клеток хорошо поддается исследованию с использованием микрофлюидных и лабораторных технологий (LOC). С этой целью наша лаборатория недавно установила доказательство концепции платформы LOC для анализа резорбции костей и формирования (функциональные результаты) в процессе ремоделирования костей. Платформа может быть использована для изучения клеточных взаимодействий, измененных сред погрузки и скрининга наркотиков. В последние годы были разработаны различные микрофлюидные устройства для исследования молекулярных сигнальных путей, которые регулируют ремоделирование костей; однако, многие из этих систем количественно ремоделирования через косвенные маркеры, которые свидетельствуют о функциональной деятельности3,4,,5,,6,7. Преимущество нашей системы в том, что она может быть использована для прямой количественной оценки функциональных результатов. Реконструкция костей является долгосрочным процессом. Таким образом, прямая количественная оценка резорбции и образования костей требует культивирования системы, которая может поддерживаться в течение как минимум нескольких недель домесяцев8,9,,10,11. Таким образом, при разработке платформы LOC, мы установили долгосрочные протоколы культивирования, необходимые для формирования и резорбции и поддерживали клетки в системе до семи недель11. Кроме того, мы включили соответствующие культивирование субстратов для обоих типов клеток в платформу; остеокласты культивировались непосредственно на кости, а остеобласты, которые, как известно, являются пластиковыми приверженцами, культивировались на полистироловых дисках. Далее мы рассмотрели вопросы, касающиеся бесплодия, долгосрочной цитотоксичности и разборки чипов для ремоделирования анализа11,12.
Платформа LOC также может быть использована для индуцирования остеоцитов механотрансдукции через матричную деформацию. 3D печатных механических погрузочных устройств был разработан в паре с LOC и применить статические из плоскости distention растянуть клетки13. Для учета этой механической нагрузки была увеличена глубина скважины в пределах ЛОК. Это небольшое, простое механическое устройство погрузки может быть легко произведено лабораториями с ограниченным инженерным опытом, и мы ранее делились чертежами 3D печатных компонентов13. В текущей работе мы демонстрируем некоторые из новых методов, необходимых для успешного использования LOC. В частности, мы демонстрируем изготовление чипов, посев клеток на функциональных субстратах, механическую загрузку и разборку чипов для ремоделирования количественной оценки. Мы считаем, что объяснение этих методов выгоду от визуального формата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка маски чипа
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1 - 1.3 только должны быть выполнены один раз после первоначального получения маски чипа. Они гарантируют, что маска не кланяется во время использования. Конструкция микрофлюидных масок ранее былаописана 11,,14. Маски были разработаны в доме и коммерчески изготовлены с использованием стереолитографии высокого разрешения(рисунок 1A).
- Обложка верхней поверхности маски с пластиковой пленкой, чтобы защитить эту поверхность от клея. Закрепите маску чипа на акриловом листе одинакового размера с помощью спрея. Зажим части вместе на ночь, чтобы клей полностью вылечить. После того, как клей высохнет, снимите пластиковую пленку с верхней части маски.
- Прикрепите нижнюю часть акрилового листа к 3D печатной выравнивающей коробке(Дополнительная цифра 1, Дополнительные файлы 1-4) с помощью двусторонней ленты. Нажмите твердо, чтобы обеспечить тесную связь.
- Печать любых небольших отверстий возле съемной стенки выравнивания окна с водонепроницаемым герметиком. Разрешить герметик вылечить в течение 24 ч.
- Очистите поверхность маски с помощью 70% этанола (EtOH). Поместите выравнивающую коробку с нужной маской чипа в духовку. Используйте цифровой протрактор, чтобы обеспечить уровень верхней части маски. При необходимости отрегулируйте выравнивающие винты.
2. Изготовление PDMS
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения исследований функциональной активности (формирования и резорбции) используется мелководной (1 мм) конструкция чипа, а для механических погрузочных исследований используется глубоко внушивная (10 мм) конструкция чипа. Дно глубокой скважины формируется путем крепления отдельной тонкой мембраны PDMS(рисунок 1B).
- Слой lid (слой 1)
- Смешайте 63 г преполимера PDMS и 6,3 г лечащий агент (коэффициент 10:1) в пластиковой чашке. Тщательно перемешайте с одноразовым клеточным шпателем и дегазом в вакуумном ошикаторе в течение 30 минут.
- Медленно налейте смесь в подготовленную выравнивающую коробку. Пусть PDMS сидеть в течение 30 минут, а затем выпекать при температуре 45 градусов по Цельсию в течение 18 ч.
- Онажай края PDMS с конической лабораторной шпателем и удалите полимерный лист из выравнивающей коробки.
- Вырезать отдельные крышки до размера (70 мм х 34 мм) с помощью скальпеля и 3D печатных шаблонов.
- Пробить отверстия доступа через каждую крышку с биопсии удар (1 мм в диаметре).
- Поверхность очистить крышки с упаковочной лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если крышки не используются немедленно, оберните каждый в упаковочную ленту и хранить при комнатной температуре (RT).
- Ну и слой микроканала (слой 2)
- Смешайте преполимер PDMS и лечащий агент (коэффициент 10:1) в пластиковом стаканчике. Мелкой хорошо дизайн требует 43 г преполимера и 4,3 г лечебного агента, и глубокой конструкции скважины требует 227 г преполимера и 22,7 г лечебного агента. Смешайте полимер энергично и дегазы в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это предполагает размер маски 152,4 мм х 152,4 мм. - Медленно залить смесью над соответствующей предварительно выровненные маски. Пусть PDMS сидеть в течение 30 минут, а затем выпекать при температуре 45 градусов по Цельсию в течение 18 ч.
- Онащайте края PDMS конической лабораторной шпателем и тщательно снимите полимер от маски. Используйте скальпель и 3D печатный шаблон, чтобы вырезать отдельные фишки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для погрузки исследования важно, чтобы размеры чипа (70 х 34 мм) являются точными и что скважина находится в центре чипа. - Поверхность очистить PDMS с упаковочной лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если чипы не используются немедленно, оберните каждый чип в упаковочную ленту и храните на RT.
- Смешайте преполимер PDMS и лечащий агент (коэффициент 10:1) в пластиковом стаканчике. Мелкой хорошо дизайн требует 43 г преполимера и 4,3 г лечебного агента, и глубокой конструкции скважины требует 227 г преполимера и 22,7 г лечебного агента. Смешайте полимер энергично и дегазы в течение 30 минут.
- Тонкая мембрана PDMS (слой 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот слой используется только для глубокого хорошего дизайна.- Добавьте 12,7 г преполимера PDMS и 1,3 г лечащий агент (коэффициент 10:1) в пластиковый стаканчик. Смешайте энергично и дега в течение 30 минут.
- Медленно залить полимером в подготовленную коробку выравнивания и тщательно соскребать пластиковый стаканчик, чтобы удалить как можно больше PDMS, насколько это возможно.
- Используйте клеточный шпатель для распространения PDMS по всей поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если полимер не распространяется вручную, поверхностного натяжения будет достаточно, чтобы предотвратить полимер от формирования единого листа. - Пусть PDMS сидеть в течение 30 минут, а затем выпекать при температуре 45 градусов по Цельсию в течение 18 ч.
- Онажайте края PDMS с помощью конической шпателя и аккуратно снимите лист PDMS с выравнивающей коробки. Вырезать отдельные мембраны, которые соответствуют размеры слоя 2.
- Измерьте толщину мембраны в центре мембраны с помощью калиперов. Откажитесь от любых мембран, которые находятся за пределами желаемой толщины (0,5 мм и 0,1 мм).
- Тщательно очистить мембраны с упаковочной лентой и поместить на кусок парафина пленки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мембраны не используются немедленно, накройте верхнюю часть мембраны упаковочной лентой и храните на RT.
3. Функциональная деятельность субстратов
ПРИМЕЧАНИЕ: Полистирол диски и костные пластины должны быть прикреплены к нижней части скважин, которые будут использоваться для остеобластных и остеокластских культур, соответственно.
- Полистирол диски(Рисунок 1C)
- Поместите липкую ленту на задней стороне ткани культуры обработаны полистирола coverslip. Вырежьте круглые диски из крышки с помощью заточенного пробкового бора (диаметром 5,4 мм). Погрузите диски в 70% EtOH и оставьте на ночь.
- Аккуратно скраб верхней поверхности диска с хлопком наконечником аппликатор пропитанной в 70% EtOH. Убедитесь, что внешний край диска тщательно очищен.
- Используя две пары щипцы, держите диск и удалите липкую ленту поддержки. Поместите диск обработанной стороны вниз и очистить заднюю сторону с хлопка наконечником аппликатора.
- Опустите деревянный конец хлопка наконечником аппликатора в дегазтированную смесь неизлечимых PDMS и поместите небольшое количество полимера на дно желаемого колодца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся неизлечимые PDMS могут храниться при -20 градусах Цельсия. - Поместите полистирол диск, обработанные вверх, в колодец и осторожно нажмите на диск с ватным тампоном. Убедитесь, что неизлечимый PDMS не соприкасается с обработанной стороной диска.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если PDMS соприкасается с обработанной поверхностью диска, удалите диск из скважины и повторите шаги 3.1.4 и 3.1.5 с новым диском. - Пусть чип сидеть на ровной поверхности в течение 30 минут, а затем выпекать при 65 градусах по Цельсию в течение 4 ч.
- Костные
- Используйте щипцы, чтобы поместить костную пластину (6 мм в диаметре, толщина 0,4 мм) на дно 100-мм тарелки. Держите устойчивый с щипками и осторожно etch 'X' на задней части пластины скальпелем.
ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе визуализации,'X' используется для различения задней части пластины и поверхности, на которой были посеяны клетки. - Используйте деревянный конец хлопка наконечником аппликатора, чтобы добавить небольшое количество неизлечимых PDMS на дно желаемого хорошо. Поместите костную пластину, отмеченную стороной вниз, в колодец и используйте хлопок наконечником аппликатор аппликатор нажать пластины вниз.
- Пусть чип сидеть на ровной поверхности в течение 30 минут, а затем выпекать при 65 градусах по Цельсию в течение 4 ч.
- Используйте щипцы, чтобы поместить костную пластину (6 мм в диаметре, толщина 0,4 мм) на дно 100-мм тарелки. Держите устойчивый с щипками и осторожно etch 'X' на задней части пластины скальпелем.
4. Сборка и стерилизация чипов
- Активируйте поверхности слоя 1 и слоя 2 с плазменным очистителем на 30 с с с помощью средней радиочастотной (РЧ) мощности (эквивалентно примерно 10,2 Вт).
- Выровняйте отверстия доступа в слое 1 с микроканалами в слое 2 и твердо нажмите два слоя вместе.
- Для глубокой конструкции, повторите шаг 4.1 с слоем 2 и слоем 3. Во время плазменной обработки используйте двусторонню ленту, чтобы прикрепить парафина пленки слоя 3 к плоской поверхности.
- Используйте скальпель, чтобы обрезать избыток материала из мембраны PDMS. Тщательно снимите лист парафина пленки со дна чипа
- Выпекать чип при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы увеличить прочность связи между слоями PDMS.
- Вставьте угловые советы дозирования (18 Gauge, 0.5 in, 90 ") в отверстия доступа в крышке. Закрепите распределительный совет к крышке с двумя частью эпоксидной смолы. Используйте наконечник micropipette для нанесения эпоксидной смолы вокруг каждого дозирования наконечника.
- После того, как эпоксидная кислота полностью вылечилась, поверхность очистите чип 70% EtOH и поместите в шкаф биобезопасности. Выполните все последующие шаги в шкафу биобезопасности.
- Подключите 5 мл шприца к распределительным наконечникам со стерильными силиконовыми трубками (1/32' ID, 10 см в длину) и заполните весь чип 70% EtOH не менее 30 с. Для мелкой конструкции, управлять всеми жидкостями со шприцем насос установлен на скорость потока 4 мл / ч. Для глубокой конструкции, управлять всеми жидкостями, медленно распределяя шприц вручную.
- Удалите EtOH из чипа и стерилизовать чип с ультрафиолетовым светом на ночь.
- Вымойте чип 3 раза с dH2O. Заполните чип с dH2O, удалить трубки из дозирования советы и инкубировать, по крайней мере 48 ч при 37 градусов по Цельсию.
5. Сборка механического погрузочного устройства
ПРИМЕЧАНИЕ: Процессы проектирования и изготовления для 3D-печатного механического погрузочного устройства(рисунок 2A-C) были ранее описаны, и все файлы дизайна для печатных компонентов были ранее предоставлены13.
- Автоклав все компоненты погрузочного устройства на 30 мин при 121 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать деформации печатных компонентов, оберните каждый кусок индивидуально в фольгу и место на твердой плоской поверхности во время процесса autoclaving. Металлическое оборудование можно завернуть вместе. Выполните все последующие шаги в шкафу биобезопасности. - Поместите источник сжатия вокруг вала пластины и вставьте пластину в центральное отверстие на дне основания(рисунок 2D).
- Прикрепите блок циферблата к нижней части основания, используя четыре самонажающихся винта.
- Поместите второй источник сжатия вокруг центрального винта. Вставьте винт в шестиугольной форме отверстие в нижней части циферблата и винт сборки в резьбовой отверстие в центре блока циферблата.
- Винт четыре мужчины и женщины противостояние в нижней части базы.
- Удалите слабину с устройства, повернув циферблат против часовой стрелки до тех пор, пока верхняя часть пластины не будет ниже верхней части основания. Затем медленно поверните циферблат по часовой стрелке, пока верхняя часть пластины не будет равен верхней части основания.
6. Эксперименты
ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы для экспериментов функциональной деятельности ранее были предоставлены11,12.
- Погрузочные исследования(рисунок 3)
- Следуя шагу 4.9, используйте 5 мл шприца для удаления dH2O из глубокого колодца чипа. Пальто нижней части скважины с 200 мг/мл типа I коллагена (CTI) в 0,02 М уксусной кислоты в течение 1 ч.
- Промыть чип три раза с фосфат-буфером сольников Dulbecco с кальцием и магнием (DPBS).
- Поместите чип в держатель чипа и семена с остеоцитами MLO-Y4 при плотности 2 х 104 клетки/мл в минимальной существенной альфа-среде (МЭМЗ) дополнены 5% сыворотки икры, 5% сыворотки крупного рогатого скота плода и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Снимите трубку с наконечников дозирования и поместите чип в глубоко внушаемую культурную тарелку (150 мм х 25 мм). Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 72 ч.
- Прикрепите стерильные трубки к распределительным наконечникам и используйте шприц 5 мЛ для удаления отработанного средства культуры из чипа. Медленно распределяйте в свежей среде культуры для пополнения чипа.
- Поместите держатель чипа в прямоугольную вставку в верхней части базы погрузочного устройства. Кормите трубки через слоты, расположенные на крышке погрузочного устройства, и закрепите крышку к основанию четырьмя винтами и гайками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что крышка остается на уровне, сначала закрепите два винта, которые расположены по диагонали друг от друга, прежде чем закрепить оставшиеся два винта. - Нанесите нагрузку на клетки, повернув циферблат по часовой стрелке до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое смещение пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство спроектировано таким образом, что одно вращение циферблата приравнивается к смещению пластины 1 мм. Поле деформации, генерируемое в верхней части мембраны PDMS, ранее моделировалось как функция смещения пластинса с использованием анализа конечного элемента (FEA)13. - Поместите погрузочное устройство в пустую коробку наконечника микропайпета P1000. Инкубировать клетки с прикладной нагрузкой в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера можно служит используемый здесь период загрузки. Можно использовать альтернативные сроки загрузки. - После инкубации удалите нагрузку из клеток, повернув циферблат против часовой стрелки до тех пор, пока пластина не вернется в исходное исходное положение. Снимите крышку с устройства и поместите держатель чипа в глубоко вполне культурную пластину. Инкубировать клетки в течение 90-минутного периода восстановления послегрузо-загрузки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, период восстановления, используемый здесь, служит примером. Можно использовать альтернативные времена восстановления. Для долгосрочных исследований, кормклетки каждые 72 ч. - Используйте 5 мл шприца для удаления кондиционированной среды из чипа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда может быть сохранена и сохранена при -80 градусов по Цельсию. - Удалите чип с держателя чипа и используйте конические шпатель, чтобы разорвать связь между крышкой PDMS и хорошо слоя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые анализы теперь могут быть выполнены после любого протокола, установленного для пластины клеточной культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конфигурация мелкой скважины может быть использована для анализа функциональной активности остеобластов и остеокластов. Формирование костей через остеобласты и резорбцию через остеокласты требует культивирования раз на порядок от нескольких недель до месяцев. Формирование костей из MC3T3-E1 предостережестых остеобластов было количественно с использованием ализарин красный и фон Косса пятна11,15. На 49-й день средняя площадь поверхности, окрашенная ализаринным красным цветом, составила 10,7% и 2,2% (средние стандартные ошибки среднего значения)11. Средняя площадь поверхности, окрашенная фон Косса, составила 6,4% и 1,6%11. Рисунок 4А показывает типичные результаты формирования от остеобластных культур на 49-й день, окрашенный ализарином красным и фон Косса. Резорбция костей от RAW264.7 предварительно остеокласты была количественно с использованием толуидин синий окрашивания 11,15. На 30 день средняя площадь поверхности окрашенных толуидин синий был 30,4% и 4,5%11. Рисунок 4B показывает типичные результаты резорбции костей от остеокластических культур, окрашенных толуидинсиний на 30-й день. Сканирование электронной микроскопии было выполнено для проверки наличия ресорбционных ям. Типичные результаты показаны на рисунке 4C. Эти результаты показывают, что клетки внутри устройства остаются жизнеспособными и функционально активными в течение по крайней мере семи недель.
3D печатных погрузочное устройство было разработано и изготовлено для размещения глубокой хорошо конфигурации чипа. Вместе эта система может вызвать остеоцит механотрансдукции путем растяжения клеток через статические вне плоскости дисцепции. Инкубация микросхемы 48 ч, описанная в шаге 4.9, оказалась критическим процессом для поддержания жизнеспособности клеток и типичной морфологии. Рисунок 5А показывает репрезентативные изображения остеоцитов MLO-Y4 при 72 ч, посеянных в чипсах с этим инкубационным периодом и без нее. Во время приступов нагрузки, остеоциты подвергались градиентштамминд индуцированной на мембране PDMS, на котором клетки были посеяны(Дополнительное видео 1). Эквивалентные штаммы, образовавшиеся в ходе этого процесса, были смоделированы с FEA13, и был определен средний эквивалентный штамм, образующихся в верхней части мембраны PDMS. На рисунке 5B показана связь между средним эквивалентным напряжением и смещением пластин для значений от 1 до 2 мм. Репрезентативная тепловая карта градиента индуцированного штамма показана на рисунке 5C. В этом примере, пластины смещения 1,5 мм генерируется средний эквивалентный штамм 12,29% на верхней части мембраны. Эта модель также демонстрирует, что штаммы, индуцированные вблизи центра скважины, относительно низки и постепенно увеличиваются излучаемо наружу, при этом максимальные штаммы генерируются непосредственно над внешним краем пластины. После погрузки, жизнеспособность клеток была проанализирована с лактата дегидрогеназы окрашивания и аннексии V и мертвых клеток анализ14,16. Типичные результаты показаны на рисунке 5D, E, соответственно.
Рисунок 1: Микрофлюидическое устройство. (A) Изготовление и выравнивание чип маски. (Слева) Схема глубоководной чип-маски, разработанная в доме с использованием программного обеспечения CAD. (Средний) Изображение глубоководной чип-маски, которая была напечатана на коммерческой основе с помощью стереолитографии высокого разрешения. (Справа) Маска помещается в 3D печатную выравнивающую коробку, чтобы обеспечить уровень маски во время литья слоя 2 фишек. (B) Схематические эскизы мелкой скважины и глубокой хорошо конструкции устройства. (Вверху) Конструкция мелкого колодца использовалась для анализа функциональной активности (формирования и резорбции) остеобластов и остеокластов. Эта конфигурация формируется из двух слоев PDMS. Функциональное подсобное действие было закреплено в нижней части культуры задолго до уплотнения слоев вместе. Полистирол диски и костные пластины были использованы для остеобластных и остеокластских культур, соответственно. (Внизу) Я не против. Конструкция глубокого колодца использовалась для нанесения механической нагрузки на остеоциты. Эта конфигурация состоит из трех слоев PDMS. Дно культуры хорошо образовано деформируемой мембраной PDMS (слой 3). (C) Шаги изготовления для полистирола диск, используемый для остеобластных культур. Задняя часть культуры ткани обработанной coverslip была маркирована слипом маскировки. Отдельные диски были вырезаны с пробкой-борер. Диск был очищен этанолом и ватным тампоном. Лента поддержки была удалена и диск был прикреплен к нижней части культуры PDMS хорошо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Проектирование и сборка механического погрузочного устройства. (A) Изображение собранного механического погрузочного устройства. В сочетании с глубокой конструкцией чипа PDMS, погрузочное устройство растягивает клетки, применяя выход из плоскости на деформируемую мембрану. (B) Взорванный вид устройства. Все части, показанные синим цветом, были напечатаны на 3D с термостойкой полилактической кислотой. Все оборудование из нержавеющей стали. (C) Механизм винтового гнезда погрузочного устройства. Вращение центрального винта (оранжевый) толкает пластину (зеленый) вверх через основание. Восходящее движение пластины деформирует мембрану PDMS глубоководного чипа, на котором были посеяны клетки. (D) Процесс сборки погрузочного устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Эксперимент по механической нагрузке. Все жидкости вводились и удалялись из чипа с помощью шприца 5 мл, подключенного к добоу. Важным шагом в этом процессе является инкубация 48 ч со стерильной дистиллированной водой до посева клеток. Без этого инкубационные клетки показали низкую жизнеспособность и нетипичную морфологию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Типичные результаты функциональной активности. (A) Типичные результаты формирования окрашенных с ализарин красный (слева) и фон Косса (справа) от индуцированных MC3T3-E1 остеобластных культур на 49-й день. Диаметр цельного диска составляет 5,4 мм. (B) Типичные результаты резорбции остеокласта от RAW264.7 преостасты индуцированные с активатором рецептора ядерного фактора kappa-B ligand (RANKL). Клетки культивировались на костных пластинах и окрашены толуидином синим в 30-й день. (C) Типичные изображения сканирующей электронной микроскопии, проверяющие наличие резорбционных ям на костных пластинах. Панель масштаба в верхнем изображении представляет 200 мкм, а панель масштаба на нижнем изображении представляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Эффекты механически индуцированной нагрузки на остеоциты. (A) Изображения остеоцитов MLO-Y4 при 72 ч в глубоком колодце чипа, изготовленного с (слева) и без (справа) инкубации 48 ч с дистиллированной водой до посева клеток. (B) Анализ конечных элементов был использован для моделирования среднего эквивалентного штамма, генерируемого в верхней части деформируемой мембраны PDMS на основе смещения пластины погрузочного устройства. Показаны результаты перемещения от 1,0 мм до 2,0 мм. (C) Тепловая карта смоделированного градиента деформации, индуцированного на мембране PDMS для смещения пластины 1,5 мм. (D) Типичные результаты лактата dehydrogenase пятно наркотиков индуцированных остеоцитов, которые были растянуты с помощью 1,5 мм пластины смещения. Вблизи внешнего края скважины наблюдается более легкое окрашивание клеток, что соответствует расположению более высоких значений деформации, свидетельствующих о повреждении клеток и/или смерти. (E) Представитель потока цитометрии результаты нагрузки индуцированного апоптоза, указанные annexin V и мертвых клеток ассее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: 3D печатная выравнивающая коробка со съемной стенкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Выравнивание окна CAD файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 2: Выравнивание окна CAD файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 3: Выравнивание окна CAD файл 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 4: Выравнивание окно аппаратного списка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительное видео 1: Механическое погрузочное устройство. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описаны основы для изготовления кости ремоделирования LOC платформы для культивирования остеоцитов, остеокластов и остеобластов. Изменяя глубину и размер скважины в чипе, были разработаны несколько конфигураций для стимулирования остеоцитов с механической нагрузкой и количественной функциональной оценки функциональных результатов ремоделирования костей(рисунок 1B).
Во время сборки чипов оптимизация протокола окисления плазмы была критической для устранения проблем с утечкой. Мы обнаружили, что обнажение pdMS поверхностей до 30 с кислородной плазмы, генерируемой с помощью средней настройки мощности RF (шаг 4.1), равный примерно 10,2 Вт, было достаточно для создания прочной связи между слоями. Целостность облигаций снизилась при более длительном времени экспозиции или более высокой настройке мощности RF. Это согласуется с предыдущими сообщениями, которые отметили чрезмерное воздействие PDMS на кислородную плазму повышенной поверхности шероховатости и снижение клея17,18.
Кроме того, поддержание высокой жизнеспособности клеток и типичная морфология клеток критически зависела от процесса лечения PDMS. Полимер PDMS состоит из перекрестных диметилсилоксанов олигомеров. Этот процесс перекрестного соединения зависит как от времени, так и от температуры; однако, даже при обширном лечении полимер не удается полностью полимеризировать19. Остальные олигомеры были показаны выщелачивания из объемного полимера в окружающих среды клеточной культуры и даже были найдены в мембранах клеток, выращенных на полимерной поверхности20. Несколько групп сообщили о цитотоксических эффектах от некроссовых олигомеров PDMS21,,22,,23. Чтобы решить эту проблему в нашей системе, мы оптимизировали процесс лечения PDMS. Хотя скорость лечения PDMS зависит от температуры, материальные свойства наших чиповых масок ограничивали температуру лечения до 45 градусов по Цельсию. Таким образом, мы определили, что чипсы должны быть запеченные в течение как минимум 18 ч. Кроме того, мы обнаружили, что инкубация чипов с dH2O, по крайней мере 48 ч до посева клеток (шаг 4,9) было необходимо для уменьшения цитотоксического воздействия. На рисунке 5А показаны остеоциты MLO-Y4, культивированные в чипах с этим инкубационным периодом и без нее.
Конфигурация глубокой скважины, которая была разработана для размещения механического приложения нагрузки, требует, чтобы чип был изготовлен из трех отдельных слоев. В отличие от мелкой хорошо конфигурации, изготовление скважины и мембраны части в качестве одного куска для глубокой конфигурации хорошо вызвало мембраны деформации. Это может быть связано с разницей в темпах лечения между толстыми и тонкими частями чипа. Чтобы преодолеть эту проблему, мембранный слой был построен отдельно и связан ы нижней частью чипа после процесса лечения. Для создания отдельного мембранного слоя с равномерной толщиной, очень важно, чтобы выравнивание окна быть полностью уровне до добавления PDMS (шаг 1.4). Таким образом, использование цифрового протрактора рекомендуется для обеспечения высокой степени точности. Кроме того, во время шага 2.3.2, важно удалить как можно больше PDMS из пластикового стаканчика, как это возможно. Несоответствия на этом этапе приведут к высоким отклонениям толщины мембран и, в конечном счете, к высоким отклонениям в среднем штамме субстрата, используемом для индуцирования остеоцитов механотрансдукции.
Наша платформа реконструкции костей обеспечивает высокую степень универсальности. Эта система может быть использована для исследования различных факторов, которые регулируют ремоделирование костей, таких как нагнетаемая нагрузочная механотрансдукция, многоклеточная сигнализация, воспаление или лекарственные эффекты. Например, система была использована для анализа комбинированных эффектов механической нагрузки и воспаления на костной ремоделирования в медикаментозной индуцированной среде14. Механическая нагрузка применялась к остеоцитам, обработанным бисфосфонатом. Белковый анализ условной среды показал значительное увеличение уровней лептина и остеонектина и значительное снижение уровней CCL21 и CD36 по сравнению с остеоцитами, которые не были механически загружены14.
Представленные здесь протоколы закладывают основу для культивирования каждого типа клеток в пределах LOC, а также методов индуцирования механической нагрузки и количественной оценки функциональной активности. Двигаясь вперед, мы работаем над созданием настоящего костного органа на чипе. Кроме того, мы считаем, что использование нашей системы для разработки математических систем моделирования может значительно улучшить наше понимание сложных многоклеточных процессов сигнализации, которые регулируют костной ремоделирования24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом при Гранте Nos. (CBET 1060990 и EBMS 1700299). Кроме того, этот материал основан на работе, поддерживаемой Программой стипендий Национального научного фонда по стипендии в рамках Гранта No (2018250692). Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, являются мнениями авторов и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
