Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח שיפוץ. עצם בתוך פלטפורמת מעבדה על שבב 3D מודפס התקן טעינה מכני יכול להיות מזווג עם פלטפורמת כדי לגרום אוסטאופציט המכונה מנגנון על ידי ביטול היווצרות מטריצה הסלולר. הפלטפורמה יכולה לשמש גם כדי לכמת העצם שיפוצים שיפוץ התוצאות הפונקציונליות של אוסטאוקלנמשך ו אוסטאופאוטור/היווצרות.
Abstract
שיפוץ עצם הוא תהליך מוסדר היטב הנדרש עבור צמיחת השלד ותיקון, כמו גם הסתגלות לשינויים בסביבה המכנית. במהלך תהליך זה, מכונאי האוסטאופא רגיש לווסת את התגובות הנגדיות בין הcatabolic אוסטאוקלנמשך ו אנבוליים האוסטאופה. כדי להבין טוב יותר את מסלולים איתות מסובכים ביותר המסדירים את תהליך זה, המעבדה שלנו פיתחה מעבדה על-ידי שבב-על-a-chip (LOC) פלטפורמה לניתוח התוצאות פונקציונלי (היווצרות וריפורמציה) של שיפוץ העצם בתוך מערכת בקנה מידה קטן. כמו שיפוץ העצם הוא תהליך ממושך המתרחש בסדר של שבועות עד חודשים, פיתחנו לטווח ארוך פרוטוקולים תא culturing בתוך המערכת. אוסטאוקיים ו osteoclasts גדלו על מצעים פונקציונליים בתוך LOC ונשמר עד שבעה שבועות. לאחר מכן, השבבים היו מפורקים כדי לאפשר את כימות העצם של היווצרות וספיגת העצמות. בנוסף, עיצבנו 3D מודפס טעינת מכשיר מכני כי זוגות עם פלטפורמת LOC והוא יכול לשמש כדי לגרום התמרה מכניזציה על ידי ביטול היווצרות מטריצה הסלולר. יש לנו אופטימיזציה תא culturing פרוטוקולים עבור אוסטאופציטים, האוסטאופתיים, ו osteoclasts חזיקה בתוך פלטפורמת LOC והתייחסו חששות של עקרות ו ציטורעילות. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור בדיית ועיקור של LOC, זריעת תאים על מצעים פונקציונליים, גרימת עומס מכני, ופירוק LOC כדי לכמת תוצאות נקודת הקצה. אנו מאמינים כי טכניקות אלה מניחים את היסודות לפיתוח איבר אמיתי על שבב על שיפוץ העצם.
Introduction
עצם היא רקמה דינמית מאוד הדורשת תיאום מורכב בין שלושת סוגי התאים העיקריים: אוסטאופציטים, אוסטאופה ומחזיק מכשולים. אינטראקציות רב-תאיים בין תאים אלה אחראיות לאובדן העצם המתרחש במהלך שיתוק ובלתי ניידות ארוכת טווח ולהיווצרות העצם המתרחשת בתגובה לצמיחה ולהתעמלות. אוסטאופציטים, הסוג השופע ביותר תא העצם, הם רגישים מאוד גירוי מכני להחיל את העצם. גירוי מכני משנה את הפעילות המטבולית האוסטאופתית ומוביל לעלייה במולקולות איתות מפתח1,2. באמצעות תהליך זה, הידוע בשם מכניזציה, אוסטאופציטים יכול לתאם ישירות את הפעילויות של האוסטאופתית (תאים ויוצרים העצם) ו osteoclasts עצם ספיגת תאים). תחזוקת עצם הומאוסטזיס דורש רגולציה הדוקה בין היווצרות העצם לבין שיעורי ספיגת העצם; עם זאת, שיבושים בתהליך זה יכול לגרום למצבי מחלה כגון אוסטאופורוזיס או אוסטאופאואטזיס.
המורכבות של אינטראקציות בין שלושת סוגי התאים האלה משאיל את עצמה היטב לחקירה באמצעות microfluidic ומעבדה-על-שבב (LOC) טכנולוגיות. לשם כך, המעבדה שלנו הקימה לאחרונה הוכחת המושג של פלטפורמת LOC לניתוח ספיגת עצם והיווצרות (תוצאות פונקציונליות) בתהליך שיפוץ העצם. הפלטפורמה יכולה לשמש לחקר אינטראקציות סלולריות, שינוי סביבות טעינה, והקרנת תרופות למחקר. בשנים האחרונות, התקנים מיקרופלואידיג שונים פותחו לחקירת מסלולים איתות מולקולרי המסדירים שיפוץ העצם; עם זאת, רבים של מערכות אלה לכמת שיפוץ באמצעות סמנים עקיפים הרומז על פעילות תפקודית3,4,5,6,7. יתרון של המערכת שלנו היא כי הוא יכול לשמש לכימות ישיר של תוצאות פונקציונליות. שיפוץ עצם הוא תהליך ארוך טווח. ככזה, כימות ישיר של ספיגת עצם והיווצרות דורש מערכת culturing שניתן לשמור למינימום של מספר שבועות עד חודשים8,9,10,11. כך, בעת פיתוח פלטפורמת LOC, הקמנו פרוטוקולים לטווח ארוך culturing הדרושים להיווצרות וספיגת התאים ושמרו על תאי המערכת במשך עד שבעה שבועות11. בנוסף, אנו שולבו מצעים culturing המתאים לשני סוגי תאים לתוך הפלטפורמה; האוסטאופיויום היו מתורבתים ישירות על העצם, והאוסטאופאוקות, אשר ידועים כחסיד מפלסטיק, היו מתורבתים בדיסקים פוליסטירן. יתרה מזאת, הגענו לסוגיות הנוגעות לעקרות, רעילות לטווח ארוך ופירוק השבב לניתוח שיפוץ11,12.
פלטפורמת LOC יכול לשמש גם כדי לגרום להאצלת מכניציט באמצעות דפורמציה מטריצה. 3D מודפס התקן טעינה מכני פותחה לזוג עם LOC ולהחיל סטטי מתוך distention המטוס כדי למתוח את התאים13. כדי להכיל עומס מכני זה, העומק של הבאר בתוך LOC היה גדל. זה בקנה מידה קטן, מכשיר פשוט טעינה מכני יכול להיות מיוצר בקלות על ידי מעבדות עם ניסיון הנדסי מוגבל, ויש לנו שיתוף בעבר ציורים של רכיבים תלת-ממדיים מודפסים13. בעבודה הנוכחית, אנו מדגימים כמה טכניקות הרומן הדרוש לשימוש מוצלח של LOC. באופן ספציפי, אנו מדגימים הייצור שבב, התאים זריעת על מצעים פונקציונליים, העמסה טעינה מכני שבב עבור שיפוץ כימות. אנו מאמינים שההסבר לטכניקות אלה מפיקים תועלת מתבנית חזותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מסיכת שבב
הערה: שלבים 1.1-1.3 יש לבצע רק פעם אחת על קבלת הקבלה הראשונית של מסיכת השבב. הם מבטיחים שהמסיכה אינה משתחווה במהלך השימוש. העיצוב של המסכות המיקרופלואידיג תיאר בעבר11,14. מסכות תוכננו בתוך הבית מסחרי מפוברק באמצעות סטריאואוליתוגרפיה ברזולוציה גבוהה (איור 1א).
- מכסים את המשטח העליון של המסכה עם ציפוי פלסטיק כדי להגן על פני השטח הזה מפני דבק. לאבטח את מסיכת השבב גיליון אקרילי במידה שווה באמצעות דבק ספריי. הצמד את החלקים יחד ללילה כדי לאפשר דבק כדי לרפא במלואו. לאחר ההדבקה יבש, הסירו את יריעות הפלסטיק מראש המסיכה.
- הצמד את החלק התחתון של גיליון אקרילי לתיבת החלקה מודפסת תלת-ממדית (איור משלים 1, קבצים משלימים 1-4) באמצעות קלטת דו-צידית. לחץ בחוזקה כדי להבטיח קשר הדוק.
- אטום את כל הפתחים הקטנים ליד הקיר ההסרה של תיבת ההחלקה עם איטום עמיד למים. הניחו לחומר האיטום להירפא 24 שעות ביממה.
- נקו את המשטח של המסכה עם 70% אתנול (אטוח). הצב את תיבת ההחלקה עם מסיכת השבב הרצויה בתנור. השתמש מד דיגיטלי כדי להבטיח את החלק העליון של המסיכה היא רמה. כוונן את בורגי ההחלקה במידת הצורך.
2. ייצור PDMS
הערה: עיצוב שבבים רדוד (1 מ"מ) משמש לפעילות פונקציונלית (היווצרות וספיגת מבנה), ועיצוב שבבי היטב (10 מ"מ) משמש ללימודי העמסה מכנית. החלק התחתון של הבאר הוא נוצר על ידי הצמדת קרום PDMS דק נפרד (איור 1B).
- שכבת מכסה (שכבה 1)
- לשלב 63 g של PDMS prepolymer ו 6.3 g של ריפוי סוכן (10:1 יחס) בגביע פלסטיק. מערבבים ביסודיות עם מרית תא חד פעמית ודגה desiccator ואקום עבור 30 דקות.
- יוצקים באיטיות את התערובת לתוך תיבת ההחלקה המוכנה. תן PDMS לשבת 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 45 ° c עבור 18 h.
- שחרר את הקצוות של PDMS עם מרית מעבדה מחודדות ולהסיר את הגיליון פולימר מתוך החלקה תיבת.
- חותכים את העפעפיים הבודדים לגודל (70 מ"מ x 34 מ"מ) באמצעות אזמל ותבנית מודפסת תלת-ממדית.
- פונץ ' הגישה חורים דרך כל מכסה עם אגרוף ביופסיה (קוטר 1 מ"מ).
- פני השטח מנקים את העפעפיים בנייר אריזה.
הערה: אם לא נעשה שימוש בעפעפיים באופן מיידי, השתמש בנייר אריזה ואחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
- ובכן ושכבת מיקרו-ערוצים (שכבה 2)
- לשלב את הסוכן הפרפולימר PDMS ו אשפרה (10:1 יחס) בספל פלסטיק. העיצוב רדוד היטב דורש 43 g של prepolymer ו 4.3 g של ריפוי הסוכן, ואת העיצוב עמוק-היטב דורש 227 g של prepolymer ו 22.7 g של ריפוי סוכן. מערבבים את הפולימר במרץ ודגה עבור 30 דקות.
הערה: זה מניח ממד מסכה של 152.4 מ"מ x 152.4 מ"מ. - יוצקים באיטיות את התערובת על-פני מסיכה מתאימה שלפני החלקה. תן PDMS לשבת 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 45 ° c עבור 18 h.
- שחרר את הקצוות של PDMS עם מרית מעבדה מחודדות ולקלף בזהירות את הפולימר הרחק מן המסכה. השתמש בתבנית מודפסת של אזמל ותלת-ממד כדי לגזור אסימונים בודדים.
הערה: עבור מחקרים העמסה חשוב כי מידות שבב (70 x 34 מ"מ) הם מדויקים, כי הבאר ממוקם במרכז השבב. - פני השטח לנקות את PDMS עם נייר אריזה.
הערה: אם לא נעשה שימוש באסימונים באופן מיידי, עטוף כל שבב בנייר אריזה ומאחסן ב-RT.
- לשלב את הסוכן הפרפולימר PDMS ו אשפרה (10:1 יחס) בספל פלסטיק. העיצוב רדוד היטב דורש 43 g של prepolymer ו 4.3 g של ריפוי הסוכן, ואת העיצוב עמוק-היטב דורש 227 g של prepolymer ו 22.7 g של ריפוי סוכן. מערבבים את הפולימר במרץ ודגה עבור 30 דקות.
- קרום PDMS דק (שכבה 3)
הערה: שכבה זו משמשת רק לעיצוב העמוק.- הוסף 12.7 g של PDMS prepolymer ו 1.3 g של ריפוי סוכן (10:1 יחס) לגביע פלסטיק. מערבבים במרץ ודגה עבור 30 דקות.
- לאט למזוג פולימר לתוך מוכן תיבת החלקה ולגרד ביסודיות גביע פלסטיק כדי להסיר את PDMS הרבה ככל האפשר.
- השתמש מרית התא כדי לפזר PDMS על פני השטח כולו.
הערה: אם הפולימר אינו מתפשט באופן ידני, מתח פני השטח יהיה מספיק כדי למנוע את הפולימר להרכיב סדין אחיד. - תן PDMS לשבת 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 45 ° c עבור 18 h.
- שחרר את הקצוות של PDMS עם מרית מחודדות ובזהירות להסיר את גיליון PDMS מתיבת ההחלקה. חותכים קרומים בודדים המתאימים לממדים של שכבה 2.
- מדוד את עובי הקרום במרכז הקרום באמצעות מחוגות. להיפטר כל הקרומים הנמצאים מחוץ לעובי הרצוי (0.5 מ"מ ± 0.1 מ"מ).
- ממברנות נקי בזהירות עם נייר אריזה ומקום על פיסת סרט פרפין.
הערה: אם הקרומים אינם משמשים באופן מיידי, יש לכסות את החלק העליון של הקרום בנייר אריזה ולאחסן ב-RT.
3. מצעים לפעילות פונקציונלית
הערה: יש לצרף לחלק התחתון של הבארות דיסקים ומוצרי פוליסטירן שישמשו עבור מחוז אוסטאופא ובתרבויות האוסטאואחרונות, בהתאמה.
- פוליסטירן מוקצף (איור 1ג)
- מניחים קלטת מיסוך בצד האחורי של תרבית רקמה מטופלת שמיכות קלקר. חותכים דיסקים עגולים מתוך שמיכות באמצעות שעם מחודד-borer (קוטר 5.4 מ"מ). יש לטבול את הדיסקים ב-70% אטוח ולעזוב את הלילה.
- שפשפי בעדינות את המשטח העליון של הדיסק עם מחבר כותנה משופעת שספוגה ב 70% אטוח. ודא שהקצה החיצוני של הדיסק מתנקה ביסודיות.
- באמצעות שני זוגות של מלקחיים, להחזיק את הדיסק ולהסיר את הגיבוי קלטת המסיכה. מניחים את הדיסק מטופל בצד למטה ולנקות את הצד האחורי עם מחבר כותנה משופעת.
- טובלים את קצה העץ של המוליך כותנה משופעת לתוך תערובת מנטרול של PDMS לא נרפא והמקום כמות קטנה של פולימר בחלק התחתון של הטוב הרצוי.
הערה: ניתן לאחסן את PDMS שנותר בלתי נרפא ב-20 ° c. - מניחים את הקלקר, מטופלים כלפי מעלה, לתוך הבאר ומקישים בעדינות על הדיסק בעזרת ספוגית כותנה. ודא ש-PDMS שלא נרפא מגיע במגע עם הצד המטופל של הדיסק.
הערה: אם PDMS מגיע במגע עם המשטח המטופל של הדיסק, הסר את הדיסק מ3.1.4 היטב וחזור על השלבים הבאים וה3.1.5 עם דיסק חדש. - תן השבב לשבת על משטח רמה עבור 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 65 ° c עבור 4 h.
- מוצרי עצם
- השתמש מלקחיים למקום וופל העצם (6 מ"מ קוטר, 0.4 מ"מ עבה) בחלק התחתון של צלחת 100 מ"מ. להחזיק את וופל קבוע עם מלקחיים ולחרוט בעדינות ' X ' על גבו של וופל עם אזמל.
הערה: במהלך תהליך הדימות, האיקס משמש להבחנה בין החלק האחורי של הפרוסת לבין המשטח שעליו הופרה התאים. - השתמש בקצה העץ של המוליך כותנה משופעת כדי להוסיף כמות קטנה של PDMS לא נרפא לתחתית הבאר הרצויה. מניחים את העצם וופל, מסומן בצד למטה, לתוך הבאר ולהשתמש המוליך כותנה ללחוץ על הופל.
- תן השבב לשבת על משטח רמה עבור 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 65 ° c עבור 4 h.
- השתמש מלקחיים למקום וופל העצם (6 מ"מ קוטר, 0.4 מ"מ עבה) בחלק התחתון של צלחת 100 מ"מ. להחזיק את וופל קבוע עם מלקחיים ולחרוט בעדינות ' X ' על גבו של וופל עם אזמל.
4. הרכבת שבב ועיקור
- הפעל את משטחי שכבה 1 ושכבה 2 עם מנקה פלזמה עבור 30 s באמצעות תדר רדיו בינוני (RF) הגדרת צריכת חשמל (שווה ערך ל-10.2 W).
- יישר את חורי הגישה בשכבה 1 עם המיקרו-ערוצים בשכבה 2 והחזק את שתי השכבות יחד בחוזקה.
- לעיצוב עמוק, חזור על שלב 4.1 עם שכבה 2 ושכבה 3. במהלך הטיפול בפלסמה, השתמש בקלטת דו צדדית כדי לחבר את סרט הפרפין של שכבה 3 למשטח שטוח.
- השתמש באזמל כדי לקצץ את החומר העודף מקרום PDMS. לקלף בזהירות את הסדין של סרט פרפין מהחלק התחתון של השבב
- אופים את השבב ב 65 ° c עבור 10 דקות כדי להגדיל את עוצמת הקשר בין שכבות PDMS.
- הוסף עצות לחילוק בזווית (18 מד, 0.5 בתוך, 90 °) לתוך חורים גישה במכסה. מאבטח את הטיפים מחלקים למכסה עם אפוקסי שני חלקים. השתמשו בעצת מיקרופיפטה כדי למרוח את האפוקסי סביב כל קצה.
- לאחר האפוקסי נרפא לחלוטין, פני השטח לנקות את השבב עם 70% אטוח ומקום בתוך הקבינט אבטחה טיחות. בצע את כל השלבים הבאים בתוך הקבינט אבטחה טיחות.
- לחבר מזרק 5 מ ל לטיפים לחילוק עם אבובים סיליקון סטרילי (1/32 ' ' ID, ~ 10 ס מ אורך) ולמלא את השבב כולו עם 70% אטוח עבור לפחות 30 s. לעיצוב רדוד, לנהל את כל הנוזלים עם משאבת מזרק להגדיר שיעור הזרימה של 4 מ ל/h. עבור העיצוב העמוק, יש לנהל את כל הנוזלים על ידי שליטה איטית של המזרק ביד.
- ולעקר את השבב עם אור UV בלילה.
- שטוף את השבב 3 פעמים עם dH2o. מלא את השבב עם dh2o, להסיר אבובים מן הטיפים לחילוק ו הדגירה עבור לפחות 48 h ב 37 ° c.
5. הרכבה מכנית של מכשיר העמסה
הערה: תהליכי העיצוב והייצור עבור מכשיר הטעינה המכני המודפס תלת-ממדי (איור 2א-ג) תוארו בעבר וכל קבצי העיצוב עבור רכיבים מודפסים סופקו בעבר13.
- התקן את כל הרכיבים של מכשיר הטעינה במשך 30 דקות ב-121 ° c.
הערה: כדי למנוע עיוות של רכיבים מודפסים, עטוף כל חתיכה בנפרד בנייר כסף ומניחים על משטח שטוח וקשה במהלך תהליך האוטוקלינג. ניתן לעטוף את חומרת המתכת ביחד. השלם את כל השלבים הבאים בתוך ארון בטיחות ביולוגי. - מניחים קפיץ דחיסה סביב הפיר של דיו ולהכניס את דיו לתוך החור המרכזי בתחתית הבסיס (איור 2ד).
- חבר את בלוק החיוג לתחתית הבסיס באמצעות ארבעה ברגים עם הקשה עצמית.
- מניחים מעיין דחיסה שנייה סביב הבורג המרכזי. הכנס את הבורג לתוך חור בצורת משושה בתחתית החיוג ובורג את ההרכבה לתוך החור המשורשרת במרכז בלוק החיוג.
- לעזאזל עם ארבעת הנשים. האלה בתחתית הבסיס
- הסר את המרווח מהמכשיר על ידי הפיכת החוגה לנגד כיוון השעון עד שראש הפלטאן נמצא מתחת לראש הבסיס. ואז לאט להפוך את החיוג בכיוון השעון עד החלק העליון של דיו הוא ברמה עם החלק העליון של הבסיס.
6. ניסויים
הערה: פרוטוקולים לניסויים בפעילות פונקציונלית סופקו בעבר11,12.
- מחקרי העמסה (איור 3)
- לאחר שלב 4.9, השתמש במזרק של 5 מ"ל כדי להסיר את dH2O משבב הבאר העמוק. לחלוק את החלק התחתון של הבאר עם 200 μL של 0.15 mg/mL סוג אני קולגן (CTI) ב 0.02 M חומצה אצטית עבור 1 h.
- שטפו את השבב שלוש פעמים עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט באגירה עם סידן ומגנזיום (DPBS + +).
- שבב מקום למחזיק שבב וזרע עם MLO-Y4 אוסטאופציטים בצפיפות של 2 x 104 תאים/mL בינוני חיוני אלפא מינימלי (mlo) שיושלם עם 5% סרום עגל, 5% סרום העוברי העובר, ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
- להסיר את הצינורות מתוך טיפים לחילוק ולמקם את השבב לתוך תבשיל תרבות עמוקה (150 מ"מ x 25 מ"מ). התאים הדגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 72 h.
- לצרף צינורות סטרילי כדי לחילוק טיפים ולהשתמש מזרק 5 מ ל כדי להסיר את המדיום התרבות המושקע מן השבב. באיטיות לוותר בינוני בתרבות טרי כדי למלא את השבב.
- הנח את מחזיק השבב לתוך הכניסה המלבנית בחלק העליון של בסיס התקן הטעינה. להאכיל את אבובים דרך החריצים הממוקמים על מכסה ההתקן טעינת ולאבטח את המכסה לבסיס עם ארבעה ברגים ראש פאן ואגוזים hex.
הערה: כדי לוודא שהמכסה נשאר ברמה, יש לאבטח תחילה שני ברגים הממוקמים באלכסון אחד מהשני לפני אבטחת שני הברגים הנותרים. - החל טעינה על התאים על-ידי הפעלת החוגה בכיוון השעון עד להגעת הפלט הרצוי.
הערה: המכשיר מתוכנן כך סיבוב אחד של החיוג משווה העקירה דיו של 1 מ"מ. שדה הנבג שנוצר בחלק העליון של קרום pdms היה מעוצב בעבר כפונקציה של הזחה דיו באמצעות ניתוח אלמנט סופי (שמציעות)13. - מניחים את התקן הטעינה לתוך תיבת קצה מיקרופיפטה ריקה P1000. מודחלת את התאים עם טעינה שהוחלו עבור 15 דקות.
הערה: תקופת זמן הטעינה שבשימוש כאן משמשת כדוגמה. ניתן להשתמש בזמני טעינה חלופיים. - לאחר הדגירה, להסיר את העומס מהתאים על ידי הפעלת חיוג נגד כיוון השעון עד דיו חוזר לתנוחת ההתחלה המקורית. הסירו את המכסה מהמכשיר והניחו את מחזיק השבב לתוך לוחית התרבות העמוקה. מודיית את התאים עבור תקופה התאוששות העומס 90-min.
הערה: שוב, תקופת זמן ההחלמה המשמשת כאן משמשת כדוגמה. ניתן להשתמש בזמני התאוששות חלופיים. עבור לימודים לטווח ארוך, להאכיל את התאים כל 72 h. - השתמש במזרק של 5 מ"ל כדי להסיר את המדיום הממוזג מהשבב.
הערה: ניתן לשמור ולאחסן במדיום זה ב-80 ° c. - הסר את השבב ממחזיק השבב ולהשתמש מרית מחודדות לשבור את הקשר בין מכסה PDMS ושכבה היטב.
הערה: ניתן לבצע כעת הסלולר בעקבות כל פרוטוקול שנקבע לצלחת תרבות התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התצורה הרדודה-היטב ניתן להשתמש כדי לנתח את הפעילות הפונקציונלית של האוסטאופיואולים והאוסטאופה. היווצרות העצם דרך אוסטאופתיים וספיגת העצמות באמצעות osteoclasts דורש פעמים culturing על הסדר של מספר שבועות עד חודשים. היווצרות העצם מ MC3T3-E1 הטרום האוסטאופה היה ככמת באמצעות אליזרין אדום וואן kossa כתמים11,15. ביום 49, אזור פני השטח הממוצע מוכתם עם aliזרין אדום היה 10.7% ± 2.2% (ממוצע ± שגיאות סטנדרטיות של ממוצע)11. שטח המשטח הממוצע מוכתם פון Kossa היה 6.4% ± 1.6%11. איור 4מראה תוצאות היווצרות אופייני מתרבויות אוסטאופיות ביום 49 מוכתם עם אליזרין אדום ו פון kossa. עצם ספיגת עצמות מ-raw 264.7 pre-אוסטאויוקטיליום היה כימות באמצעות כתמים כחולים טולדין 11,15. ביום 30 באזור פני השטח הממוצע מוכתם כחול טולדין היה 30.4% ± 4.5%11. איור 4B מראה תוצאות ספיגת עצם טיפוסית מתרבויות אוסטאוקלסט מוכתם עם כחול טולדין ביום 30. בוצעה סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני. כדי לאמת את נוכחות הבורות תוצאות טיפוסיות מוצגות באיור 4ג. תוצאות אלה מדגימות כי תאים בתוך המכשיר נשארים פעילים ומבחינה פונקציונלית לפחות שבעה שבועות.
התקן טעינה מודפס תלת-ממדי תוכנן והפוברק כדי להכיל את התצורה של שבב הבאר העמוק. ביחד, המערכת הזאת יכולה לגרום לאוסטאופי מכניציט על ידי המתיחה של התאים דרך מטוס מחוץ סטטי. הדגירה 48 h של השבב המתואר בשלב 4.9 הוכיחה להיות תהליך קריטי לשמירה על הכדאיות של תאים ומורפולוגיה טיפוסית. איור 5הצגת תמונות הנציג של mlo-Y4 אוסטאופציטים ב 72 h הנזרע צ'יפס עם וללא תקופת הדגירה הזו. במהלך התקפי טעינה, האוסטאופציטים נחשפו למעבר מתח שנגרם על ממברנה PDMS שבה התאים הופרה (וידאו משלים 1). הזנים המקבילה שנוצרו במהלך תהליך זה היו במודלעם האחד והזנים המקבילה הממוצע המיוצר בחלק העליון של ממברנה pdms נקבע. איור 5B מציג את הקשר בין המוני המתח הממוצע והזחה באמצעות ההזחה עבור ערכים בין 1 ל-2 מ"מ. מפת חום נציג של מעבר הזנים המושרה מוצג באיור 5ג. בדוגמה זו, העקירה דיו של 1.5 מ"מ שנוצר זן המקבילה הממוצע של 12.29% על גבי הקרום. מודל זה גם מדגים כי זנים המושרה ליד מרכז הבאר הם נמוכים יחסית ובהדרגה להגדיל רדיוally החוצה, עם זנים מקסימלית שנוצר ישירות מעל הקצה החיצוני של platen. לאחר הטעינה, הכדאיות התאית נותחה עם כתמים לקטט דהידרוגנאז ושיטת הקול הנ והתא המתה14,16. תוצאות טיפוסיות מוצגות באיור 5D, E, בהתאמה.
איור 1: התקן מיקרופלואידיג. (א) בדיית והחלקת מסכת השבב. שמאל תרשים סכימטי של מסכת שבבים עמוקה שתוכננה בתוך הבית באמצעות תוכנת CAD. אמצע תמונה של מסכת שבבים עמוק שהודפס באופן מסחרי באמצעות סטריאואוליתוגרפיה ברזולוציה גבוהה. נכון המסיכה ממוקמת בתוך תיבת החלקה מודפסת תלת-ממדית כדי להבטיח שהמסיכה תישאר ברמה במהלך הליהוק של שכבה 2 של האסימונים. (ב) סקיצות סכמטית של העיצוב הרדוד היטב והעמוק של המכשיר. עליון העיצוב הרדוד שימש לניתוח הפעילות הפונקציונלית (היווצרות וספיגת המבנה) של האוסטאופאולים והאוסטאופה. תצורה זו נוצרת משתי שכבות PDMS. מצע פעילות פונקציונלי היה מאובטח לתחתית התרבות היטב לפני איטום השכבות יחד. דיסקים ומוצרי קלקר שימשו לאואובלסט ולתרביות אוסטאוקלסט, בהתאמה. תחתית העיצוב העמוק שימש להחלת עומס מכני על האוסטאופציטים. תצורה זו מורכבת משלוש שכבות PDMS. החלק התחתון של התרבות היטב נוצרת על ידי קרום PDMS מסוג (שכבה 3). (ג) צעדי ייצור לפוליסטירן מוקצף המשמש לתרביות אוסטאופיות. החלק האחורי של תרבות הרקמה. המטופלת סומן בסרט מיסוך דיסקים בודדים נחתכו עם פקק שעם. הדיסק נוקה באמצעות אתנול ומנקי כותנה. הגיבוי של הקלטת הוסר והדיסק צורף לחלק התחתון של תרבות PDMS היטב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עיצוב והרכבה של מכשיר הטעינה המכני. (א) תמונה של מתקן טעינה מכני מורכב. כאשר ביחד עם העיצוב העמוק של שבב PDMS, המכשיר טוען מותח תאים על ידי החלת מתוך distention מטוס לקרום deformable. (ב) התפוצץ-תצוגת ההתקן. כל החלקים המוצגים בכחול היו תלת-ממד הודפס עם חוט חום החומצה התרמותית עמידים. כל החומרה היא נירוסטה. (ג) לעזאזל ג'ק מנגנון של מכשיר הטעינה. סיבוב של הבורג המרכזי (כתום) דוחף את הפלטאן (ירוק) כלפי מעלה דרך הבסיס. התנועה כלפי מעלה של דיו עיקום ממברנה pdms של השבב היטב שעליו התאים נזרע. (ד) הליך ההרכבה של התקן הטעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניסוי העמסה מכני. כל הנוזלים היו מנוהלים והוסרו מן השבב באמצעות מזרק 5 מ ל מחובר אבובים גישה. צעד קריטי בתהליך זה הוא הדגירה 48 h עם מים מזוקקים סטרילי לפני זריעת תאים. ללא תאי הדגירה הללו הראו יכולת. הכדאיות הנמוכה והמבנה הטיפוסי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות פעילות פונקציונלית אופיינית. (א) תוצאות היווצרות אופייני עם aliזרין אדום (משמאל) ו פון Kossa (מימין) מן המושרה MC3T3-E1 התרבויות האוסטאופעות ביום 49. תמונות דיסק שלם למדוד 5.4 מ"מ קוטר. (ב) אופייני האוסטאופהאחרון תוצאות ספיגת 264.7 preosteoclasts מושרה עם activator הקולטן של הגורם הגרעיני קפא-B ליגנד (rankl). תאים היו מתורבתים על העצם ומוכתם בכחול טולדין ביום 30. (C) אופייני לסריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרוני המאמתת נוכחות של בורות ספיגת עצמות על וופלים. סרגל קנה המידה בתמונה העליון מייצג 200 יקרומטר ושבר קנה המידה בתמונה התחתונה מייצג 50 יקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ההשפעות של זן מכני המושרה על האוסטאופציטים. (A) תמונות של MLO-Y4 אוסטאופציטים ב 72 h ב-היטב השבב מפוברק עם (משמאל) ובלי (מימין) הדגירה 48 h עם מים מזוקקים לפני זריעת תאים. (ב) ניתוח האלמנט הסופי נעשה שימוש כדי לדגמן את הנבג המקביל הממוצע שנוצר על החלק העליון של הממברנה מסוג pdms מבוסס על העקירה של התקן טעינת platen. תוצאות מdisplacements בין 1.0 מ"מ ו 2.0 מ"מ מוצגים. (ג) החום המפה של מעבר הצבע המודל המושרה על קרום pdms עבור העקירה דיו של 1.5 מ"מ. (D) התוצאות האופייניות של הכתם לקטט דיגנאז של התרופה הנגרמת אוסטאופציטים שהיו מתוחות באמצעות הזחה 1.5 מ"מ. כתמים תא המצית נצפה ליד הקצה החיצוני של הבאר, אשר מתאים למיקום של ערכי זן גבוה מעיד על נזק לתאים ו/או מוות. (ה) מייצג הזרימה cy, התוצאות של ואפופטוזיס המושרה המצוין על ידי שיטת הV והתא מתים מוכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: החלקה מודפס תלת-ממד עם קיר להסרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: מחלקת החלקה קובץ CAD 1. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
קובץ משלים 2: תיבת החלקה CAD קובץ 2. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
קובץ משלים 3: מחלקת החלקה קובץ CAD 3. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
קובץ משלים 4: רשימת החומרה של תיבת החלקה. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
וידאו משלים 1: התקן טעינה מכני. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר את היסודות עבור בדיית העצם שיפוצים LOC פלטפורמה עבור culturing אוסטאופציטים, אוסטאופתיים ומחזיק מכשולים. על ידי שינוי עומק וגודל של הבאר בתוך השבב, תצורות מרובות פותחו עבור מגרה אוסטאופציטים עם עומס מכני ובדיקת תוצאות פונקציונליות של שיפוץ העצם (איור 1B).
במהלך הרכבת שבב, אופטימיזציה של פרוטוקול חמצון פלזמה היה קריטי לסילוק חששות דליפה. מצאנו כי חשיפת משטחים PDMS כדי 30 s פלזמה חמצן שנוצר באמצעות הגדרה בינונית כוח RF (שלב 4.1), שווה כ 10.2 W, היה מספיק כדי ליצור קשר חזק בין השכבות. שלמות הקשר ירדה כאשר השתמשו בזמני חשיפה ארוכים יותר או בהגדרת כוח RF גבוהה יותר. הדבר מתאים לדיווחים קודמים שציינו חשיפה מוגברת של pdms לפלזמה חמצן מוגבר לפני השטח ולירידה בספיחה17,18.
בנוסף, שמירה על הכדאיות התאית הגבוהה ומורפולוגיה התא האופייני הייתה תלויה באופן קריטי בתהליך הריפוי של PDMS. פולימר PDMS מורכב של diמתיל siloxane oligomers מקושרים. תהליך זה המקשר הוא גם הזמן והטמפרטורה תלוי; עם זאת, גם עם ריפוי נרחב הפולימר נכשל באופן מקיף19. Oligomers הנותרים הוכחו ליץ ' מתוך הפולימר בתפזורת לתוך המדיום תרבות התא המקיף ואפילו נמצאו הקרומים של תאים גדלו על פני שטח פולימרי20. מספר קבוצות דיווחו על אפקטים ציטוטוקסיים מ-pdms בלתי-מקושרים21שלהקבוצה 21,22,23. כדי לטפל בדאגה זו במערכת שלנו, אנו אופטימיזציה לתהליך הריפוי של PDMS. למרות שקצב הריפוי של PDMS הוא תלוי בטמפרטורה, תכונות החומר של מסכות השבב שלנו הגבילו את טמפרטורת הריפוי שלנו עד 45 ° c. ככזה, קבענו כי האסימונים צריך להיות אפוי לפחות 18 h. עוד, גילינו כי שבבי הדגירה עם dH2O עבור לפחות 48 h לפני זריעת תאים (שלב 4.9) היה הכרחי כדי להפחית את ההשפעות ציטוטוקסיניים. איור 5מראה mlo-Y4 אוסטאופציטים תרבותי בצ עם ובלי תקופת הדגירה הזאת.
התצורה העמוקה היטב, אשר תוכננה כדי להתאים את יישום עומס מכני, דורש כי השבב יהיה מפוברק משלוש שכבות נפרדות. בניגוד לתצורה רדודה-היטב, בדיית היטב את החלקים הממברנה כמו חתיכה אחת עבור התצורה העמוקה היטב גרם הקרום עיוות. ייתכן שהסיבה לכך היא הבדל בריפוי התעריפים בין החלקים העבים והדקים של השבב. כדי להתגבר על בעיה זו, שכבת הממברנה נבנתה בנפרד והתחברה לתחתית השבב לאחר תהליך הריפוי. כדי ליצור שכבת ממברנה נפרדת בעובי אחיד, חשוב שתיבת ההחלקה תהיה לגמרי ברמה לפני הוספת ה-PDMS (שלב 1.4). ככזה, השימוש ב-מד דיגיטלי מומלץ להבטיח רמת דיוק גבוהה. בנוסף, במהלך שלב 2.3.2, זה קריטי להסיר כמו PDMS הרבה מתוך גביע פלסטיק ככל האפשר. חוסר עקביות בשלב זה יוביל לסטיות גבוהות בעוביים ממברנות, ובסופו של דבר סטיות גבוהות בלחץ המצע הממוצע המשמש לזירוז מכניציט.
פלטפורמת שיפוץ העצם שלנו מספק רמה גבוהה של רב-תכליתיות. מערכת זו ניתן להשתמש כדי לחקור מגוון של גורמים המסדירים שיפוץ העצם, כגון מכניקציה המושרה עומס, איתות רב-תאי, דלקת, או אפקטים של תרופות. לדוגמה, המערכת שימש לניתוח ההשפעות המשולבות של עומס מכני ודלקת על שיפוץ העצם בסביבה הנגרמת על ידי תרופות14. עומס מכני הוחל על ביספונוציטים שטופלו באמצעות אוסטאופני. ניתוח חלבון של המדיום הממוזג חשף גידול משמעותי ברמות של לפטין, אוסטאופנית וירידה משמעותית ברמות של CCL21 ו CD36 כאשר הושווה אוסטאופציטים שלא נטענו מכנית14.
הפרוטוקולים המוצגים כאן לספק בסיס עבור culturing כל סוג תא בתוך LOC, כמו גם שיטות לגרימת עומס מכני ופעילות תפקודית כמותית. ממשיכים הלאה, אנחנו עובדים לקראת. איבר עצם אמיתי על שבב בנוסף, אנו מאמינים כי השימוש במערכת שלנו כדי לפתח מערכות דוגמנות מתמטית יכול לשפר מאוד את ההבנה שלנו של תהליכים מורכבים איתות מרוכבים המווסת שיפוץ עצם24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט Nos. (CBET 1060990 ו-EBMS 1700299). כמו כן, חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על-ידי תוכנית המלגות למחקר בוגר קרן המדע הארצי תחת גרנט No. (2018250692). כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות המתבטאת בחומר זה הן של המחברים והן אינן משקפות בהכרח את השקפות הקרן הלאומית למדע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
