Summary
Qui presentiamo protocolli per l'analisi del rimodellamento osseo all'interno di una piattaforma lab-on-a-chip. Un dispositivo di caricamento meccanico stampato in 3D può essere accoppiato con la piattaforma per indurre la mechanostransduction osteocite deformando la matrice cellulare. La piattaforma può essere utilizzata anche per quantificare i risultati funzionali del rimodellamento osseo da osteoclasti e osteoblasti (risorption/formazione).
Abstract
Il rimodellamento osseo è un processo strettamente regolamentato che è necessario per la crescita e la riparazione scheletriche, nonché per adattarsi ai cambiamenti nell'ambiente meccanico. Durante questo processo, gli osteociti meccanosensibili regolano le risposte opposte tra gli osteoclasti catabolizzanti e gli osteoblasti anabolizzanti. Per comprendere meglio i percorsi di segnalazione altamente intricati che regolano questo processo, il nostro laboratorio ha sviluppato una piattaforma di base lab-on-a-chip (LOC) per l'analisi dei risultati funzionali (formazione e riassorbimento) del rimodellamento osseo all'interno di un sistema su piccola scala. Poiché il rimodellamento osseo è un processo lungo che si verifica nell'ordine di settimane o mesi, abbiamo sviluppato protocolli di coltura cellulare a lungo termine all'interno del sistema. Gli osteoblasti e gli osteoclasti sono stati coltivati su substrati di attività funzionale all'interno del LOC e mantenuti per un massimo di sette settimane. Successivamente, i chip sono stati smontati per consentire la quantificazione della formazione ossea e il riassorbimento. Inoltre, abbiamo progettato un dispositivo di caricamento meccanico stampato in 3D che si accoppia con la piattaforma LOC e può essere utilizzato per indurre l'osteocite mechanotraduzione deformando la matrice cellulare. Abbiamo ottimizzato i protocolli di coltura cellulare per osteociti, osteoblasti e osteoclasti all'interno della piattaforma LOC e abbiamo affrontato le preoccupazioni di sterilità e citotossicità. Qui presentiamo i protocolli per la fabbricazione e la sterilizzazione del LOC, il seeding delle cellule su substrati funzionali, l'induzione del carico meccanico e la disassemblaggio del LOC per quantificare i risultati degli endpoint. Crediamo che queste tecniche gettano le basi per lo sviluppo di un vero e proprio organo su un chip per il rimodellamento osseo.
Introduction
L'osso è un tessuto altamente dinamico che richiede una coordinazione intricata tra i tre principali tipi di cellule: osteociti, osteoblasti e osteoclasti. Le interazioni multicellulari tra queste cellule sono responsabili della perdita ossea che si verifica durante la paralisi e l'immobilità a lungo termine e per la formazione ossea che si verifica in risposta alla crescita e all'esercizio fisico. Gli osteociti, il tipo di cellula ossea più abbondante, sono altamente sensibili agli stimoli meccanici applicati all'osso. La stimolazione meccanica altera l'attività metabolica degli osteociti e porta ad un aumento delle molecole chiave di segnalazione1,2. Attraverso questo processo, noto come meccanotra, gli osteociti possono coordinare direttamente le attività degli osteoblasti (cellule che formano le ossa) e degli osteoclasti (cellule di risordiamento osseo). Mantenere l'omeostasi ossea richiede una stretta regolazione tra la formazione ossea e i tassi di risurrezione ossea; tuttavia, le interruzioni in questo processo possono provocare stati di malattia come l'osteoporosi o l'osteopetrosi.
La complessità delle interazioni tra questi tre tipi di cellule si presta bene allo studio utilizzando tecnologie microfluidiche e lab-on-a-chip (LOC). A tal fine, il nostro laboratorio ha recentemente stabilito la prova del concetto di piattaforma LOC per l'analisi del riordino osseo e della formazione (risultati funzionali) nel processo di rimodellamento osseo. La piattaforma può essere utilizzata per lo studio delle interazioni cellulari, degli ambienti di carico alterati e dello screening dei farmaci investigativo. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati vari dispositivi microfluidici per studiare le vie di segnalazione molecolare che regolano il rimodellamento osseo; tuttavia, molti di questi sistemi quantificano il rimodellamento attraverso marcatori indiretti che sono indicatividell'attivitàfunzionale 3,4,5,6,7. Un vantaggio del nostro sistema è che può essere utilizzato per la quantificazione diretta dei risultati funzionali. Il rimodellamento osseo è un processo a lungo termine. Come tale, la quantificazione diretta di ritorsione e formazione ossea richiede un sistema di coltura che può essere mantenuto per un minimo di settimane a mesi8,9,10,11. Così, durante lo sviluppo della piattaforma LOC, abbiamo stabilito protocolli di coltura a lungo termine necessari per la formazione e il riassorbimento e abbiamo mantenuto le cellule all'interno del sistema per un massimo di sette settimane11. Inoltre, abbiamo incorporato nella piattaforma i substrati di coltura appropriati per entrambi i tipi di cellule; Gli osteoclasti sono stati coltivati direttamente sulle ossa, e gli osteoblasti, che sono noti per essere aderenti di plastica, sono stati coltivati su dischi di polistirolo. Inoltre, abbiamo affrontato questioni riguardanti la sterilità, la citotossicità a lungo termine e lo smontaggio del chip per il rimodellamento dell'analisi11,12.
La piattaforma LOC può essere utilizzata anche per indurre l'osteocite mechanotratrante attraverso la deformazione della matrice. È stato sviluppato un dispositivo di caricamento meccanico stampato in 3D per l'associazione con il LOC e applicare una distensione statica fuori dal piano per allungare le celle13. Per contenere questo carico meccanico, la profondità del pozzo all'interno del LOC è stata aumentata. Questo dispositivo di caricamento meccanico semplice e su piccola scala può essere facilmente prodotto da laboratori con esperienza ingegneristica limitata, e in precedenza abbiamo condiviso disegni dei componenti stampati in 3D13. Nel lavoro attuale, dimostriamo alcune delle nuove tecniche necessarie per il successo dell'uso del LOC. In particolare, dimostriamo la fabbricazione di chip, la semina cellulare su substrati funzionali, il carico meccanico e lo smontaggio del chip per la quantificazione di rimodellamento. Crediamo che la spiegazione di queste tecniche tragga vantaggio da un formato visivo.
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Protocol
1. Preparazione maschera di truciolo
NOTA: i passaggi 1.1 - 1.3 devono essere eseguiti una sola volta al ricevimento iniziale della maschera di truciolo. Assicurano che la maschera non si inchini durante l'uso. La progettazione delle maschere microfluidiche è stata descritta in precedenza11,14. Le maschere sono state progettate internamente e fabbricate commercialmente utilizzando una stereolitografia ad alta risoluzione (Figura 1A).
- Coprire la superficie superiore della maschera con fogli di plastica per proteggere questa superficie dall'adesivo. Fissare la maschera chip ad un foglio acrilico di dimensioni uguali utilizzando adesivo spray. Bloccare i pezzi insieme durante la notte per consentire all'adesivo di curare completamente. Dopo che l'adesivo è asciutto, rimuovere i fogli di plastica dalla parte superiore della maschera.
- Fissare la parte inferiore del foglio acrilico a una scatola di livellamento stampata in 3D (Supplementary Figure 1, Supplementary Files 1-4) utilizzando un nastro fronte/retro. Premere con fermezza per garantire un legame stretto.
- Sigillare eventuali piccole aperture vicino alla parete staccabile della scatola di livellamento con un sigillante impermeabile. Lasciare che il sigillante guarisca per 24 ore.
- Pulire la superficie della maschera con 70% di etanolo (EtOH). Posizionare la scatola di livellamento con la maschera di truciolo desiderata nel forno. Utilizzare un goniometro digitale per garantire che la parte superiore della maschera sia livellata. Se necessario, regolare le viti di livellamento.
2. Fabbricazione PDMS
NOTA: Per gli studi di carico meccanici viene utilizzato un progetto di chip a pozzo poco profondo (1 mm) e per gli studi di carico meccanico viene utilizzato un design di chip di pozzo profondo (10 mm). Il fondo del pozzo profondo si forma attaccando una membrana PDMS sottile separata (Figura 1B).
- Strato di coperchio (strato 1)
- Unire 63 g di prepomero PDMS e 6,3 g di agente di polimero (rapporto 10:1) in una tazza di plastica. Mescolare accuratamente con una spatola cellulare usa e getta e degas in un desiccatore vuoto per 30 min.
- Versare lentamente la miscela nella scatola di livellamento preparata. Lasciare il PDMS sedersi per 30 min e poi cuocere a 45 gradi centigradi per 18 ore.
- Allenta i bordi del PDMS con una spatola da laboratorio rastremata e rimuovi il foglio polimerico dalla scatola di livellamento.
- Tagliare i singoli coperchi a misura (70 mm x 34 mm) utilizzando un bisturi e un modello stampato in 3D.
- Foratura di accesso fori attraverso ogni coperchio con un punzone biopsia (diametro 1 mm).
- Pulire i coperchi con nastro da imballaggio.
NOTA: Se i coperchi non vengono utilizzati immediatamente, avvolgere ciascuno in nastro da imballaggio e conservarli a temperatura ambiente (RT).
- Strato di pozzo e microcanale (livello 2)
- Unire il prepolimero PDMS e l'agente di polimerazione (rapporto 10:1) in una tazza di plastica. Il design a pozza poco profondi richiede 43 g di prepolimero e 4,3 g di agente di polimerità, e il design del pozzo profondo richiede 227 g di prepolimero e 22,7 g di agente di polimerità. Mescolare vigorosamente il polimero e degas per 30 min.
NOTA: si presuppone una dimensione della maschera di 152,4 mm x 152,4 mm. - Versare lentamente la miscela sulla maschera prelivellata appropriata. Lasciare il PDMS sedersi per 30 min e poi cuocere a 45 gradi centigradi per 18 ore.
- Allenta recare i bordi del PDMS con una spatola da laboratorio affiatata e staccate accuratamente il polimero dalla maschera. Utilizzare un bisturi e modello stampato in 3D per tagliare i singoli chip.
NOTA: Per gli studi di carico è importante che le dimensioni del chip (70 x 34 mm) siano precise e che il pozzo si trovi al centro del chip. - Pulire il PDMS con nastro da imballaggio.
NOTA: Se i chip non vengono utilizzati immediatamente, avvolgere ogni chip in nastro da imballaggio e conservarlo in RT.
- Unire il prepolimero PDMS e l'agente di polimerazione (rapporto 10:1) in una tazza di plastica. Il design a pozza poco profondi richiede 43 g di prepolimero e 4,3 g di agente di polimerità, e il design del pozzo profondo richiede 227 g di prepolimero e 22,7 g di agente di polimerità. Mescolare vigorosamente il polimero e degas per 30 min.
- Membrana PDMS sottile (Livello 3)
NOTA: Questo strato viene utilizzato solo per il design del pozzo profondo.- Aggiungere 12,7 g di prepolimero PDMS e 1,3 g di agente di polimero (rapporto 10:1) a una tazza di plastica. Mescolare vigorosamente e degas per 30 min.
- Versare lentamente il polimero nella scatola di livellamento preparata e raschiare accuratamente la tazza di plastica per rimuovere il più PDMS possibile.
- Utilizzare spatola cellulare per diffondere PDMS su tutta la superficie.
NOTA: Se il polimero non viene steso manualmente, la tensione superficiale sarà sufficiente per impedire al polimero di formare un foglio uniforme. - Lasciare il PDMS sedersi per 30 min e poi cuocere a 45 gradi centigradi per 18 ore.
- Allenta i bordi del PDMS con una spatola rasodata e rimuovi con attenzione il foglio PDMS dalla scatola di livellamento. Tagliare le singole membrane che corrispondono alle dimensioni dello strato 2.
- Misurare lo spessore della membrana al centro della membrana utilizzando pinze. Eliminare le membrane che si trovano al di fuori dello spessore desiderato (0,5 mm e 0,1 mm).
- Pulire con cura le membrane con nastro da imballaggio e posizionare su un pezzo di pellicola di paraffina.
NOTA: Se le membrane non vengono utilizzate immediatamente, coprire la parte superiore della membrana con nastro da imballaggio e conservare a RT.
3. Substrati di attività funzionale
NOTA: I dischi di polistirolo e i wafer ossei devono essere attaccati al fondo dei pozzi che verranno utilizzati rispettivamente per le colture osteoblaste e osteoclasthe.
- Dischi in polistirolo (Figura 1C)
- Posizionare il nastro adesivo sul retro di una coverslip in polistirolo trattato con coltura. Tagliare i dischi circolari dal coperchio utilizzando un cavaza-borer affilato (5,4 mm di diametro). Sommergi i dischi nel 70% EtOH e lascia la notte.
- Strofinare delicatamente la superficie superiore del disco con un applicatore con punta di cotone imbevuto di 70% EtOH. Assicurarsi che il bordo esterno del disco sia accuratamente pulito.
- Utilizzando due coppie di pinze, tenere premuto il disco e rimuovere il nastro adesivo. Posizionare il lato trattato con disco verso il basso e pulire il lato posteriore con un applicatore con punta di cotone.
- Immergere l'estremità in legno di un applicatore con punta di cotone in una miscela degassata di PDMS non curata e posizionare una piccola quantità di polimero sul fondo del pozzo desiderato.
NOTA: il PDMS rimanente non assistito può essere memorizzato a -20 gradi centigradi. - Posizionare il disco di polistirolo, trattato lato verso l'alto, nel pozzo e premere delicatamente verso il basso sul disco con un tampone di cotone. Assicurarsi che nessun PDMS non curato entri in contatto con il lato trattato del disco.
NOTA: Se PDMS entra in contatto con la superficie trattata del disco, rimuovere il disco dal pozzo e ripetere i passaggi 3.1.4 e 3.1.5 con un nuovo disco. - Lasciare il chip sedersi su una superficie piana per 30 min e poi cuocere a 65 gradi centigradi per 4 ore.
- Wafer ossei
- Utilizzare le pinze per posizionare un wafer osseo (6 mm di diametro, 0,4 mm di spessore) sul fondo di un piatto di 100 mm. Tenere il wafer fermo con le pinze e incidere delicatamente una 'X' sul retro del wafer con un bisturi.
NOTA: Durante il processo di imaging, la "X" viene utilizzata per distinguere tra la parte posteriore del wafer e la superficie su cui sono state semiizzate le cellule. - Utilizzare l'estremità in legno di un applicatore con punta di cotone per aggiungere una piccola quantità di PDMS non curata sul fondo del pozzo desiderato. Posizionare il wafer osseo, segnato lato verso il basso, nel pozzo e utilizzare un applicatore con punta di cotone per premere il wafer verso il basso.
- Lasciare il chip sedersi su una superficie piana per 30 min e poi cuocere a 65 gradi centigradi per 4 ore.
- Utilizzare le pinze per posizionare un wafer osseo (6 mm di diametro, 0,4 mm di spessore) sul fondo di un piatto di 100 mm. Tenere il wafer fermo con le pinze e incidere delicatamente una 'X' sul retro del wafer con un bisturi.
4. Assemblaggio e sterilizzazione dei trucioli
- Attivare le superfici di strato 1 e strato 2 con un detergente al plasma per 30 s utilizzando un'impostazione di potenza a radiofrequenza media (RF) (equivalente a circa 10,2 W).
- Allineare i fori di accesso nello strato 1 con i microcanali nello strato 2 e premere saldamente i due strati insieme.
- Per il design del pozzo profondo, ripetere il passaggio 4.1 con lo strato 2 e lo strato 3. Durante il trattamento al plasma, utilizzare nastro a doppio lato per attaccare la pellicola di paraffina dello strato 3 ad una superficie piana.
- Utilizzare un bisturi per tagliare il materiale in eccesso dalla membrana PDMS. Sbucciare con cura il foglio di pellicola di paraffina dal fondo del chip
- Cuocere il chip a 65 gradi centigradi per 10 min per aumentare la forza del legame tra gli strati PDMS.
- Inserire punte di erogazione angolari (18 misuratore, 0,5 pollici, 90 gradi) nei fori di accesso nel coperchio. Fissare le punte di erogazione al coperchio con una resina epossidica in due parti. Utilizzare una punta di micropipette per applicare la resina epossidica intorno a ciascuna punta di erogazione.
- Dopo che la resina epossidica è completamente curata, pulire la superficie del chip con 70% EtOH e posizionare in un armadio di biosicurezza. Eseguire tutti i passaggi successivi all'interno dell'armadio di biosicurezza.
- Collegare una siringa da 5 mL alle punte di erogazione con tubi sterili in silicone (ID 1/32'' , 10 cm di lunghezza) e riempire l'intero chip con il 70% EtOH per almeno 30 s. Per il design di pozzi poco profondi, somministrare tutti i liquidi con una pompa di siringa impostata su una portata di 4 mL/h. Per il design del pozzo profondo, somministrare tutti i liquidi dispensando lentamente la siringa a mano.
- Rimuovere l'EtOH dal chip e sterilizzare il chip con luce UV durante la notte.
- Lavare il chip 3 volte con dH2O. Riempire il chip con dH2O, rimuovere i tubi dalle punte di erogazione e incubare per almeno 48 h a 37 gradi centigradi.
5. Assemblaggio del dispositivo di caricamento meccanico
NOTA: i processi di progettazione e fabbricazione per la periferica di caricamento meccanico stampata in 3D (Figura 2A-C) sono stati descritti in precedenza e tutti i file di progettazione per i componenti stampati sono stati precedentemente forniti13.
- Autoclave tutti i componenti del dispositivo di carico per 30 min a 121 gradi centigradi.
NOTA: Per evitare la deformazione dei componenti stampati, avvolgere ogni pezzo singolarmente in un foglio e posizionarlo su una superficie piana dura durante il processo di autoclavazione. L'hardware metallico può essere avvolto insieme. Completare tutti i passaggi successivi all'interno di un armadio di biosicurezza. - Posizionare una molla di compressione intorno all'albero della piastra e inserire la piastra nel foro centrale sul fondo della base (Figura 2D).
- Fissare il blocco di quadrante alla parte inferiore della base utilizzando quattro viti auto-tapping.
- Posizionare una seconda molla di compressione intorno alla vite centrale. Inserire la vite nel foro a forma di esagonale nella parte inferiore del quadrante e avvitare l'assieme nel foro filettato al centro del blocco del quadrante.
- Al vite quattro ricadute maschio-femmina nella parte inferiore della base.
- Rimuovere il margine di flessibilità dal dispositivo ruotando il quadrante in senso antiorario fino a quando la parte superiore del piatto è sotto la parte superiore della base. Quindi ruotare lentamente il quadrante in senso orario fino a quando la parte superiore del piatto è livellata con la parte superiore della base.
6. Sperimentazione
NOTA: i protocolli per gli esperimenti di attività funzionale sono stati precedentemente forniti11,12.
- Studio sul carico (Figura 3)
- Dopo il passaggio 4.9, utilizzare una siringa da 5 mL per rimuovere dH2O dal chip deep-well. Coprire il fondo del pozzo con 200 x L di 0,15 mg/mL di tipo I collagene (CTI) in acido acetico 0,02 M per 1 h.
- Sciacquare il chip tre volte con la salina con tamponamento di fosfato di Dulbecco con calcio e magnesio (DPBS).
- Posizionare il chip nel supporto del chip e seme con osteociti MLO-Y4 ad una densità di 2 x 104 celle/mL nel mezzo alfa essenziale minimo (MEM) integrato con il 5% di siero di vitello, il 5% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina.
- Togliere il tubo dalle punte di erogazione e mettere il chip in un piatto di coltura profonda (150 mm x 25 mm). Incubano le cellule a 37 e il 5% di CO2 per 72 h.
- Collegare tubi sterili alle punte di erogazione e utilizzare una siringa da 5 mL per rimuovere il mezzo di coltura esaurito dal chip. Distribuisci lentamente nel mezzo di coltura fresco per riempire il chip.
- Posizionare il supporto del chip nell'insorgenza rettangolare sulla parte superiore della base del dispositivo di carico. Alimentare il tubo attraverso le fessure situate sul coperchio del dispositivo di carico e fissare il coperchio alla base con quattro viti di testa padella e dadi esadecimali.
NOTA: Per garantire che il coperchio rimanga livellato, prima fissare due viti che si trovano in diagonale l'una dall'altra prima di fissare le due viti rimanenti. - Applicare il carico alle celle ruotando il quadrante in senso orario fino a raggiungere lo spostamento del piatto desiderato.
NOTA: Il dispositivo è progettato in modo che una rotazione del quadrante equivalga a uno spostamento piatto di 1 mm. Il campo di deformazione generato sulla parte superiore della membrana PDMS è stato precedentemente modellato in funzione dello spostamento a piastrina mediante l'analisi degli elementi finiti (FEA)13. - Collocare il dispositivo di carico in una scatola vuota di punta di micropipetta P1000. Incubare le cellule con il carico applicato per 15 min.
NOTA: il periodo di caricamento utilizzato in questo caso è un esempio. È possibile utilizzare tempi di caricamento alternativi. - Dopo l'incubazione, rimuovere il carico dalle celle ruotando il quadrante in senso antiorario fino a quando la piastra ritorna alla posizione iniziale originale. Rimuovere il coperchio dal dispositivo e posizionare il supporto del chip nella piastra di coltura deep-well. Incubare le cellule per un periodo di recupero post-carico di 90 min.
NOTA: Anche in questo caso, il periodo di tempo di recupero utilizzato in questo caso funge da esempio. È possibile utilizzare tempi di recupero alternativi. Per studi a lungo termine, nutrire le cellule ogni 72 h. - Utilizzare una siringa da 5 mL per rimuovere il mezzo condizionato dal chip.
NOTA: Questo supporto può essere salvato e conservato a -80 gradi centigradi. - Rimuovere il chip dal supporto del chip e utilizzare una spatola affusolata per rompere il legame tra il coperchio PDMS e lo strato del pozzo.
NOTA: I saggi cellulari possono ora essere eseguiti seguendo qualsiasi protocollo stabilito per una piastra di coltura cellulare.
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Representative Results
La configurazione della pozzetto può essere utilizzata per analizzare l'attività funzionale di osteoblasti e osteoclasti. La formazione ossea tramite osteoblasti e il riorspo tramite osteoclasts richiedono tempi di coltura nell'ordine di diverse settimane a mesi. La formazione ossea da osteoblasti MC3T3-E1 è stata quantificata utilizzando il rosso alizarino e le macchie di von Kossa11,15. Al giorno 49, la superficie media macchiata di rosso alizarinerato era del 10,7% - 2,2% (medio - errori standard della media)11. La superficie media macchiata di von Kossa era del 6,4% - 1,6%11. La figura 4A mostra i risultati tipici della formazione delle culture osteoblasthe al giorno 49 macchiato di rosso alizarin e von Kossa. Il riorsorma osseo da RAW264.7 pre-osteoclasts è stato quantificato utilizzando toluidine colorazione blu 11,15. Al giorno 30 la superficie media macchiata di blu toluidine era 30.4% - 4.5%11. La figura 4B mostra i tipici risultati di riassorbimenti ossei da colture osteoclaste macchiate di blu toluidine al giorno 30. È stata eseguita la microscopia elettronica a scansione per verificare la presenza di pozzi di risurrezione. I risultati tipici sono illustrati nella Figura 4C. Questi risultati dimostrano che le cellule all'interno del dispositivo rimangono vitali e funzionalmente attive per almeno sette settimane.
Un dispositivo di caricamento stampato in 3D è stato progettato e fabbricato per adattarsi alla configurazione del chip deep-well. Insieme, questo sistema può indurre l'osteocite meccanotra allungando le cellule attraverso una distensione statica fuori dal piano. L'incubazione di 48 h del chip descritta al punto 4.9 si è dimostrata un processo critico per mantenere la vitalità cellulare e la tipica morfologia. Figura 5A mostra immagini rappresentative di osteociti MLO-Y4 a 72 h semi in chip con e senza questo periodo di incubazione. Durante gli accacci di caricamento, gli osteociti sono stati esposti a un gradiente di deformazione indotto sulla membrana PDMS su cui sono state semiate le cellule (supplementari Video 1). I ceppi equivalenti generati durante questo processo sono stati modellati con FEA13 ed è stato determinato il deformazione media equivalente prodotto sulla parte superiore della membrana PDMS. La figura 5B mostra la relazione tra deformazione media equivalente e spostamento della piastra per valori compresi tra 1 e 2 mm. Una mappa termica rappresentativa del gradiente di deformazione indotto è illustrata nella Figura 5C. In questo esempio, uno spostamento a piastre di 1,5 mm ha generato un ceppo equivalente medio del 12,29% sulla parte superiore della membrana. Questo modello dimostra anche che i ceppi indotti vicino al centro del pozzo sono relativamente bassi e aumentano gradualmente radialmente verso l'esterno, con i ceppi massimi generati direttamente sopra il bordo esterno della piastra. Dopo il caricamento, la vitalità cellulare è stata analizzata con colorazione diiminata disidratata e l'annessina V e il test delle cellule morte14,16. I risultati tipici sono illustrati rispettivamente nella figura 5D,E.
Figura 1: Dispositivo microfluidico. (A) Fabbricazione e livellamento della maschera di truciolo. (Sinistra) Schemadella maschera di truciolo deep-well progettata internamente utilizzando il software CAD. (Al centro) Immagine della maschera chip deep-well che è stata stampata commercialmente utilizzando la stereolitografia ad alta risoluzione. (A destra) La maschera viene posizionata all'interno di una scatola di livellamento stampata in 3D per garantire che la maschera rimanga livellata durante la fusione del livello 2 dei trucioli. (B) Schizzi schematici dei disegni poco profondi e profondi del dispositivo. (In alto) Il design del pozzo poco profondo è stato utilizzato per analizzare l'attività funzionale (formazione e riassorbimento) di osteoblasti e osteoclasti. Questa configurazione è costituita da due livelli PDMS. Un substrato di attività funzionale è stato fissato al fondo della coltura ben prima di sigillare gli strati insieme. I dischi di polistirolo e i wafer ossei sono stati utilizzati rispettivamente per le colture osteoblaste e osteoclasta. (In basso) Il design del pozzo profondo è stato utilizzato per applicare il carico meccanico agli osteociti. Questa configurazione è costituita da tre livelli PDMS. Il fondo della coltura bene è formato dalla membrana deformabile PDMS (strato 3). (C) Fasi di fabbricazione per il disco di polistirolo utilizzato per le colture osteoblastiche. La parte posteriore di una coltura tissutale trattata coverslip era contrassegnata con nastro adesivo. I singoli dischi sono stati tagliati con un cavascio-borer. Il disco è stato pulito con etanolo e un tampone di cotone. Il nastro di apporto è stato rimosso e disco è stato collegato alla parte inferiore della coltura PDMS bene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Progettazione e assemblaggio del dispositivo di caricamento meccanico. (A) Immagine del dispositivo di caricamento meccanico assemblato. Quando accoppiato con il design del pozzo profondo del chip PDMS, il dispositivo di carico estende le cellule applicando una distensione fuori piano a una membrana deformabile. (B) Vista esplosa del dispositivo. Tutte le parti mostrate in blu sono state stampate in 3D con un filamento di acido polilattico resistente al calore. Tutto l'hardware è in acciaio inox. (C) Meccanismo di jack a vite del dispositivo di caricamento. La rotazione della vite centrale (arancione) spinge la piastra (verde) verso l'alto attraverso la base. Il movimento verso l'alto del platen deforma la membrana PDMS del chip deep-well su cui sono state semiate le cellule. (D) Processo di assemblaggio del dispositivo di caricamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esperimento di caricamento meccanico. Tutti i liquidi sono stati somministrati e rimossi dal chip utilizzando una siringa da 5 mL collegata al tubo di accesso. Una fase critica in questo processo è l'incubazione di 48 h con acqua distillata sterile prima della semina cellulare. Senza questa incubazione le cellule hanno mostrato bassa vitalità e morfologia atipica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati tipici dell'attività funzionale. (A) Risultati tipici della formazione macchiati di alizarin rosso (a sinistra) e von Kossa (a destra) dalle culture osteoblastiche MC3T3-E1 indotte al giorno 49. Le immagini a disco intero misurano 5,4 mm di diametro. (B) Risultati tipici degli osteoclasti da preosteoclasts RAW264.7 indotti con recettore del ligando kappa-B del fattore nucleare (RANKL). Le cellule venivano coltivate su wafer ossei e macchiate di blu toluidine al giorno 30. (C) Tipiche immagini di microscopia elettronica a scansione che verificano la presenza di pozzi di risurrezione su wafer ossei. La barra in scala nell'immagine superiore rappresenta 200 m e la barra della scala nell'immagine in basso rappresenta 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Effetti della deformazione indotta meccanicamente sugli osteociti. (A) Immagini di osteociti MLO-Y4 a 72 h nel chip del pozzo profondo fabbricato con (sinistra) e senza (a destra) un'incubazione di 48 h con acqua distillata prima della semina cellulare. (B) L'analisi degli elementi finiti è stata utilizzata per modellare la deformazione equivalente media generata sulla parte superiore della membrana PDMS deformabile in base allo spostamento della piastra del dispositivo di caricamento. Vengono visualizzati i risultati degli spostamenti compresi tra 1,0 e 2,0 mm. (C) Mappa di calore del gradiente di deformazione modellato indotto sulla membrana PDMS per uno spostamento piatto di 1,5 mm. (D) Risultati tipici di una staccia di deatolato di osteociti indotta da farmaci che sono stati allungati utilizzando uno spostamento della piastra di 1,5 mm. Una colorazione cellulare più leggera è osservata vicino al bordo esterno del pozzo, che corrisponde alla posizione di valori di deformazione più alti indicativi di danno cellulare e/o morte. (E) Risultati rappresentativi della citometria del flusso dell'apoptosi indotta dal carico indicati da un'annessina V e da un test di cella morta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare Figura 1: scatola di livellamento stampata in 3D con parete staccabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: file CAD della casella di livellamento 1. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
File supplementare 2: file CAD della casella di livellamento 2. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
File supplementare 3: file CAD della casella di livellamento 3. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
File supplementare 4: elenco hardware della casella di livellamento. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Video supplementare 1: Dispositivo di caricamento meccanico. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Questo articolo descrive le basi per la fabbricazione di una piattaforma LOC di rimodellamento osseo per il culturismo di osteociti, osteoclasti e osteoblasti. Modificando la profondità e le dimensioni del pozzo all'interno del chip, sono state sviluppate configurazioni multiple per stimolare gli osteociti con carico meccanico e quantificare i risultati funzionali del rimodellamento osseo (Figura 1B).
Durante l'assemblaggio del chip, l'ottimizzazione del protocollo di ossidazione del plasma è stata fondamentale per eliminare i problemi di perdita. Abbiamo scoperto che esporre superfici PDMS a 30 s di plasma di ossigeno generato utilizzando un'impostazione di potenza RF media (passaggio 4.1), pari a circa 10,2 W, era sufficiente per creare un forte legame tra gli strati. L'integrità del legame è diminuita quando sono stati utilizzati tempi di esposizione più lunghi o un'impostazione di potenza RF più elevata. Ciò è coerente con i rapporti precedenti che hanno rilevato una sovraesposizione della PDMS al plasma di ossigeno ha aumentato la rugosità della superficie e ridotto l'adesivo17,18.
Inoltre, mantenere un'elevata vitalità cellulare e la tipica morfologia cellulare dipendeva in modo critico dal processo di cura del PDMS. Il polimero PDMS è costituito da oligomeri dimeilsiloxane collegati incrociati. Questo processo di intercollegamento dipende sia dal tempo che dalla temperatura; tuttavia, anche con una polimerizzazione estesa il polimero non riesce a polimerizzare completamente19. Gli oligomeri rimanenti hanno dimostrato di lisciviare dal polimero di massa nel mezzo di coltura cellulare circostante e sono stati trovati anche nelle membrane delle cellule coltivate sulla superficie polimerica20. Diversi gruppi hanno segnalato effetti citotossici da oligomeri PDMS non incrociati21,22,23. Per affrontare questo problema nel nostro sistema, abbiamo ottimizzato il processo di polimerazione PDMS. Anche se la velocità di polimerità per il PDMS dipende dalla temperatura, le proprietà del materiale delle nostre maschere di trucioli hanno limitato la nostra temperatura di stagionatura a 45 gradi centigradi. Come tale, abbiamo determinato che i chip dovrebbero essere cotti per un minimo di 18 h. Inoltre, abbiamo scoperto che l'incubazione di trucioli con dH2O per almeno 48 h prima della semina cellulare (passaggio 4.9) era necessaria per ridurre gli effetti citotossici. Figura 5A Mostra osteociti MLO-Y4 coltivati in chip con e senza questo periodo di incubazione.
La configurazione del pozzo profondo, progettata per ospitare l'applicazione del carico meccanico, richiede che il chip sia fabbricato da tre strati separati. A differenza della configurazione pommutata, la fabbricazione di porzioni di pozzo e membrana come un singolo pezzo per la configurazione del pozzo profondo ha causato la deformazione della membrana. Ciò può essere dovuto a una differenza nei tassi di stagionatura tra le porzioni spesse e sottili del chip. Per superare questo problema, lo strato di membrana è stato costruito separatamente e legato al fondo del chip dopo il processo di stagionatura. Per generare uno strato di membrana separato con spessore uniforme, è fondamentale che la casella di livellamento sia completamente livellata prima di aggiungere il PDMS (passaggio 1.4). Come tale, l'uso di un goniometro digitale è raccomandato per garantire un alto grado di precisione. Inoltre, durante la fase 2.3.2, è fondamentale rimuovere il maggior numero possibile di PDMS dalla tazza di plastica. Le incoerenze in questa fase porteranno a deviazioni elevate negli spessori della membrana e, in ultima analisi, a deviazioni elevate nel ceppo medio di substrato utilizzato per indurre l'osteocite mechanotransduzione.
La nostra piattaforma di rimodellamento osseo offre un alto grado di versatilità. Questo sistema può essere utilizzato per studiare una varietà di fattori che regolano il rimodellamento osseo, come la meccanotrazione indotta dal carico, la segnalazione multicellulare, l'infiammazione o gli effetti farmacologici. Ad esempio, il sistema è stato utilizzato per analizzare gli effetti combinati del carico meccanico e dell'infiammazione sul rimodellamento osseo in un ambiente indotto dal farmaco14. Il carico meccanico è stato applicato agli osteociti trattati con bisfosfonato. L'analisi proteica del mezzo condizionato ha rivelato un aumento significativo dei livelli di leptina e osteonectina e una diminuzione significativa dei livelli di CCL21 e CD36 rispetto agli osteociti che non sono stati caricati meccanicamente14.
I protocolli qui presentati forniscono una base per la coltura di ogni tipo di cellula all'interno del LOC, nonché metodi per indurre il carico meccanico e quantificare l'attività funzionale. Andando avanti, stiamo lavorando per un vero organo osseo su un chip. Inoltre, crediamo che l'utilizzo del nostro sistema per sviluppare sistemi di modellazione matematica potrebbe migliorare notevolmente la nostra comprensione dei complessi processi di segnalazione multicellulare che regolano il rimodellamento osseo24,25.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation sotto Grant Nos. (CBET 1060990 e EBMS 1700299). Inoltre, questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program sotto Grant No. Eventuali opinioni, conclusioni, conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
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