Summary
Hier presenteren we protocollen voor het analyseren van botremodellering binnen een lab-on-a-chip platform. Een 3D-geprint mechanisch laadapparaat kan worden gekoppeld aan het platform om osteocyte mechanostransductie te induceren door de cellulaire matrix te vervormen. Het platform kan ook worden gebruikt om botremodellering functionele resultaten van osteoclasten en osteoblasten (resorptie / vorming) te kwantificeren.
Abstract
Bot remodelleren is een strak gereguleerd proces dat nodig is voor skeletgroei en reparatie, alsmede aan te passen aan veranderingen in de mechanische omgeving. Tijdens dit proces regelen mechanogevoelige osteocyten de tegengestelde reacties tussen de katabole osteoclasten en anabole osteoblasten. Om beter te begrijpen van de zeer ingewikkelde signaleringstrajecten die dit proces reguleren, heeft ons lab een fundamenteel lab-on-a-chip (LOC) platform ontwikkeld voor het analyseren van functionele uitkomsten (vorming en resorptie) van botremodelleren binnen een kleinschalig systeem. Aangezien botremodellering een langdurig proces is dat plaatsvindt in de orde van weken tot maanden, ontwikkelden we langetermijncelkweekprotocollen binnen het systeem. Osteoblasten en osteoclasten werden gekweekt op functionele activiteitsubstraten binnen de LOC en gedurende maximaal zeven weken onderhouden. Daarna werden chips gedemonteerd om de kwantificering van botvorming en resorptie mogelijk te maken. Daarnaast hebben we een 3D-geprint mechanisch laadapparaat ontworpen dat paren met het LOC-platform en kan worden gebruikt om osteocyte mechanotransductie te induceren door de cellulaire matrix te vervormen. We hebben celkweekprotocollen voor osteocyten, osteoblasten en osteoclasten binnen het LOC-platform geoptimaliseerd en hebben zorgen over steriliteit en cytotoxiciteit aangepakt. Hier presenteren we de protocollen voor het fabriceren en steriliseren van de LOC, het zaaien van cellen op functionele substraten, het opwekken van mechanische belasting en het demonteren van de LOC om eindpuntresultaten te kwantificeren. Wij geloven dat deze technieken de basis leggen voor het ontwikkelen van een echte orgaan-op-een-chip voor botremodellering.
Introduction
Bot is een zeer dynamisch weefsel dat ingewikkelde coördinatie tussen de drie belangrijkste celtypes vereist: osteocyten, osteoblasten en osteoclasten. Meercellige interacties tussen deze cellen zijn verantwoordelijk voor het botverlies dat optreedt tijdens verlamming en langdurige immobiliteit en voor de botvorming die optreedt in reactie op groei en lichaamsbeweging. Osteocyten, de meest voorkomende botcel type, zijn zeer gevoelig voor mechanische stimuli toegepast op het bot. Mechanische stimulatie verandert osteocyte metabolische activiteit en leidt tot een toename van de belangrijkste signaalmoleculen1,2. Door dit proces, bekend als mechanotransductie, kunnen osteocyten de activiteiten van osteoblasten (botvormende cellen) en osteoclasten (botresortencellen) direct coördineren. Het handhaven van bothomeostase vereist een strakke regeling tussen botvorming en botresorptiepercentages; echter, verstoringen in dit proces kan leiden tot ziekte toestanden zoals osteoporose of osteopetrorose.
De complexiteit van de interacties tussen deze drie celtypen leent zich goed voor onderzoek met behulp van microfluidic en lab-on-a-chip (LOC) technologieën. Daartoe heeft ons lab onlangs een proof of concept van een LOC-platform opgezet voor het analyseren van botresorptie en vorming (functionele uitkomsten) in het botremodelleringsproces. Het platform kan worden gebruikt voor de studie van cellulaire interacties, veranderde laadomgevingen en onderzoekende drugsscreening. In de afgelopen jaren zijn verschillende microfluïdische apparaten ontwikkeld voor het onderzoeken van de moleculaire signaleringstrajecten die het remodelleren van botten reguleren; Veel van deze systemen kwantificeren echter de herinrichting door middel van indirecte merkers die wijzen op functionele activiteit3,4,5,6,7. Een voordeel van ons systeem is dat het kan worden gebruikt voor directe kwantificering van functionele resultaten. Bot remodelleren is een proces op lange termijn. Als zodanig vereist directe kwantificering van botresorptie en vorming een kweeksysteem dat gedurende ten minste enkele weken tot maanden8,9,10,11kan worden gehandhaafd . Zo hebben we bij de ontwikkeling van het LOC-platform langdurige kweekprotocollen opgesteld die nodig zijn voor vorming en resorptie en hebben we cellen in het systeem tot zeven weken11onderhouden. Daarnaast hebben we geschikte kweeksubstraten voor beide celtypen in het platform verwerkt; osteoclasten werden gekweekt direct op het bot, en osteoblasten, waarvan bekend is dat plastic aanhanger, werden gekweekt op polystyreen schijven. Verder hebben we kwesties met betrekking tot steriliteit, cytotoxiciteit op lange termijn en spaan van de chip voor remodelleren analyse11,12.
Het LOC-platform kan ook worden gebruikt om osteocyte mechanotransductie te induceren door matrixvervorming. Een 3D-geprint mechanisch laadapparaat werd ontwikkeld om te koppelen met de LOC en een statische uit vliegtuigdistentie toe te passen om de cellen13uit te rekken. Om deze mechanische belasting aan te kunnen, werd de diepte van de put binnen de LOC vergroot. Deze kleine schaal, eenvoudige mechanische laadinrichting kan gemakkelijk worden geproduceerd door laboratoria met beperkte technische ervaring, en we hebben eerder gedeeld tekeningen van de 3D-geprinte componenten13. In het huidige werk demonstreren we enkele van de nieuwe technieken die nodig zijn voor het succesvol gebruik van de LOC. Concreet demonstreren we chipfabricage, celzaaien op functionele substraten, mechanische belasting en spaanvan de chip voor het verbouwen van kwantificering. Wij geloven dat de uitleg van deze technieken profiteren van een visueel formaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van het chipmasker
LET OP: Stappen 1.1 - 1.3 hoeven slechts eenmaal te worden uitgevoerd bij de eerste ontvangst van het chipmasker. Ze zorgen ervoor dat het masker niet buigt tijdens het gebruik. Het ontwerp van de microfluïdische maskers werd eerder beschreven11,14. Maskers werden ontworpen in-house en commercieel vervaardigd met behulp van hoge resolutie stereolithografie (Figuur 1A).
- Bedek het bovenoppervlak van het masker met plastic bekleding om dit oppervlak te beschermen tegen lijm. Zet het chipmasker vast op een acrylvel van even grote grootte met behulp van spuitlijm. Klem de stukken 's nachts aan elkaar zodat de lijm volledig kan genezen. Nadat de lijm droog is, verwijdert u de plastic bekleding van de bovenkant van het masker.
- Bevestig de onderkant van de acrylplaat aan een 3D-geprinte nivelleringsdoos(Aanvullende figuur 1, Aanvullende Bestanden 1-4)met behulp van dubbelzijdige tape. Druk stevig om een strakke band te garanderen.
- Sluit eventuele kleine openingen in de buurt van de afneembare wand van de nivelleringdoos af met een waterdichte kit. Laat de kit 24 uur lang uitharden.
- Reinig het oppervlak van het masker met 70% ethanol (EtOH). Plaats de nivelleringdoos met het gewenste spaanmasker in de oven. Gebruik een digitale protractor om ervoor te zorgen dat de bovenkant van het masker vlak is. Pas indien nodig de nivelleringsschroeven aan.
2. PDMS fabricage
OPMERKING: Een ondiep-goed (1 mm) chip ontwerp wordt gebruikt voor functionele activiteit (vorming en resorptie) testen, en een diep-put (10 mm) chip ontwerp wordt gebruikt voor mechanische belasting studies. De bodem van de diepe put wordt gevormd door het bevestigen van een apart dun PDMS membraan(figuur 1B).
- Deksellaag (Laag 1)
- Combineer 63 g PDMS prepolymeer en 6,3 g uithardingsmiddel (10:1 verhouding) in een plastic beker. Meng grondig met een wegwerpcelspatel en ontgas in een vacuümdroogdroogcan gedurende 30 min.
- Giet langzaam mengsel in de voorbereide nivellering doos. Laat de PDMS 30 min zitten en bak dan 18 uur bij 45 °C.
- Maak de randen van de PDMS los met een taps toelopende laboratoriumspatel en verwijder de polymeerplaat uit de nivelleringsdoos.
- Snijd afzonderlijke deksels op maat (70 mm x 34 mm) met behulp van een scalpel en een 3D-geprinte sjabloon.
- Punch toegangsgaten door elk deksel met een biopsie punch (1 mm diameter).
- Maak de deksels schoon met verpakkingstape.
LET OP: Als de deksels niet onmiddellijk worden gebruikt, wikkel ze dan elk in verpakkingstape en sla ze op bij kamertemperatuur (RT).
- Put- en microkanaallaag (Laag 2)
- Combineer het PDMS prepolymeer en uithardingsmiddel (10:1 verhouding) in een plastic beker. Het ondiepe ontwerp vereist 43 g prepolymeer en 4,3 g uithardingsmiddel, en het diep-put ontwerp vereist 227 g prepolymeer en 22,7 g uithardingsmiddel. Meng het polymeer krachtig en ontgas gedurende 30 min.
OPMERKING: Hierbij wordt uitgegaan van een maskermeting van 152,4 mm x 152,4 mm. - Giet langzaam mengsel over de juiste pre-genivelleerd masker. Laat de PDMS 30 min zitten en bak dan 18 uur bij 45 °C.
- Maak de randen van de PDMS los met een taps toelopende laboratoriumspatel en pel het polymeer voorzichtig van het masker af. Gebruik een scalpel en 3D-geprinte sjabloon om afzonderlijke chips uit te snijden.
OPMERKING: Voor laadstudies is het belangrijk dat de spaanafmetingen (70 x 34 mm) nauwkeurig zijn en dat de put zich in het midden van de chip bevindt. - Oppervlak reinig de PDMS met verpakkingstape.
OPMERKING: Als de chips niet onmiddellijk worden gebruikt, wikkel elke chip in verpakkingstape en bewaar bij RT.
- Combineer het PDMS prepolymeer en uithardingsmiddel (10:1 verhouding) in een plastic beker. Het ondiepe ontwerp vereist 43 g prepolymeer en 4,3 g uithardingsmiddel, en het diep-put ontwerp vereist 227 g prepolymeer en 22,7 g uithardingsmiddel. Meng het polymeer krachtig en ontgas gedurende 30 min.
- Dun PDMS-membraan (laag 3)
LET OP: Deze laag wordt alleen gebruikt voor het diep-goed ontwerp.- Voeg 12,7 g PDMS prepolymeer en 1,3 g uithardingsmiddel (10:1 verhouding) toe aan een plastic beker. Meng krachtig en ontgas gedurende 30 min.
- Giet polymeer langzaam in de geprepareerde nivelleringdoos en schraap de plastic beker grondig om zoveel mogelijk PDMS te verwijderen.
- Gebruik celspatel om PDMS over het hele oppervlak te verspreiden.
OPMERKING: Als het polymeer niet handmatig wordt verspreid, is de oppervlaktespanning voldoende om te voorkomen dat het polymeer een uniform blad vormt. - Laat de PDMS 30 min zitten en bak dan 18 uur bij 45 °C.
- Maak de randen van de PDMS los met een taps toelopende spatel en verwijder het PDMS-vel voorzichtig uit de nivelleringsdoos. Snijd individuele membranen die overeenkomen met de afmetingen van laag 2.
- Meet de membraandikte in het midden van het membraan met remklauwen. Verwijder membranen die zich buiten de gewenste dikte bevinden (0,5 mm ± 0,1 mm).
- Zorgvuldig reinigen membranen met verpakkingstape en plaats op een stuk paraffine film.
LET OP: Als de membranen niet onmiddellijk worden gebruikt, bedek dan de bovenkant van het membraan met verpakkingstape en bewaar bij RT.
3. Functionele activiteitssubstraten
OPMERKING: Polystyreen schijven en bot wafels moeten worden bevestigd aan de bodem van putten die zullen worden gebruikt voor osteoblast en osteoclast culturen, respectievelijk.
- Polystyreenschijven (figuur 1C)
- Plaats plakband op de achterkant van een weefselcultuur behandeld polystyreen coverslip. Snijd cirkelvormige schijven uit het uitglijder met behulp van een geslepen kurkboor (5,4 mm diameter). Dompel de schijven in 70% EtOH en laat 's nachts.
- Schrob voorzichtig het bovenoppervlak van de schijf met een katoenen tater applicator gedrenkt in 70% EtOH. Zorg ervoor dat de buitenrand van de schijf grondig wordt gereinigd.
- Met behulp van twee paar tangen, houd de schijf en verwijder de plakband backing. Plaats de schijf behandeld kant naar beneden en reinig de achterkant met een katoenen tip applicator.
- Dompel het houten uiteinde van een katoenpunt applicator in een ontgast mengsel van ongezouten PDMS en plaats een kleine hoeveelheid van het polymeer op de bodem van de gewenste put.
LET OP: Ongezouten PDMS kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. - Plaats de polystyreenschijf, behandeld zijwaarts, in de put en druk voorzichtig met een wattenstaafje op de schijf. Zorg ervoor dat er geen niet-uitgeharde PDMS in contact komt met de behandelde kant van de schijf.
OPMERKING: Als PDMS in contact komt met het behandelde oppervlak van de schijf, verwijdert u de schijf uit de put en herhaalt u de stappen 3.1.4 en 3.1.5 met een nieuwe schijf. - Laat de chip 30 min op een vlakke ondergrond zitten en bak vervolgens 4 uur lang bij 65 °C.
- Botwafels
- Gebruik tangen om een botwafer (6 mm diameter, 0,4 mm dik) op de bodem van een schaal van 100 mm te plaatsen. Houd de wafer stabiel met de tangen en zachtjes ets en een 'X' op de achterkant van de wafer met een scalpel.
OPMERKING: Tijdens het beeldvormingsproces wordt de 'X' gebruikt om onderscheid te maken tussen de achterkant van de wafer en het oppervlak waarop cellen zijn gezaaid. - Gebruik het houten uiteinde van een katoenen applicator om een kleine hoeveelheid ongezouten PDMS toe te voegen aan de bodem van de gewenste put. Plaats de botwafer, gemarkeerd e-kant naar beneden, in de put en gebruik een katoenen applicator om de wafer naar beneden te drukken.
- Laat de chip 30 min op een vlakke ondergrond zitten en bak vervolgens 4 uur lang bij 65 °C.
- Gebruik tangen om een botwafer (6 mm diameter, 0,4 mm dik) op de bodem van een schaal van 100 mm te plaatsen. Houd de wafer stabiel met de tangen en zachtjes ets en een 'X' op de achterkant van de wafer met een scalpel.
4. Spaanmontage en sterilisatie
- Activeer de oppervlakken van laag 1 en laag 2 met een plasmareiniger voor 30 s met behulp van een gemiddelde radiofrequentie (RF) energie-instelling (gelijk aan ongeveer 10,2 W).
- Lijn de toegangsgaten in laag 1 uit met de microkanalen in laag 2 en druk de twee lagen stevig tegen elkaar.
- Herhaal stap 4.1 met laag 2 en laag 3 voor het diep-put ontwerp stap 4.1. Gebruik tijdens de plasmabehandeling dubbelzijdige tape om de paraffinefilm van laag 3 aan een vlak oppervlak te bevestigen.
- Gebruik een scalpel om overtollig materiaal uit het PDMS-membraan af te snijden. Pel het vel paraffinefolie voorzichtig weg van de onderkant van de chip
- Bak de chip op 65 °C gedurende 10 min om de hechtingssterkte tussen de PDMS-lagen te verhogen.
- Plaats schuine doseertips (18 meter, 0,5 in, 90°) in de toegangsgaten in het deksel. Zet de doseertips vast aan het deksel met een epoxy van twee delen. Gebruik een micropipettip om de epoxy rond elke doseertip aan te brengen.
- Nadat de epoxy volledig is uitgehard, oppervlak schoon de chip met 70% EtOH en plaats in een biosafety kast. Voer alle volgende stappen uit binnen de bioveiligheidskast.
- Sluit een 5 mL spuit aan op de doseertips met steriele siliconen buizen (1/32'' ID, ~10 cm lang) en vul de gehele chip met 70% EtOH voor ten minste 30 s. Voor het ondiepe-goed ontwerp, beheer alle vloeistoffen met een spuitpomp ingesteld op een debiet van 4 mL/ h. Voor het diep-goed ontwerp, dient u alle vloeistoffen toe te dienen door de spuit langzaam met de hand uit te delen.
- Haal de EtOH uit de chip en steriliseer de chip met UV-licht 's nachts.
- Was de chip 3 keer met dH2O. Vul de chip met dH2O, haal de slang uit de doseertips en incubeer gedurende ten minste 48 uur bij 37 °C.
5. Montage van mechanische laadinrichting
OPMERKING: De ontwerp- en fabricageprocessen voor het 3D-geprinte mechanische laadapparaat (figuur 2A-C) zijn eerder beschreven en alle ontwerpbestanden voor gedrukte onderdelen zijn eerder geleverd13.
- Autoclave alle onderdelen van de laadinrichting gedurende 30 min bij 121 °C.
OPMERKING: Om kromtrekken van geprinte onderdelen te voorkomen, wikkelt u elk stuk afzonderlijk in folie en plaatst u tijdens het autoclavingproces op een hard vlak oppervlak. Metalen hardware kan aan elkaar worden gewikkeld. Voltooi alle volgende stappen binnen een bioveiligheidskast. - Plaats een compressieveer rond de as van de platen en plaats de platen in het centrale gat aan de onderkant van de basis (Figuur 2D).
- Bevestig het draaiblok aan de onderkant van de basis met behulp van vier zelftappende schroeven.
- Plaats een tweede compressieveer rond de centrale schroef. Steek de schroef in het zeshoekige gat in de onderkant van de wijzerplaat en schroef de montage in het schroefdraadgat in het midden van het wijzerplaatblok.
- Schroef vier man-vrouw standoffs in de bodem van de basis.
- Verwijder de speling van het apparaat door de wijzerplaat tegen de klok in te draaien totdat de bovenkant van de platen onder de bovenkant van de basis ligt. Draai vervolgens langzaam de wijzerplaat met de klok mee totdat de bovenkant van de platen gelijk is met de bovenkant van de basis.
6. Experimenten
OPMERKING: Protocollen voor experimenten met functionele activiteiten werden eerder verstrekt11,12.
- Loading studies (Figuur 3)
- Gebruik na stap 4.9 een 5 mL spuit om dH2O uit de deep-well chip te verwijderen. Bestrijk de bodem van de put met 200 μL van 0,15 mg/mL type I collageen (CTI) in 0,02 M azijnzuur gedurende 1 uur.
- Spoel de chip drie keer af met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (DPBS++).
- Plaats de chip in de chiphouder en het zaad met MLO-Y4-osteocyten met een dichtheid van 2 x 104 cellen/mL in minimaal essentieel alfamedium (MEMα) aangevuld met 5% kalfsserum, 5% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine.
- Haal de slang uit de doseertips en plaats de chip in een diepe kweekschaal (150 mm x 25 mm). Incubeercellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 72 uur.
- Bevestig steriele buizen aan het geven van tips en gebruik een 5 mL spuit om gebruikte cultuur medium te verwijderen uit de chip. Langzaam afzien in verse cultuur medium om de chip te vullen.
- Plaats de chiphouder in de rechthoekige beginset op de bovenkant van de basis van het laadapparaat. Voer de slang door de sleuven op het deksel van het laadapparaat en zet het deksel op de bodem met vier pankopschroeven en hexmoeren.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat het deksel vlak blijft, moet u eerst twee schroeven bevestigen die diagonaal van elkaar zijn geplaatst voordat u de resterende twee schroeven vastzet. - Breng belasting aan op de cellen door de wijzerplaat met de klok mee te draaien totdat de gewenste platenverplaatsing is bereikt.
LET OP: Het apparaat is zo ontworpen dat één draaiing van de wijzerplaat gelijk staat aan een verplaatsing van 1 mm. Het stamveld dat op de bovenkant van het PDMS-membraan werd gegenereerd, werd eerder gemodelleerd als functie van platenverplaatsing met behulp van eindige elementenanalyse (FEA)13. - Plaats het laadapparaat in een lege P1000 micropipettipbox. Incubeer de cellen met de toegepaste belasting gedurende 15 min.
OPMERKING: De hier gebruikte laadtijd dient als voorbeeld. Er kunnen alternatieve laadtijden worden gebruikt. - Verwijder na incubatie de belasting uit de cellen door de wijzerplaat tegen de klok in te draaien totdat de platen terugkeren naar de oorspronkelijke startpositie. Haal het deksel van het apparaat en plaats de chiphouder in de diepwaterende kweekplaat. Incubeer de cellen voor een herstelperiode van 90 min na het laden.
OPMERKING: Nogmaals, de hier gebruikte herstelperiode dient als voorbeeld. Er kunnen alternatieve hersteltijden worden gebruikt. Voor lange termijn studies, voercellen om de 72 uur. - Gebruik een 5 mL spuit om het geconditioneerde medium uit de chip te verwijderen.
LET OP: Dit medium kan worden opgeslagen en opgeslagen bij -80 °C. - Verwijder de chip van de chiphouder en gebruik een taps toelopende spatel om de binding tussen het PDMS-deksel en de putlaag te verbreken.
OPMERKING: Cellulaire tests kunnen nu worden uitgevoerd volgens elk protocol dat is ingesteld voor een celkweekplaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ondiepe-goed configuratie kan worden gebruikt voor het analyseren van functionele activiteit van osteoblasten en osteoclasten. Botvorming via osteoblasten en resorptie via osteoclasten vereist kweektijden in de orde van enkele weken tot maanden. Botvorming van MC3T3-E1 pre-osteoblasten werd gekwantificeerd met alizarine rood en von Kossa vlekken11,15. Op dag 49 was de gemiddelde oppervlakte gekleurd met alizarin rood 10,7% ± 2,2% (gemiddelde ± standaardfouten van het gemiddelde)11. De gemiddelde oppervlakte bevlekt met von Kossa was 6,4% ± 1,6%11. Figuur 4A toont typische vormingsresultaten van osteoblastculturen op dag 49 gekleurd met alizarin rood en von Kossa. Botresorptie van RAW264.7 pre-osteoclasten werd gekwantificeerd met behulp van toluidine blauwe kleuring 11,15. Op dag 30 was de gemiddelde oppervlakte gekleurd met toluidineblauw 30,4% ± 4,5%11. Figuur 4B toont typische botresorptieresultaten van osteoclastculturen die op dag 30 met toluidineblauw zijn gekleurd. Het scannen van elektronenmicroscopie werd uitgevoerd om de aanwezigheid van resorptieputten te verifiëren. Typische resultaten worden weergegeven in figuur 4C. Deze resultaten tonen aan dat cellen in het apparaat gedurende ten minste zeven weken levensvatbaar en functioneel actief blijven.
Een 3D-geprint laadapparaat is ontworpen en vervaardigd om de deep-well chip configuratie tegemoet te komen. Samen kan dit systeem osteocyte mechanotransductie veroorzaken door de cellen uit te rekken via een statische out-of-plane distentie. De 48 uur incubatie van de chip beschreven in stap 4.9 heeft bewezen een kritisch proces voor het behoud van de levensvatbaarheid van de cel en typische morfologie. Figuur 5A toont representatieve afbeeldingen van MLO-Y4-osteocyten bij 72 h in chips met en zonder deze incubatietijd. Tijdens aanvallen van het laden werden osteocyten blootgesteld aan een stamgradiënt dat werd geïnduceerd op het PDMS-membraan waarop de cellen werden gezaaid(Aanvullende video 1). De equivalente stammen die tijdens dit proces werden gegenereerd, werden gemodelleerd met FEA13 en de gemiddelde equivalente stam die op de bovenkant van het PDMS-membraan werd geproduceerd, werd bepaald. Figuur 5B toont de relatie tussen gemiddelde equivalente stam en platenverplaatsing voor waarden tussen 1 en 2 mm. Een representatieve warmtekaart van de geïnduceerde stamgradiënt wordt weergegeven in figuur 5C. In dit voorbeeld genereerde een platenverplaatsing van 1,5 mm een gemiddelde equivalente stam van 12,29% op de bovenkant van het membraan. Dit model toont ook aan dat de stammen geïnduceerd in de buurt van het centrum van de put zijn relatief laag en geleidelijk toenemen radiaal naar buiten, met maximale stammen gegenereerd direct boven de buitenste rand van de platen. Na het laden werd de levensvatbaarheid van de cel geanalyseerd met lactaatdehydrogenase kleuring en de annexin V en dode celtest14,16. Typische resultaten worden weergegeven in figuur 5D,E,respectievelijk.
Figuur 1: Microfluïdisch apparaat. (A) Fabriceren en nivelleeren van het chipmasker. (Links) Schematisch van het diep-goed chipmasker dat in eigen beheer werd ontworpen met behulp van CAD-software. (Midden) Afbeelding van het diep-goed chipmasker dat commercieel werd afgedrukt met behulp van stereolithografie met hoge resolutie. (Rechts) Het masker wordt geplaatst in een 3D-geprinte nivelleringvak om ervoor te zorgen dat het masker vlak blijft tijdens het gieten van laag 2 van de chips. (B) Schematische schetsen van de ondiepe-goed en diep-goed ontwerpen van het apparaat. (Boven) Het ondiepe-goed ontwerp werd gebruikt voor het analyseren van functionele activiteit (vorming en resorptie) van osteoblasten en osteoclasten. Deze configuratie wordt gevormd uit twee PDMS-lagen. Een functionele activiteit substraat werd bevestigd aan de bodem van de cultuur goed voorafgaand aan het verzegelen van de lagen samen. Polystyreen schijven en bot wafels werden gebruikt voor osteoblast en osteoclast culturen, respectievelijk. (Onder) De diep-put ontwerp werd gebruikt voor het toepassen van mechanische belasting op osteocyten. Deze configuratie bestaat uit drie PDMS-lagen. De onderkant van de cultuur put wordt gevormd door de vervormbare PDMS membraan (laag 3). (C) Fabricagestappen voor de polystyreenschijf die wordt gebruikt voor osteoblastculturen. De achterkant van een weefselkweek behandelde coverslip was gemarkeerd met plakband. Individuele schijven werden uitgesneden met een kurkboor. De schijf werd gereinigd met ethanol en een wattenstaafje. De tape backing werd verwijderd en schijf werd bevestigd aan de onderkant van de PDMS cultuur goed. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Ontwerp en montage van het mechanische laadapparaat. (A) Afbeelding van de geassembleerde mechanische laadinrichting. In combinatie met het diep-goed ontwerp van de PDMS-chip, het laadapparaat strekt cellen door het toepassen van een uit het vlak distentie op een vervormbaar membraan. (B) Geëxplodeerde weergave van het apparaat. Alle in het blauw getoonde onderdelen waren 3D geprint met een hittebestendig polymelkzuurfilament. Alle hardware is roestvrij staal. (C) Schroefaansluiting mechanisme van de laadinrichting. Rotatie van de centrale schroef (oranje) duwt de platen (groen) omhoog door de basis. De opwaartse beweging van de platen vervormt het PDMS membraan van de deep-well chip waarop de cellen zijn gezaaid. dD) assemblageproces van de laadinrichting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Mechanisch laadexperiment. Alle vloeistoffen werden toegediend en verwijderd uit de chip met behulp van een 5 mL spuit aangesloten op de toegang buizen. Een kritieke stap in dit proces is de 48 uur incubatie met steriel gedestilleerd water voorafgaand aan cel zaaien. Zonder deze incubatie vertoonden cellen een lage levensvatbaarheid en atypische morfologie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Typische functionele activiteitsresultaten. (A) Typische vorming resultaten gekleurd met alizarin rood (links) en von Kossa (rechts) van geïnduceerde MC3T3-E1 osteoblast culturen op dag 49. Hele schijfbeelden meten een diameter van 5,4 mm. (B) Typische osteoclastresorptieresultaten van RAW264.7 preosteoclasten geïnduceerd met receptoractivator van nucleaire factor kappa-B ligand (RANKL). De cellen werden gekweekt op beenwafers en bevlekt met toluidineblauw op dag 30. (C) Typische scanning elektronenmicroscopie beelden die de aanwezigheid van resorptieputten op botwafers verifiëren. De schaalbalk in de bovenste afbeelding vertegenwoordigt 200 μm en de schaalbalk in de onderste afbeelding vertegenwoordigt 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Effecten van mechanisch geïnduceerde belasting op osteocyten. (A) Beelden van MLO-Y4 osteocyten op 72 h in de diep-put chip vervaardigd met (links) en zonder (rechts) een 48 uur incubatie met gedestilleerd water voorafgaand aan de cel zaaien. (B) Eindige elementenanalyse werd gebruikt om de gemiddelde equivalente stam te modelleren die op de bovenkant van het vervormbare PDMS-membraan werd gegenereerd op basis van de verplaatsing van de laadinrichtingplaten. De resultaten van verplaatsingen tussen 1,0 mm en 2,0 mm worden weergegeven. (C) Warmtekaart van de gemodelleerde stamgradiënt geïnduceerd op het PDMS-membraan voor een platenverplaatsing van 1,5 mm. (D) Typische resultaten van een lactaatde dehydrogenase vlek van door geneesmiddelen geïnduceerde osteocyten die werden uitgerekt met behulp van een verplaatsing van 1,5 mm platen. Een lichtere celvlekken worden waargenomen in de buurt van de buitenrand van de put, wat overeenkomt met de locatie van hogere stamwaarden die wijzen op celschade en/of de dood. e) Representatieve stroomcytometrieresultaten van door lading veroorzaakte apoptose aangegeven door een bijlage V en dode celtest. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: 3D geprinte nivelleringdoos met afneembare wand. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1: CAD-bestand van het nivelleringsvak 1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend bestand 2: Niveau-CAD-bestand 2. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend bestand 3: Niveau-CAD-bestand 3. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende bestand 4: Leveling box hardware lijst. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende video 1: Mechanisch laadapparaat. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft de fundamenten voor het fabriceren van een bot remodelleren LOC platform voor het kweken van osteocyten, osteoclasten, en osteoblasten. Door de diepte en grootte van de put in de chip te veranderen, werden meerdere configuraties ontwikkeld voor het stimuleren van osteocyten met mechanische belasting en het kwantificeren van functionele resultaten van botremodelleren(figuur 1B).
Tijdens de spaanmontage was het optimaliseren van het plasmaoxidatieprotocol van cruciaal belang voor het elimineren van lekkageproblemen. We ontdekten dat het blootstellen van PDMS-oppervlakken aan 30 s zuurstofplasma gegenereerd met behulp van een medium RF-vermogensinstelling (stap 4.1), gelijk aan ongeveer 10,2 W, voldoende was voor het creëren van een sterke band tussen de lagen. De integriteit van de binding nam af wanneer langere blootstellingstijden of een hogere RF-vermogensinstelling werden gebruikt. Dit komt overeen met eerdere rapporten die een overbelichting van PDMS aan zuurstofplasma merkten verhoogde oppervlakteruwheid en verminderde kleefkracht17,18.
Bovendien was het handhaven van een hoge levensvatbaarheid van de cel en de typische celmorfologie van cruciaal belang voor het PDMS-uithardingsproces. Het PDMS-polymeer bestaat uit kruisgebonden dimethylsiloxaanoligomeren. Dit crosslinkingproces is zowel tijd- als temperatuurafhankelijk; echter, zelfs met uitgebreide uitharding van het polymeer niet volledig polymeriseren19. De resterende oligomeren zijn aangetoond uit te logen uit de bulk polymeer in de omliggende cel cultuur medium en zijn zelfs gevonden in de membranen van cellen geteeld op het polymeer oppervlak20. Verschillende groepen hebben cytotoxische effecten gemeld van niet-onderling verbonden PDMS oligomeren21,22,23. Om deze zorg in ons systeem aan te pakken, hebben we het PDMS-uithardingsproces geoptimaliseerd. Hoewel de uithardingssnelheid voor PDMS temperatuurafhankelijk is, beperkten de materiaaleigenschappen van onze chipmaskers onze uithardingstemperatuur tot 45 °C. Als zodanig hebben we vastgesteld dat de chips moeten worden gebakken voor een minimum van 18 uur. Verder hebben we geconstateerd dat het uitbroeden van chips met dH2O gedurende ten minste 48 uur voorafgaand aan het zaaien van cellen (stap 4.9) noodzakelijk was om cytotoxische effecten te verminderen. Figuur 5A toont MLO-Y4-osteocyten gekweekt in chips met en zonder deze incubatietijd.
De diep-put configuratie, die is ontworpen om mechanische belasting toepassing tegemoet te komen, vereist dat de chip worden vervaardigd uit drie afzonderlijke lagen. In tegenstelling tot de ondiepe-goed configuratie, fabriceren van de put en membraan porties als een enkel stuk voor de diep-goed configuratie veroorzaakt het membraan te kromtrekken. Dit kan te wijten zijn aan een verschil in uithardingspercentages tussen de dikke en dunne delen van de chip. Om dit probleem te overwinnen, werd de membraanlaag afzonderlijk geconstrueerd en na het uithardingsproces aan de onderkant van de chip gebonden. Om een aparte membraanlaag met uniforme dikte te genereren, is het van cruciaal belang dat de nivelleringsdoos volledig vlak is voordat de PDMS worden toegevoegd (stap 1.4). Als zodanig wordt het gebruik van een digitale protractor aanbevolen om een hoge mate van nauwkeurigheid te garanderen. Bovendien is het tijdens stap 2.3.2 van cruciaal belang om zoveel mogelijk PDMS uit de plastic beker te verwijderen. Inconsistenties bij deze stap zullen leiden tot hoge afwijkingen in membraandiktes en uiteindelijk hoge afwijkingen in de gemiddelde substraatstam die wordt gebruikt om osteocyte mechanotransductie te induceren.
Ons botremodellerenplatform biedt een hoge mate van veelzijdigheid. Dit systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid van factoren die het bot remodelleren reguleren, zoals load-geïnduceerde mechanotransductie, meercellige signalering, ontsteking, of drug effecten te onderzoeken. Bijvoorbeeld, het systeem werd gebruikt om de gecombineerde effecten van mechanische belasting en ontsteking op het bot remodelleren in een drug geïnduceerde omgeving14analyseren. Mechanische belasting werd toegepast op bisfosfonaat behandelde osteocyten. Eiwitanalyse van het geconditioneerde medium toonde een significante toename van de niveaus van leptine en osteonectine en een significante daling van de niveaus van CCL21 en CD36 in vergelijking met osteocyten die niet mechanisch geladen waren14.
De hier gepresenteerde protocollen vormen een basis voor het kweken van elk celtype binnen het LOC, evenals methoden voor het opwekken van mechanische belasting en het kwantificeren van functionele activiteit. We werken toe naar een echte botorgaan-op-een-chip. Bovendien zijn wij van mening dat het gebruik van ons systeem om wiskundige modelleringssystemen te ontwikkelen ons begrip van de complexe meercellige signaleringsprocessen die botremodellering reguleren24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation in het kader van Grant Nos. (CBET 1060990 en EBMS 1700299). Ook is dit materiaal gebaseerd op werk ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant No. (2018250692). Alle adviezen, bevindingen, conclusies, of aanbevelingen uitgedrukt in dit materiaal zijn die van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation weerspiegelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
