Summary
Burada, bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kemik remodeling analiz için protokoller sıyoruz. Bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı hücresel matris deforme ederek osteosit mekanostransdüksiyon neden platform ile eşleştirilmiş olabilir. Platform aynı zamanda osteoklastlar ve osteoblastlar (rezorpsiyon / oluşumu) kemik remodeling fonksiyonel sonuçları ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Kemik remodeling iskelet büyüme ve onarım yanı sıra mekanik ortamda değişikliklere adapte için gerekli olan sıkı düzenlenmiş bir süreçtir. Bu süreçte, mekanosensit osteositler katabolik osteoklastlar ve anabolik osteoblastlar arasındaki karşıt tepkileri düzenler. Bu süreci düzenleyen son derece karmaşık sinyal yollarını daha iyi anlamak için, laboratuvarımız küçük ölçekli bir sistem içinde kemik remodeling fonksiyonel sonuçları (oluşumu ve rezorpsiyon) analiz etmek için temel bir laboratuvar-on-a-chip (LOC) platformu geliştirdi. Kemik remodeling hafta lar ay sırasına göre meydana gelen uzun bir süreç olduğundan, sistem içinde uzun vadeli hücre culturing protokolleri geliştirdi. Osteoblastlar ve osteoklastlar LOC içinde fonksiyonel aktivite substratları üzerinde yetiştirilen ve yedi haftakadar muhafaza edildi. Daha sonra, talaşkemik oluşumu ve rezorpsiyon kantitatifikasyon uyracak şekilde söküldü. Ayrıca, loc platformu ile eşleşen ve hücresel matris deforme ederek osteosit mekanotransdüksiyon ikna etmek için kullanılabilir bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı tasarladık. Loc platformu içinde osteositler, osteoblastlar ve osteoklastlar için hücre kültür protokollerini optimize ettik ve sterilite ve sitotoksisite ile ilgili endişeleri ele aldık. Burada, LOC'un üretilmesi ve sterilizasyonu, fonksiyonel yüzeylerde hücrelerin tohumlanması, mekanik yükün indüklenmesi ve uç nokta sonuçlarını ölçmek için LOC'un sökülmesi için protokoller sunuyoruz. Bu tekniklerin kemik remodeling için gerçek bir organ-on-a-chip geliştirmek için zemin yatıyordu inanıyoruz.
Introduction
Kemik üç ana hücre tipleri arasında karmaşık koordinasyon gerektiren son derece dinamik bir dokudur: osteositler, osteoblastlar, ve osteoklastlar. Bu hücreler arasındaki çok hücreli etkileşimler felç ve uzun süreli hareketsizlik sırasında meydana gelen kemik kaybından ve büyüme ve egzersize yanıt olarak oluşan kemik oluşumundan sorumludur. Osteositler, en bol kemik hücre tipi, kemiğe uygulanan mekanik uyaranlara karşı son derece duyarlıdır. Mekanik stimülasyon osteosit metabolik aktivitesini değiştirir ve anahtar sinyal molekülleri bir artışa yol açar1,2. Bu süreç sayesinde, mekanotransdüksiyon olarak bilinen, osteositler doğrudan osteoblastlar (kemik oluşturan hücreler) ve osteoklastlar (kemik rezorbülasyon hücreleri) faaliyetlerini koordine edebilirsiniz. Kemik homeostazBakımı kemik oluşumu ve kemik rezorpsiyon oranları arasında sıkı bir düzenleme gerektirir; ancak, bu süreçte ki aksaklıklar osteoporoz veya osteopetrozis gibi hastalık durumlarına neden olabilir.
Bu üç hücre tipi arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı, mikroakışkan ve laboratuvar-on-a-chip (LOC) teknolojilerini kullanarak araştırmaya iyi katkıda bulunur. Bu amaçla, laboratuvarımız son zamanlarda kemik rezorpsiyon ve oluşumu (fonksiyonel sonuçlar) kemik remodeling sürecinde analiz etmek için bir LOC platformu kavramı kanıtı kurmuştur. Platform hücresel etkileşimlerin, değiştirilmiş yükleme ortamlarının ve araştırma ilaç taraması nın incelenmesi nde kullanılabilir. Son yıllarda, çeşitli mikroakışkan cihazlar kemik remodeling düzenleyen moleküler sinyal yollarını araştırmak için geliştirilmiştir; ancak, bu sistemlerin çoğu fonksiyonel aktivite3,4,,5,,6,7göstergesidir dolaylı belirteçleri ile remodeling ölçmek . Sistemimizin bir avantajı, fonksiyonel sonuçların doğrudan ölçülmesi için kullanılabilmesidir. Kemik remodeling uzun vadeli bir süreçtir. Bu nedenle, kemik rezorpsiyonu ve oluşumunun doğrudan nicelleştirilmesi, en az birkaç hafta8ile 8 ,9,,10,11arasında tutulabilen bir kültür sistemi gerektirir. Böylece LOC platformünü geliştirirken, oluşum ve rezorpsiyon için gerekli uzun vadeli kültür protokolleri oluşturduk ve sistem içinde yedi haftaya kadar hücreleri koruduk11. Ayrıca, her iki hücre tipi için uygun culturing yüzeyleri platforma dahil ettik; osteoklastlar doğrudan kemik üzerine, ve plastik yapışık olduğu bilinen osteoblastlar polistiren diskler üzerinde kültürlendi. Ayrıca, remodeling analizi11,,12için sterilite, uzun vadeli sitotoksisite ve talaş demontaj ile ilgili konuları ele aldı.
LOC platformu da matris deformasyon yoluyla osteosit mechanotransdüksiyon indüklemek için kullanılabilir. 3D baskılı mekanik yükleme cihazı LOC ile eşleştirmek ve hücreleri13germek için düzlem dışında statik bir dağıtım uygulamak için geliştirilmiştir. Bu mekanik yükü karşılamak için LOC içindeki kuyunun derinliği artırıldı. Bu küçük ölçekli, basit mekanik yükleme cihazı kolayca sınırlı mühendislik deneyimi ile laboratuvarlar tarafından üretilebilir, ve biz daha önce 3D baskılı bileşenlerin çizimleri paylaştık13. Mevcut çalışmada, LOC'un başarılı kullanımı için gerekli olan bazı yeni teknikleri gösteriyoruz. Bu tekniklerin açıklanmasının görsel bir formattan yararlandığına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Talaş maskesi hazırlama
NOT: Adım 1.1 - 1.3 yalnızca fiş maskesinin ilk alınmasından sonra bir kez yapılması gerekir. Maskenin kullanım sırasında eğilmemesini sağlarlar. Mikroakışkan maskelerin tasarımı daha önce11,14olarak tanımlanmıştır. Maskeler şirket içinde tasarlanmış ve yüksek çözünürlüklü stereolitografi kullanılarak ticari olarak üretilmiştir (Şekil 1A).
- Bu yüzeyi yapıştırıcıdan korumak için maskenin üst yüzeyini plastik kaplama ile kapatın. Talaş maskesini sprey yapıştırıcı kullanarak eşit büyüklükte akrilik bir levhaya sabitleyin. Yapıştırıcının tamamen iyileşebilmesi için parçaları bir gecede birbirine kenetle. Yapıştırıcı kuruduktan sonra maskenin üstündeki plastik kaplamayı çıkarın.
- Akrilik sayfanın alt kısmını çift taraflı bant kullanarak 3B baskılı seviyelendirme kutusuna(Ek Şekil 1, Ek Dosyalar 1-4)takın. Sıkı bir bağ sağlamak için sıkıca basın.
- Su geçirmez bir sızdırmazlık ile tesviye kutusunun çıkarılabilir duvarına yakın herhangi bir küçük açıklıkları kapatın. 24 saat boyunca dolgu maddesi tedavi edin.
- Maskenin yüzeyini %70 etanol (EtOH) ile temizleyin. Fırına istenilen talaş maskesi ile tesviye kutusunu yerleştirin. Maskenin üst kısmı düz olduğundan emin olmak için dijital protractor kullanın. Gerekirse tesviye vidalarını ayarlayın.
2. PDMS imalatı
NOT: Fonksiyonel aktivite (oluşum ve rezorpsiyon) talaşları için sığ-kuyu (1 mm) talaş tasarımı, mekanik yükleme çalışmaları için ise derin kuyu (10 mm) talaş tasarımı kullanılmıştır. Derin kuyunun alt kısmı ayrı bir ince PDMS membranı takılarak oluşur (Şekil 1B).
- Kapak katmanı (Katman 1)
- 63 g PDMS prepolimerve 6,3 g kür leme maddesini (10:1 oranı) plastik bir kapta birleştirin. 30 dakika boyunca bir vakum desiccator bir tek kullanımlık hücre spatula ve degas ile iyice karıştırın.
- Yavaş yavaş hazırlanan tesviye kutusuna karışımı dökün. PDMS 30 dk oturup sonra 45 °C'de 18 saat pişirin.
- Konik bir laboratuvar spatulası ile PDMS'nin kenarlarını gevşetin ve polimer levhayı tesviye kutusundan çıkarın.
- Neşter ve 3D baskılı şablon kullanarak tek tek kapakları (70 mm x 34 mm) boyuta kesin.
- Biyopsi zımba (1 mm çapında) ile her kapak tan giriş delikleri.
- Yüzey ambalaj bandı ile kapakları temizleyin.
NOT: Kapaklar hemen kullanılıyorsa, her biri ambalaj bandına sınır ve oda sınırında (RT) saklayın.
- Peki ve mikrokanal tabakası (Katman 2)
- PDMS prepolimer ve kür ajanını (10:1 oranı) plastik bir kapta birleştirin. Sığ-iyi tasarım prepolimer 43 g ve kür ajan 4.3 g gerektirir ve derin iyi tasarım prepolimer 227 g ve kür ajan 22.7 g gerektirir. 30 dakika boyunca polimer ve degas şiddetle karıştırın.
NOT: Bu maske boyutu 152.4 mm x 152.4 mm'dir. - Karışımı yavaş yavaş uygun önceden tesviye edilmiş maskenin üzerine dökün. PDMS 30 dk oturup sonra 45 °C'de 18 saat pişirin.
- Konik bir laboratuvar spatulası ile PDMS'nin kenarlarını gevşetin ve polimeri maskeden dikkatlice soyun. Tek tek yongaları kesmek için neşter ve 3B baskılı şablon kullanın.
NOT: Yükleme çalışmaları için talaş boyutlarının (70 x 34 mm) hassas olması ve kuyunun çipin merkezinde bulunması önemlidir. - Yüzey, PDMS'yi ambalaj bandı ile temizleyin.
NOT: Talaşlar hemen kullanılıyorsa, her yongayı ambalaj bandına sınırve RT' de saklayın.
- PDMS prepolimer ve kür ajanını (10:1 oranı) plastik bir kapta birleştirin. Sığ-iyi tasarım prepolimer 43 g ve kür ajan 4.3 g gerektirir ve derin iyi tasarım prepolimer 227 g ve kür ajan 22.7 g gerektirir. 30 dakika boyunca polimer ve degas şiddetle karıştırın.
- İnce PDMS membran (Katman 3)
NOT: Bu katman sadece derin kuyu tasarımı için kullanılır.- Plastik bir bardağa 12,7 g PDMS prepolimer ve 1,3 g kür leme maddesi (10:1 oranı) ekleyin. Mix şiddetle ve degas için 30 dk.
- Yavaş yavaş hazırlanan tesviye kutusuna polimer dökün ve iyice mümkün olduğunca çok PDMS kaldırmak için plastik bardak kazıyın.
- PDMS'yi tüm yüzeye yaymak için hücre spatulasını kullanın.
NOT: Polimer el ile yayılmazise, yüzey gerilimi polimerin tek tip bir levha oluşturmasını önlemek için yeterli olacaktır. - PDMS 30 dk oturup sonra 45 °C'de 18 saat pişirin.
- KOnik bir spatula ile PDMS'nin kenarlarını gevşetin ve PDMS sayfasını tesviye kutusundan dikkatlice çıkarın. Katman 2'nin boyutlarıyla eşleşen tek tek membranları kesin.
- Zarın ortasındaki zar kalınlığını kaliperler kullanarak ölçün. İstenilen kalınlıkta (0,5 mm ± 0,1 mm) olmayan membranları atın.
- Ambalaj bandı ile membranları dikkatlice temizleyin ve bir parça parafin filminin üzerine yerleştirin.
NOT: Membranlar hemen kullanılıyorsa, membranın üssünü ambalaj bandı ile kaplayın ve RT' de saklayın.
3. Fonksiyonel faaliyet alt tabakaları
NOT: Polistiren diskler ve kemik gofretleri osteoblast ve osteoklast kültürleri için kullanılacak kuyuların altına sırasıyla eklenmelidir.
- Polistiren diskler (Şekil 1C)
- Bir doku kültürü polistiren coverslip tedavi arka tarafında maskeleme bandı yerleştirin. Bir keskinleştirilmiş mantar-borer (5,4 mm çapında) kullanarak kapaktan dairesel diskler kesin. Diskleri %70 EtOH'a batırın ve bir gece bırakın.
- Diskin üst yüzeyini %70 EtOH'a batırılmış pamuk uçlu bir aplikatörle hafifçe fırçalayın. Diskin dış kenarının iyice temizlenmiş olduğundan emin olun.
- İki çift forceps kullanarak diski tutun ve maskeleme bandı desteğini çıkarın. Diski aşağı doğru yerleştirin ve arka tarafı pamuk uçlu aplikatörle temizleyin.
- Pamuk uçlu aplikatörün tahta ucunu, gazdan arındırılmış PDMS karışımına batırın ve polimerin küçük bir kısmını istenilen kuyunun dibine yerleştirin.
NOT: Kalan özlü PDMS -20 °C'de saklanabilir. - Polistiren diski, işlenmiş tarafı yukarı, kuyuya yerleştirin ve pamuklu bir bezle diske hafifçe bastırın. Diskin tedavi edilen tarafıyla hiçbir uyarılmamış PDMS'nin temas halinde olmadığından emin olun.
NOT: PDMS diskin işlenmiş yüzeyiyle temas ederse, diski kuyudan çıkarın ve yeni bir diskle 3.1.4 ve 3.1.5 adımlarını tekrarlayın. - Talaş 30 dk düz bir yüzeye oturun ve sonra 65 °C'de 4 saat pişirin.
- Kemik gofretleri
- 100 mm'lik bir kabın altına kemik gofret (6 mm çapında, 0,4 mm kalınlığında) yerleştirmek için forceps kullanın. Forceps ile sabit gofret tutun ve nazikçe bir neşter ile gofret arkasına bir 'X' gravür.
NOT: Görüntüleme işlemi sırasında ,'X' gofretin arka sını ve hücrelerin tohumlandığı yüzeyi ayırt etmek için kullanılır. - İstenilen kuyunun dibine az miktarda iyimeli PDMS eklemek için pamuk uçlu aplikatörün tahta ucunu kullanın. Kemik gofret yerleştirin, yan aşağı işaretlenmiş, kuyuya ve aşağı gofret basın için bir pamuk uçlu aplikatör kullanın.
- Talaş 30 dk düz bir yüzeye oturun ve sonra 65 °C'de 4 saat pişirin.
- 100 mm'lik bir kabın altına kemik gofret (6 mm çapında, 0,4 mm kalınlığında) yerleştirmek için forceps kullanın. Forceps ile sabit gofret tutun ve nazikçe bir neşter ile gofret arkasına bir 'X' gravür.
4. Talaş montajı ve sterilizasyonu
- Orta radyo frekansı (RF) güç ayarı (yaklaşık 10,2 W'a eşdeğer) kullanarak 30 s'lik bir plazma temizleyicisi ile katman 1 ve katman 2 yüzeylerini etkinleştirin.
- Katman 1'deki erişim deliklerini katman 2'deki mikro kanallarla hizalayın ve iki katmanı sıkıca birbirine bastırın.
- Derin kuyu tasarımı için, katman 2 ve katman 3 ile adım 4.1'i tekrarlayın. Plazma tedavisi sırasında, katman 3'ün parafin filmini düz bir yüzeye takmak için çift taraflı bant kullanın.
- PDMS membranından fazla malzeme kesmek için bir neşter kullanın. Parafin filminin sayfasını fişin altından dikkatlice soyun.
- PDMS katmanları arasındaki bağı artırmak için çipi 65 °C'de 10 dk pişirin.
- Kapaktaki erişim deliklerine açılı dağıtım ipuçları (18 Gauge, 0,5 in, 90°) yerleştirin. İki parça epoksi ile kapağın dağıtım ipuçlarını sabitlayın. Her dağıtım ucu etrafında epoksi uygulamak için bir mikropipet ucu kullanın.
- Epoksi tamamen iyileştikten sonra, yüzey çipi %70 EtOH ile temizleyin ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Biyogüvenlik kabini içinde sonraki tüm adımları gerçekleştirin.
- Steril silikon boru (1/32'' ID, ~10 cm uzunluğunda) ile dağıtım uçlarına 5 mL şırınga bağlayın ve tüm çipi en az 30 s için %70 EtOH ile doldurun. Sığ-iyi tasarım için, 4 mL /h akış hızına ayarlanmış bir şırınga pompası ile tüm sıvıları uygulayın. Derin kuyu tasarımı için, şırıngayı yavaşça elle dağıtarak tüm sıvıları uygulayın.
- EtOH'u çipten çıkarın ve çipi uv ışığıyla bir gecede sterilize edin.
- Talaşı 3 kez dH2O ile yıkayın.2
5. Mekanik yükleme cihazı montajı
NOT: 3D baskılı mekanik yükleme cihazının(Şekil 2A-C)tasarım ve üretim süreçleri daha önce tanımlanmış ve yazdırılan bileşenlere ait tüm tasarım dosyaları daha önce13olarak sağlanmıştır.
- Yükleme cihazının tüm bileşenlerini 121 °C'de 30 dk otoklavlayın.
NOT: Yazdırılan bileşenlerin bükülmesini önlemek için, her parçayı ayrı ayrı folyoya sarın ve otoklavlama işlemi sırasında sert düz bir yüzeye yerleştirin. Metal donanım birlikte sarılmış olabilir. Biyogüvenlik kabini içinde sonraki tüm adımları tamamlayın. - Plakanın şaftına bir sıkıştırma yayı yerleştirin ve plakayı tabanın altındaki merkezi deliğe yerleştirin(Şekil 2D).
- Dört kendinden dokunan vida kullanarak kadran bloğunu tabanın altına takın.
- Merkezi vidanın etrafına ikinci bir sıkıştırma yay yerleştirin. Vidayı kadranaltındaki altıgen şekilli deliğe yerleştirin ve tertibatı kadran bloğunun ortasındaki dişli deliğe vidalayın.
- Üssün dibine dört erkek-kadın soğukluğu vidalayın.
- Plakanın üst kısmı tabanın üst kısmı altına girene kadar kadranı saat yönünün tersine çevirerek cihazdaki bolluğu kaldırın. Daha sonra plakanın üst kısmı tabanın üst kısmıyla aynı seviyeye gelene kadar kadranı saat yönünde yavaşça çevirin.
6. Deney
NOT: Fonksiyonel etkinlik deneyleri için protokoller daha önce11,12sağlanmıştır.
- Yükleme çalışmaları (Şekil 3)
- 4.9. adımdan sonra, derin kuyu çipinden dH2O'yu çıkarmak için 5 mL'lik bir şırınga kullanın. 0.15 mg/mL tip I kollajen (CTI) ile kuyunun dibini 0,02 M asetik asitle 1 saat kaplayın.
- Talaşı Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu tuzu ile kalsiyum ve magnezyum (DPBS++) ile üç kez durulayın.
- % 5 buzağı serumu, %5 fetal sığır serumu ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenen minimum esansiyel alfa ortamda (MEMα) 2 x 104 hücre/mL yoğunlukta MLO-Y4 osteositleri ile talaş tutucuya ve tohumuna yerleştirin.
- Boruları dağıtım uçlarından çıkarın ve talaşlı derin bir kültür çanağı (150 mm x 25 mm) içine yerleştirin. 37 °C'de ve %5 CO2'de 72 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- Dağıtım ipuçlarına steril borular takın ve harcanan kültür ortamını çipten çıkarmak için 5 mL'lik bir şırınga kullanın. Yavaş yavaş çip doldurmak için taze kültür ortamı dağıtmak.
- Talaş tutucuyu yükleme cihazı tabanının üstüne dikdörtgen insetiçine yerleştirin. Tüpü yükleme cihazının kapağında bulunan yuvalardan besleyin ve kapağı dört tava kafası vidası ve hex somunları ile tabanına sabitleyin.
NOT: Kapağın düz kalmasını sağlamak için, kalan iki vidayı emniyete almadan önce birbirinden çapraz olarak bulunan iki vidayı emniyete alın. - İstenilen plaka deplasmanına ulaşılıncaya kadar kadranı saat yönünde çevirerek hücrelere yük uygulayın.
NOT: Cihaz, kadranın bir dönüşü 1 mm plakalı bir deplasmana eşit olacak şekilde tasarlanmıştır. PDMS membranının üst kısmında oluşturulan gerilme alanı daha önce sonlu elemanlar analizi (FEA)13kullanılarak plaka deplasmanının bir fonksiyonu olarak modellenmiştir. - Yükleme cihazını boş bir P1000 mikropipet ucu kutusuna yerleştirin. 15 dakika boyunca uygulanan yük ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
NOT: Burada kullanılan yükleme süresi bir örnek olarak hizmet vermektedir. Alternatif yükleme süreleri kullanılabilir. - Kuluçkadan sonra, plaka orijinal başlangıç konumuna dönene kadar kadranı saat yönünün tersine çevirerek yükü hücrelerden çıkarın. Kapağı cihazdan çıkarın ve talaş tutucuyu derin kültür plakasına yerleştirin. 90 dk sonrası yük kurtarma süresi için hücreleri kuluçkaya yatırın.
NOT: Yine, burada kullanılan kurtarma süresi bir örnek olarak hizmet vermektedir. Alternatif kurtarma süreleri kullanılabilir. Uzun süreli çalışmalar için, her 72 saat hücreleri besleme. - Koşullu ortamı çipten çıkarmak için 5 mL'lik bir şırınga kullanın.
NOT: Bu ortam -80 °C'de kaydedilebilir ve saklanabilir. - Çipi talaş tutucudan çıkarın ve PDMS kapağı ile kuyu tabakası arasındaki bağı kırmak için konik bir spatula kullanın.
NOT: Hücresel tahliller artık bir hücre kültür plakası için belirlenen herhangi bir protokole göre yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sığ-iyi yapılandırma osteoblastlar ve osteoklastların fonksiyonel aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Osteoblastlar yoluyla kemik oluşumu ve osteoklastlar yoluyla rezorpsiyon birkaç hafta ay sırasına göre kültür asyon süreleri gerektirir. MC3T3-E1 ön osteoblastlarından kemik oluşumu alizarin kırmızısı ve von Kossa lekeleri kullanılarak ölçüldü11,15. 49. günde alizarin kırmızısı ile boyanmış ortalama yüzey alanı %10.7 ± %2.2 (ortalama nın ortalama ± standart hataları)11idi. Von Kossa ile boyanmış ortalama yüzey alanı %6.4 ±%1.6 11idi. Şekil 4A, 49. RAW264.7 pre-osteoklastlardan kemik rezorpsiyonu toluidin mavisi boyama kullanılarak ölçüldü 11,15. Gün 30 toluidin mavi siması ile boyanmış ortalama yüzey alanı 30.4% ± 4.5%11idi. Şekil 4B, 30. Rezorpsiyon çukurlarının varlığını doğrulamak için taramalı elektron mikroskobu yapıldı. Tipik sonuçlar Şekil 4C'degösterilmiştir. Bu sonuçlar, cihaz içindeki hücrelerin en az yedi hafta boyunca canlı ve işlevsel olarak aktif kaldığını göstermektedir.
3D baskılı yükleme cihazı, derin çip yapılandırmasına uyum sağlayacak şekilde tasarlanmış ve üretilmiştir. Birlikte, Bu sistem statik bir düzlem dışı distansiyon yoluyla hücreleri gererek osteosit mechanotransdüksiyon neden olabilir. 4.9 adımda tanımlanan çipin 48 saat kuluçka yada canlılığını ve tipik morfolojisini korumak için kritik bir süreç olduğu kanıtlanmıştır. Şekil 5A, bu kuluçka dönemi olan ve olmayan cipslerle tohumlanmış 72 saat mlo-Y4 osteositlerinin temsili görüntülerini gösterir. Yükleme nöbetleri sırasında osteositler, hücrelerin tohumlandığı PDMS zarında indüklenen bir gerinim gradyanına maruz kalmıştır(Ek Video 1). Bu işlem sırasında üretilen eşdeğer suşlar FEA13 ile modellenmiş ve PDMS membranının üstünde üretilen ortalama eşdeğer gerinim belirlenmiştir. Şekil 5B, 1 ile 2 mm arasındaki değerler için ortalama eşdeğer gerinim ile plaka deplasmanı arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Şekil 5C'deindüklenen gerinim degradesinin temsili bir ısı haritası gösterilmiştir. Bu örnekte, 1,5 mm'lik bir plaka deplasmanı membranın üst kısmında ortalama %12,29'luk bir eşdeğer gerilme oluşturmıştır. Bu model aynı zamanda kuyunun merkezine yakın indüklenen suşları nispeten düşük olduğunu göstermektedir ve yavaş yavaş radyal dışa doğru artış, plaka dış kenarının hemen üzerinde üretilen maksimum suşları ile. Yüklemeden sonra hücre canlılığı laktat dehidrogenaz boyama ve ek V ve ölü hücre test14,16ile analiz edildi. Tipik sonuçlar sırasıyla Şekil 5D,E'degösterilmiştir.
Şekil 1: Mikroakışkan cihaz. (A) Talaş maskesinin imalatı ve tesviyesi. (Sol) CAD yazılımı kullanılarak şirket içinde tasarlanan derin çip maskesi şeması. (Orta) Yüksek çözünürlüklü stereolitografi kullanılarak ticari olarak basılan derin çip maskesinin görüntüsü. (Sağ) Maske, talaşların 2. (B) Cihazın sığ-iyi ve derin kuyu tasarımlarının şematik çizimleri. (Üst) Sığ-iyi tasarım osteoblastlar ve osteoklastların fonksiyonel aktivitesini (oluşum ve rezorpsiyon) analiz etmek için kullanılmıştır. Bu yapılandırma iki PDMS katmanından oluşur. Katmanları birbirine kapatmadan önce kültürün dibine işlevsel bir aktivite alt katmanı yapıştırıldı. Osteoblast ve osteoklast kültürleri için sırasıyla polistiren diskler ve kemik gofretleri kullanıldı. (Alt) Derin kuyu tasarımı osteositlere mekanik yük uygulamak için kullanılmıştır. Bu yapılandırma üç PDMS katmanından oluşur. Kültürün alt kısmı deforme edilebilir PDMS membranı (tabaka 3) ile oluşur. (C) Osteoblast kültürleri için kullanılan polistiren disk için imalat adımları. Bir doku kültürü tedavi coverslip arka maskeleme bandı ile işaretlenmişti. Bireysel diskler bir mantar-borer ile kesildi. Disk etanol ve pamuklu bir bez le temizlendi. Teyp desteği kaldırıldı ve disk PDMS kültürünün altına iyi bağlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mekanik yükleme cihazının tasarımı ve montajı. (A) Monte edilen mekanik yükleme cihazının görüntüsü. PDMS yongasının derin tasarımıyla birleştiğinde, yükleme cihazı deforme edilebilir bir zara düzlem dışı bir şişkinlik uygulayarak hücreleri genişletir. (B) Aygıtın patlamış görünümü. Mavi renkte gösterilen tüm parçalar ısıya dayanıklı polilaktik asit filamenti ile 3Boyutlu olarak basılmıştır. Tüm donanım paslanmaz çeliktir. (C) Yükleme cihazının vida lı jak mekanizması. Merkezi vidanın (turuncu) dönüşü, plakayı (yeşil) tabandan yukarı doğru iter. Platen'in yukarı doğru hareketi, hücrelerin tohumlandığı derin kuyu çipinin PDMS zarını deforme eder. (D) Yükleme cihazının montaj işlemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mekanik yükleme deneyi. Tüm sıvılar erişim tüpüne bağlı 5 mL'lik bir şırınga kullanılarak çipten çıkarıldı ve uygulandı. Bu süreçte kritik bir adım hücre tohumlama önce steril distile su ile 48 h kuluçka olduğunu. Bu kuluçka olmadan hücreler düşük canlılık ve atipik morfoloji gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tipik fonksiyonel aktivite sonuçları. (A) Tipik oluşum sonuçları alizarin kırmızısı (solda) ve von Kossa (sağda) 49. Tüm disk görüntüleri 5,4 mm çapındadır. (B) Tipik osteoklast rezorpsiyonu, nükleer faktör kappa-B ligand (RANKL) reseptör aktivatörile indüklenen RAW264.7 preosteoklastlarından elde edilir. Hücreler kemik gofretleri üzerinde kültürlenmiş ve 30. (C) Kemik gofretlerinde rezorpsiyon çukurlarının varlığını doğrulayan tipik taramalı elektron mikroskobu görüntüleri. Üstteki resimdeki ölçek çubuğu 200 μm'yi temsil eder ve alttaki resimdeki ölçek çubuğu 50 μm'yi temsil eder.
Şekil 5: Mekanik kaynaklı suşların osteositler üzerindeki etkileri. (A) MLO-Y4 osteositlerinin 72 saat derin kuyuçipinde (solda) ve (sağda) hücre tohumlamadan önce distile su ile 48 saat kuluçka olmadan görüntüleri. (B) Yükleme cihazı plakasının yer değiştirmesine göre deforme edilebilir PDMS membranının üstünde oluşan ortalama eşdeğer gerilimi modellemek için sonlu elemanlar analizi kullanılmıştır. 1,0 mm ile 2,0 mm arasındaki yer değiştirmelerin sonuçları gösterilmiştir. (C) 1,5 mm.(D) 1,5 mm plakalı deplasman kullanılarak gerilmiş ilaç kaynaklı osteositlerin laktat dehidrogenaz lekesi için PDMS membranına indüklenen modellenmiş gerinim degradesinin ısı haritası. Kuyunun dış kenarına yakın daha hafif bir hücre boyama görülür, bu da hücre hasarı ve/veya ölüm göstergesi olan daha yüksek gerinim değerlerinin bulunduğu yere karşılık gelir. (E) Ek V ve ölü hücre tahsini ile gösterilen yüke bağlı apoptozun temsili akış sitometri sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Çıkarılabilir duvarlı 3B baskılı tesviye kutusu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Seviyeleme kutusu CAD dosyası 1. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Ek Dosya 2: Seviyeleme kutusu CAD dosyası 2. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Ek Dosya 3: Seviyeleme kutusu CAD dosyası 3. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Ek Dosya 4: Seviyeleme kutusu donanım listesi. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Ek Video 1: Mekanik yükleme cihazı. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, osteositler, osteoklastlar ve osteoblastlar için bir kemik remodeling LOC platformu imal için temelleri açıklanmaktadır. Çip içindeki kuyunun derinliğini ve boyutunu değiştirerek, osteositlerin mekanik yük ile uyarLanması ve kemik remodelinginin fonksiyonel sonuçlarının ölçülmesi için birden fazla konfigürasyon geliştirilmiştir(Şekil 1B).
Talaş montajı sırasında plazma oksidasyon protokolünün optimize edilmesi sızıntı endişelerini ortadan kaldırmak için kritik öneme yönelikti. PDMS yüzeylerinin orta RF güç ayarı (adım 4.1) kullanılarak üretilen 30 s oksijen plazmasına maruz kalmanın, yaklaşık 10,2 W'a eşit olduğunu, katmanlar arasında güçlü bir bağ oluşturmak için yeterli olduğunu bulduk. Daha uzun pozlama süreleri veya daha yüksek bir RF güç ayarı kullanıldığında bağın bütünlüğü azalmıştır. Bu oksijen plazma pdms bir aşırı pozlama artan yüzey pürüzlülüğü ve azaltılmış yapışkanlık17,18kaydetti önceki raporlar ile tutarlıdır.
Ayrıca, yüksek hücre canlılığı ve tipik hücre morfolojisi korumak kritik PDMS kür sürecine bağlı idi. PDMS polimer çapraz bağlı dimethylsiloxane oligomerler oluşur. Bu çapraz bağlama işlemi hem zamana hem de ısıya bağlıdır; ancak, polimer kapsamlı kür bile tam polimerize başarısız19. Kalan oligomerler çevreleyen hücre kültürü orta içine toplu polimer leach gösterilmiştir ve hatta polimer yüzeyinde yetiştirilen hücrelerin membranlarında bulunmuştur20. Çeşitli gruplar non-crosslinked PDMS oligomerler21,,22,,23sitotoksik etkileri bildirilmiştir. Sistemimizdeki bu endişeyi gidermek için PDMS kürleme işlemini optimize ettik. PDMS'nin kürleme hızı ısıya bağlı olmasına rağmen, talaş maskelerimizin malzeme özellikleri kürleme sıcaklığımızı 45 °C ile sınırlandırır. Bu nedenle, cips en az 18 saat pişirilmesi gerektiğini belirledik. Ayrıca, hücre tohumlamadan önce en az 48 saat dH2O ile çip kuluçkaya yatırmanın (adım 4.9) sitotoksik etkileri azaltmak için gerekli olduğunu bulduk. Şekil 5A, bu kuluçka dönemi olan ve olmayan çiplerle kültürlenmiş MLO-Y4 osteositlerini göstermektedir.
Mekanik yük uygulamasına uyum sağlamak üzere tasarlanmış derin kuyu yapılandırması, çipin üç ayrı katmandan üretilmesini gerektirir. Sığ-iyi yapılandırma aksine, derin-iyi yapılandırma için tek bir parça olarak kuyu ve membran kısımları imal membran çözgü neden oldu. Bu çipin kalın ve ince kısımları arasında kür oranları nda bir fark nedeniyle olabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için membran tabakası ayrı ayrı inşa edilmiş ve kür işleminden sonra çipin altına bağlanır. Düzgün kalınlığa sahip ayrı bir membran tabakası oluşturmak için, tesviye kutusunun PDMS 'yi (adım 1.4) eklemeden önce tamamen eşit olması önemlidir. Bu nedenle, yüksek derecede doğruluk sağlamak için dijital protractor kullanılması önerilir. Ayrıca, adım 2.3.2 sırasında, plastik bardaktan mümkün olduğunca çok PDMS çıkarmak için önemlidir. Bu adımdaki tutarsızlıklar membran kalınlıklarında yüksek sapmalara ve osteosit mekanotransdüksiyonuna neden olmak için kullanılan ortalama substrat suşunda sonuçta yüksek sapmalara yol açacaktır.
Kemik remodeling platformumuz yüksek derecede çok yönlülük sağlar. Bu sistem, yüke bağlı mekanotransdüksiyon, çok hücreli sinyalizasyon, inflamasyon veya ilaç etkileri gibi kemik remodeling düzenleyen çeşitli faktörleri araştırmak için kullanılabilir. Örneğin, sistem bir ilaç kaynaklı ortamda mekanik yük ve inflamasyon kombine etkilerini analiz etmek için kullanılmıştır14. Bifosfonat la tedavi edilen osteositlere mekanik yük uygulandı. Şartlı ortamın protein analizi, mekanik olarak yüklenmeyen osteositlere kıyasla leptin ve osteonektin düzeylerinde önemli bir artış ve CCL21 ve CD36 düzeylerinde önemli bir azalma saptandı14.
Burada sunulan protokoller, LOC içindeki her hücre tipinin birleştirilmesi nin yanı sıra mekanik yükü niçin indükleme ve işlevsel aktiviteyi ölçme yöntemleri için bir temel sağlar. İlerlediğimizde, çip üzerinde gerçek bir kemik organı na doğru çalışıyoruz. Ayrıca, matematiksel modelleme sistemleri geliştirmek için sistemimizi kullanarak büyük ölçüde kemik remodeling düzenleyen karmaşık çok hücreli sinyal süreçleri anlayışımızı geliştirmek inanıyorum24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Grant Nos( CBET 1060990 ve EBMS 1700299) kapsamında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından Hibe No (2018250692) kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yazarların görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
