منصة مختبر على رقاقة لتحفيز العظام Mechanotransduction وتحليل النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام
Summary
هنا، نقدم بروتوكولات لتحليل إعادة عرض العظام داخل منصة المختبر على رقاقة. يمكن إقران جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد مع النظام الأساسي للحث على إحداث ميكانيكية العظام عن طريق تشويه المصفوفة الخلوية. ويمكن أيضا أن تستخدم منصة لتحديد العظام إعادة عرض النتائج الوظيفية من العظام والعظام (resorption / تشكيل).
Abstract
إعادة عرض العظام هي عملية منظمة بإحكام مطلوبة لنمو الهيكل العظمي والإصلاح بالإضافة إلى التكيف مع التغيرات في البيئة الميكانيكية. خلال هذه العملية, الخلايا العظمية الميشانوالحساسة تنظيم الاستجابات المتعارضة بين العظام تقويضي والعظام الابتنائية. لفهم أفضل لمسارات الإشارات المعقدة للغاية التي تنظم هذه العملية ، طور مختبرنا منصة أساسية للمختبر على رقاقة (LOC) لتحليل النتائج الوظيفية (تشكيل وارتشاف) لإعادة عرض العظام داخل نظام صغير الحجم. كما إعادة عرض العظام هي عملية طويلة التي تحدث على ترتيب أسابيع إلى أشهر، وضعنا بروتوكولات زراعة الخلايا على المدى الطويل داخل النظام. وتزرع الخلايا العظمية والعظام على ركائز النشاط الوظيفي داخل LOC والحفاظ عليها لمدة تصل إلى سبعة أسابيع. بعد ذلك ، تم تفكيك الرقائق للسماح بالقياس الكمي لتكوين العظام وارتشافها. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتصميم جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد يُزوج منصة LOC ويمكن استخدامه للحث على إحداث النخاع العظمي عن طريق تشويه المصفوفة الخلوية. لقد قمنا بتحسين بروتوكولات زراعة الخلايا لخلايا العظام، والعظام، والعظام داخل منصة LOC وعالجنا مخاوف العقم والسمية الخلوية. هنا، نقدم بروتوكولات لتصنيع وتعقيم LOC، وخلايا البذر على ركائز وظيفية، وحفز الحمل الميكانيكي، وتفكيك LOC لتحديد نتائج نقطة النهاية. ونحن نعتقد أن هذه التقنيات تضع الأساس لتطوير الجهاز الحقيقي على رقاقة لإعادة عرض العظام.
Introduction
العظام هو نسيج ديناميكي للغاية يتطلب تنسيقًا معقدًا بين أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة: الخلايا العظمية والعظام والعظام. التفاعلات متعددة الخلايا بين هذه الخلايا هي المسؤولة عن فقدان العظام التي تحدث أثناء الشلل والجمود على المدى الطويل وتشكيل العظام التي تحدث استجابة للنمو وممارسة الرياضة. الخلايا العظمية، نوع الخلية العظمية الأكثر وفرة، حساسة للغاية للمحفزات الميكانيكية المطبقة على العظام. التحفيز الميكانيكي يغير النشاط الأيضي للعظام ويؤدي إلى زيادة في جزيئات الإشارات الرئيسية1،2. من خلال هذه العملية، والمعروفة باسم mechanotransduction، يمكن تنسيق الخلايا العظمية مباشرة أنشطة العظام (خلايا تشكيل العظام) والعظام (خلايا العظام resorbing). الحفاظ على التوازن العظام يتطلب تنظيما محكما بين تكوين العظام ومعدلات امتصاص العظام; ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الاضطرابات في هذه العملية إلى حالات المرض مثل هشاشة العظام أو هشاشة العظام.
تعقيد التفاعلات بين هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا يفسح المجال للتحقيق باستخدام تقنيات microfluidic والمختبر على رقاقة (LOC). وتحقيقا لهذه الغاية، وقد أنشأت مختبرنا مؤخرا دليلا على مفهوم منصة LOC لتحليل ارتشاف العظام وتشكيل (النتائج الوظيفية) في عملية إعادة عرض العظام. يمكن استخدام المنصة لدراسة التفاعلات الخلوية ، وبيئات التحميل المتغيرة ، وفحص المخدرات التحقيقية. في السنوات الأخيرة، تم تطوير أجهزة ميكروولينيك مختلفة للتحقيق في مسارات الإشارات الجزيئية التي تنظم إعادة عرض العظام. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الأنظمة تحدد إعادة عرض من خلال علامات غير مباشرة تدل على النشاط الوظيفي3،4،5،6،7. ميزة نظامنا هو أنه يمكن استخدامه للقياس الكمي المباشر للنتائج الوظيفية. إعادة عرض العظام هي عملية طويلة الأجل. على هذا النحو ، يتطلب التحديد الكمي المباشر لارتشاف العظام وتشكيلها نظامًا للزراعة يمكن الحفاظ عليه لمدة لا تقل عن عدة أسابيع إلى أشهر8،9،10،11. وهكذا، عند تطوير منصة LOC، أنشأنا بروتوكولات التبهي على المدى الطويل اللازمة لتشكيل وresorption والحفاظ على الخلايا داخل النظام لمدة تصل إلى سبعة أسابيع11. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بدمج ركائز الاستزراع المناسب لكلا النوعين من الخلايا في المنصة. تم استزراع العظام مباشرة على العظام ، وكانت الخلايا العظمية ، والتي تعرف أنها منالبلاستيك ، مُستزرعة على أقراص البوليسترين. وعلاوة على ذلك، تناولنا القضايا المتعلقة بالعقم، والسمية الخلايا على المدى الطويل والتفكيك رقاقة لإعادة عرض تحليل11،12.
ويمكن أيضا أن تستخدم منصة LOC للحث على mechanotransduction العظام من خلال تشوه مصفوفة. تم تطوير جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد ليقترن بـ LOC ويطبق جهازًا ثابتًا خارج المستوى لتمتد الخلايا13. لاستيعاب هذا الحمل الميكانيكي ، تم زيادة عمق البئر داخل LOC. هذا الحجم الصغير، بسيطة جهاز تحميل الميكانيكية يمكن أن تنتج بسهولة من قبل مختبرات ذات خبرة هندسية محدودة، ونحن قد شارك سابقا رسومات من المكونات المطبوعة 3D13. في العمل الحالي ، نبين بعض التقنيات الجديدة اللازمة للاستخدام الناجح للLOC . ونحن نعتقد أن شرح هذه التقنيات تستفيد من شكل البصرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه المقالة الأسس لتلفيق منصة LOC لإعادة عرض العظام لاستزراع الخلايا العظمية والعظام والعظام. عن طريق تغيير عمق وحجم البئر داخل الشريحة ، تم تطوير تكوينات متعددة لتحفيز العظام مع الحمل الميكانيكي وتحديد النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام(الشكل 1B).
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب رقم المنحة (CBET 1060990 وEBMS 1700299). كما تستند هذه المواد إلى العمل الذي يدعمه برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم (2018250692). أي آراء أو استنتاجات أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم.
Materials
| Acrylic sheet | Optix | — | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | — | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | — | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | — | — | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | — | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | — | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. . Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
