Een Lab-On-A-Chip Platform voor het stimuleren van Osteocyte Mechanotransductie en het analyseren van functionele resultaten van bone remodeling
Summary
Hier presenteren we protocollen voor het analyseren van botremodellering binnen een lab-on-a-chip platform. Een 3D-geprint mechanisch laadapparaat kan worden gekoppeld aan het platform om osteocyte mechanostransductie te induceren door de cellulaire matrix te vervormen. Het platform kan ook worden gebruikt om botremodellering functionele resultaten van osteoclasten en osteoblasten (resorptie / vorming) te kwantificeren.
Abstract
Bot remodelleren is een strak gereguleerd proces dat nodig is voor skeletgroei en reparatie, alsmede aan te passen aan veranderingen in de mechanische omgeving. Tijdens dit proces regelen mechanogevoelige osteocyten de tegengestelde reacties tussen de katabole osteoclasten en anabole osteoblasten. Om beter te begrijpen van de zeer ingewikkelde signaleringstrajecten die dit proces reguleren, heeft ons lab een fundamenteel lab-on-a-chip (LOC) platform ontwikkeld voor het analyseren van functionele uitkomsten (vorming en resorptie) van botremodelleren binnen een kleinschalig systeem. Aangezien botremodellering een langdurig proces is dat plaatsvindt in de orde van weken tot maanden, ontwikkelden we langetermijncelkweekprotocollen binnen het systeem. Osteoblasten en osteoclasten werden gekweekt op functionele activiteitsubstraten binnen de LOC en gedurende maximaal zeven weken onderhouden. Daarna werden chips gedemonteerd om de kwantificering van botvorming en resorptie mogelijk te maken. Daarnaast hebben we een 3D-geprint mechanisch laadapparaat ontworpen dat paren met het LOC-platform en kan worden gebruikt om osteocyte mechanotransductie te induceren door de cellulaire matrix te vervormen. We hebben celkweekprotocollen voor osteocyten, osteoblasten en osteoclasten binnen het LOC-platform geoptimaliseerd en hebben zorgen over steriliteit en cytotoxiciteit aangepakt. Hier presenteren we de protocollen voor het fabriceren en steriliseren van de LOC, het zaaien van cellen op functionele substraten, het opwekken van mechanische belasting en het demonteren van de LOC om eindpuntresultaten te kwantificeren. Wij geloven dat deze technieken de basis leggen voor het ontwikkelen van een echte orgaan-op-een-chip voor botremodellering.
Introduction
Bot is een zeer dynamisch weefsel dat ingewikkelde coördinatie tussen de drie belangrijkste celtypes vereist: osteocyten, osteoblasten en osteoclasten. Meercellige interacties tussen deze cellen zijn verantwoordelijk voor het botverlies dat optreedt tijdens verlamming en langdurige immobiliteit en voor de botvorming die optreedt in reactie op groei en lichaamsbeweging. Osteocyten, de meest voorkomende botcel type, zijn zeer gevoelig voor mechanische stimuli toegepast op het bot. Mechanische stimulatie verandert osteocyte metabolische activiteit en leidt tot een toename van de belangrijkste signaalmoleculen1,2. Door dit proces, bekend als mechanotransductie, kunnen osteocyten de activiteiten van osteoblasten (botvormende cellen) en osteoclasten (botresortencellen) direct coördineren. Het handhaven van bothomeostase vereist een strakke regeling tussen botvorming en botresorptiepercentages; echter, verstoringen in dit proces kan leiden tot ziekte toestanden zoals osteoporose of osteopetrorose.
De complexiteit van de interacties tussen deze drie celtypen leent zich goed voor onderzoek met behulp van microfluidic en lab-on-a-chip (LOC) technologieën. Daartoe heeft ons lab onlangs een proof of concept van een LOC-platform opgezet voor het analyseren van botresorptie en vorming (functionele uitkomsten) in het botremodelleringsproces. Het platform kan worden gebruikt voor de studie van cellulaire interacties, veranderde laadomgevingen en onderzoekende drugsscreening. In de afgelopen jaren zijn verschillende microfluïdische apparaten ontwikkeld voor het onderzoeken van de moleculaire signaleringstrajecten die het remodelleren van botten reguleren; Veel van deze systemen kwantificeren echter de herinrichting door middel van indirecte merkers die wijzen op functionele activiteit3,4,5,6,7. Een voordeel van ons systeem is dat het kan worden gebruikt voor directe kwantificering van functionele resultaten. Bot remodelleren is een proces op lange termijn. Als zodanig vereist directe kwantificering van botresorptie en vorming een kweeksysteem dat gedurende ten minste enkele weken tot maanden8,9,10,11kan worden gehandhaafd . Zo hebben we bij de ontwikkeling van het LOC-platform langdurige kweekprotocollen opgesteld die nodig zijn voor vorming en resorptie en hebben we cellen in het systeem tot zeven weken11onderhouden. Daarnaast hebben we geschikte kweeksubstraten voor beide celtypen in het platform verwerkt; osteoclasten werden gekweekt direct op het bot, en osteoblasten, waarvan bekend is dat plastic aanhanger, werden gekweekt op polystyreen schijven. Verder hebben we kwesties met betrekking tot steriliteit, cytotoxiciteit op lange termijn en spaan van de chip voor remodelleren analyse11,12.
Het LOC-platform kan ook worden gebruikt om osteocyte mechanotransductie te induceren door matrixvervorming. Een 3D-geprint mechanisch laadapparaat werd ontwikkeld om te koppelen met de LOC en een statische uit vliegtuigdistentie toe te passen om de cellen13uit te rekken. Om deze mechanische belasting aan te kunnen, werd de diepte van de put binnen de LOC vergroot. Deze kleine schaal, eenvoudige mechanische laadinrichting kan gemakkelijk worden geproduceerd door laboratoria met beperkte technische ervaring, en we hebben eerder gedeeld tekeningen van de 3D-geprinte componenten13. In het huidige werk demonstreren we enkele van de nieuwe technieken die nodig zijn voor het succesvol gebruik van de LOC. Concreet demonstreren we chipfabricage, celzaaien op functionele substraten, mechanische belasting en spaanvan de chip voor het verbouwen van kwantificering. Wij geloven dat de uitleg van deze technieken profiteren van een visueel formaat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft de fundamenten voor het fabriceren van een bot remodelleren LOC platform voor het kweken van osteocyten, osteoclasten, en osteoblasten. Door de diepte en grootte van de put in de chip te veranderen, werden meerdere configuraties ontwikkeld voor het stimuleren van osteocyten met mechanische belasting en het kwantificeren van functionele resultaten van botremodelleren(figuur 1B).
Tijdens de spaanmontage was het optimaliseren v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation in het kader van Grant Nos. (CBET 1060990 en EBMS 1700299). Ook is dit materiaal gebaseerd op werk ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant No. (2018250692). Alle adviezen, bevindingen, conclusies, of aanbevelingen uitgedrukt in dit materiaal zijn die van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation weerspiegelen.
Materials
| Acrylic sheet | Optix | — | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | — | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | — | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | — | — | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | — | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | — | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. . Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
