פלטפורמת מעבדה על שבב לעירור מכניציט וניתוח תוצאות פונקציונליות של שיפוץ עצם
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח שיפוץ. עצם בתוך פלטפורמת מעבדה על שבב 3D מודפס התקן טעינה מכני יכול להיות מזווג עם פלטפורמת כדי לגרום אוסטאופציט המכונה מנגנון על ידי ביטול היווצרות מטריצה הסלולר. הפלטפורמה יכולה לשמש גם כדי לכמת העצם שיפוצים שיפוץ התוצאות הפונקציונליות של אוסטאוקלנמשך ו אוסטאופאוטור/היווצרות.
Abstract
שיפוץ עצם הוא תהליך מוסדר היטב הנדרש עבור צמיחת השלד ותיקון, כמו גם הסתגלות לשינויים בסביבה המכנית. במהלך תהליך זה, מכונאי האוסטאופא רגיש לווסת את התגובות הנגדיות בין הcatabolic אוסטאוקלנמשך ו אנבוליים האוסטאופה. כדי להבין טוב יותר את מסלולים איתות מסובכים ביותר המסדירים את תהליך זה, המעבדה שלנו פיתחה מעבדה על-ידי שבב-על-a-chip (LOC) פלטפורמה לניתוח התוצאות פונקציונלי (היווצרות וריפורמציה) של שיפוץ העצם בתוך מערכת בקנה מידה קטן. כמו שיפוץ העצם הוא תהליך ממושך המתרחש בסדר של שבועות עד חודשים, פיתחנו לטווח ארוך פרוטוקולים תא culturing בתוך המערכת. אוסטאוקיים ו osteoclasts גדלו על מצעים פונקציונליים בתוך LOC ונשמר עד שבעה שבועות. לאחר מכן, השבבים היו מפורקים כדי לאפשר את כימות העצם של היווצרות וספיגת העצמות. בנוסף, עיצבנו 3D מודפס טעינת מכשיר מכני כי זוגות עם פלטפורמת LOC והוא יכול לשמש כדי לגרום התמרה מכניזציה על ידי ביטול היווצרות מטריצה הסלולר. יש לנו אופטימיזציה תא culturing פרוטוקולים עבור אוסטאופציטים, האוסטאופתיים, ו osteoclasts חזיקה בתוך פלטפורמת LOC והתייחסו חששות של עקרות ו ציטורעילות. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור בדיית ועיקור של LOC, זריעת תאים על מצעים פונקציונליים, גרימת עומס מכני, ופירוק LOC כדי לכמת תוצאות נקודת הקצה. אנו מאמינים כי טכניקות אלה מניחים את היסודות לפיתוח איבר אמיתי על שבב על שיפוץ העצם.
Introduction
עצם היא רקמה דינמית מאוד הדורשת תיאום מורכב בין שלושת סוגי התאים העיקריים: אוסטאופציטים, אוסטאופה ומחזיק מכשולים. אינטראקציות רב-תאיים בין תאים אלה אחראיות לאובדן העצם המתרחש במהלך שיתוק ובלתי ניידות ארוכת טווח ולהיווצרות העצם המתרחשת בתגובה לצמיחה ולהתעמלות. אוסטאופציטים, הסוג השופע ביותר תא העצם, הם רגישים מאוד גירוי מכני להחיל את העצם. גירוי מכני משנה את הפעילות המטבולית האוסטאופתית ומוביל לעלייה במולקולות איתות מפתח1,2. באמצעות תהליך זה, הידוע בשם מכניזציה, אוסטאופציטים יכול לתאם ישירות את הפעילויות של האוסטאופתית (תאים ויוצרים העצם) ו osteoclasts עצם ספיגת תאים). תחזוקת עצם הומאוסטזיס דורש רגולציה הדוקה בין היווצרות העצם לבין שיעורי ספיגת העצם; עם זאת, שיבושים בתהליך זה יכול לגרום למצבי מחלה כגון אוסטאופורוזיס או אוסטאופאואטזיס.
המורכבות של אינטראקציות בין שלושת סוגי התאים האלה משאיל את עצמה היטב לחקירה באמצעות microfluidic ומעבדה-על-שבב (LOC) טכנולוגיות. לשם כך, המעבדה שלנו הקימה לאחרונה הוכחת המושג של פלטפורמת LOC לניתוח ספיגת עצם והיווצרות (תוצאות פונקציונליות) בתהליך שיפוץ העצם. הפלטפורמה יכולה לשמש לחקר אינטראקציות סלולריות, שינוי סביבות טעינה, והקרנת תרופות למחקר. בשנים האחרונות, התקנים מיקרופלואידיג שונים פותחו לחקירת מסלולים איתות מולקולרי המסדירים שיפוץ העצם; עם זאת, רבים של מערכות אלה לכמת שיפוץ באמצעות סמנים עקיפים הרומז על פעילות תפקודית3,4,5,6,7. יתרון של המערכת שלנו היא כי הוא יכול לשמש לכימות ישיר של תוצאות פונקציונליות. שיפוץ עצם הוא תהליך ארוך טווח. ככזה, כימות ישיר של ספיגת עצם והיווצרות דורש מערכת culturing שניתן לשמור למינימום של מספר שבועות עד חודשים8,9,10,11. כך, בעת פיתוח פלטפורמת LOC, הקמנו פרוטוקולים לטווח ארוך culturing הדרושים להיווצרות וספיגת התאים ושמרו על תאי המערכת במשך עד שבעה שבועות11. בנוסף, אנו שולבו מצעים culturing המתאים לשני סוגי תאים לתוך הפלטפורמה; האוסטאופיויום היו מתורבתים ישירות על העצם, והאוסטאופאוקות, אשר ידועים כחסיד מפלסטיק, היו מתורבתים בדיסקים פוליסטירן. יתרה מזאת, הגענו לסוגיות הנוגעות לעקרות, רעילות לטווח ארוך ופירוק השבב לניתוח שיפוץ11,12.
פלטפורמת LOC יכול לשמש גם כדי לגרום להאצלת מכניציט באמצעות דפורמציה מטריצה. 3D מודפס התקן טעינה מכני פותחה לזוג עם LOC ולהחיל סטטי מתוך distention המטוס כדי למתוח את התאים13. כדי להכיל עומס מכני זה, העומק של הבאר בתוך LOC היה גדל. זה בקנה מידה קטן, מכשיר פשוט טעינה מכני יכול להיות מיוצר בקלות על ידי מעבדות עם ניסיון הנדסי מוגבל, ויש לנו שיתוף בעבר ציורים של רכיבים תלת-ממדיים מודפסים13. בעבודה הנוכחית, אנו מדגימים כמה טכניקות הרומן הדרוש לשימוש מוצלח של LOC. באופן ספציפי, אנו מדגימים הייצור שבב, התאים זריעת על מצעים פונקציונליים, העמסה טעינה מכני שבב עבור שיפוץ כימות. אנו מאמינים שההסבר לטכניקות אלה מפיקים תועלת מתבנית חזותית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר את היסודות עבור בדיית העצם שיפוצים LOC פלטפורמה עבור culturing אוסטאופציטים, אוסטאופתיים ומחזיק מכשולים. על ידי שינוי עומק וגודל של הבאר בתוך השבב, תצורות מרובות פותחו עבור מגרה אוסטאופציטים עם עומס מכני ובדיקת תוצאות פונקציונליות של שיפוץ העצם (איור 1B).
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט Nos. (CBET 1060990 ו-EBMS 1700299). כמו כן, חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על-ידי תוכנית המלגות למחקר בוגר קרן המדע הארצי תחת גרנט No. (2018250692). כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות המתבטאת בחומר זה הן של המחברים והן אינן משקפות בהכרח את השקפות הקרן הלאומית למדע.
Materials
| Acrylic sheet | Optix | — | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | — | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | — | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | — | — | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | — | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | — | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. . Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
