ऑस्टियोसाइट मेचनोट्रांसडुक्शन को उत्तेजित करने और बोन रीमॉडलिंग के कार्यात्मक परिणामों का विश्लेषण करने के लिए एक लैब-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म
Summary
यहां, हम एक प्रयोगशाला-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म के भीतर बोन रीमॉडलिंग का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। सेलुलर मैट्रिक्स को विकृत करके ऑस्टियोसाइट मेकेनोट्रांसडुक्शन को प्रेरित करने के लिए एक 3 डी मुद्रित यांत्रिक लोडिंग डिवाइस को मंच के साथ जोड़ा जा सकता है। मंच का उपयोग ऑस्टियोप्लास्ट और ऑस्टियोब्लास्ट (अवशोषण/गठन) से हड्डी रीमॉडलिंग कार्यात्मक परिणामों की मात्रा निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है।
Abstract
बोन रीमॉडलिंग एक कसकर विनियमित प्रक्रिया है जो कंकाल विकास और मरम्मत के साथ-साथ यांत्रिक वातावरण में परिवर्तन के अनुकूल होने के लिए आवश्यक है। इस प्रक्रिया के दौरान, मेचनोसेसिटिव ऑस्टियोसाइट्स कैटाबोलिक ऑस्टियोब्लास्ट और एनाबोलिक ऑस्टियोब्लास्ट के बीच विरोधी प्रतिक्रियाओं को विनियमित करते हैं। इस प्रक्रिया को विनियमित करने वाले अत्यधिक जटिल सिग्नलिंग रास्तों को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने एक छोटे पैमाने पर प्रणाली के भीतर हड्डी पुनर्मॉडलिंग के कार्यात्मक परिणामों (गठन और अवशोषण) का विश्लेषण करने के लिए एक नींव प्रयोगशाला-ऑन-ए-चिप (एलओसी) मंच विकसित किया है। चूंकि बोन रीमॉडलिंग एक लंबी प्रक्रिया है जो हफ्तों से महीनों तक के आदेश पर होती है, इसलिए हमने सिस्टम के भीतर दीर्घकालिक सेल क्यूल्चरिंग प्रोटोकॉल विकसित किए। ओएस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट नियंत्रण रेखा के भीतर कार्यात्मक गतिविधि सब्सट्रेट्स पर उगाए गए थे और सात सप्ताह तक बनाए रखे गए थे। इसके बाद, चिप्स को हड्डी गठन और अवशोषण की मात्रा के लिए अनुमति देने के लिए अलग किया गया। इसके अतिरिक्त, हमने एक 3 डी मुद्रित यांत्रिक लोडिंग डिवाइस तैयार किया है जो एलओसी प्लेटफॉर्म के साथ जोड़े करता है और सेलुलर मैट्रिक्स को विकृत करके ऑस्टियोसाइट मेचनोट्रांसडुक्शन को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। हमने नियंत्रण रेखा के भीतर ऑस्टियोसाइट्स, ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट के लिए सेल क्यूलिटिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है और बंध्याकरण और साइटोटॉक्सिकिटी की चिंताओं को दूर किया है। यहां, हम एलओसी को बनाने और स्टरलाइज करने, कार्यात्मक सब्सट्रेट्स पर सीडिंग कोशिकाओं, यांत्रिक भार को प्रेरित करने और अंत बिंदु परिणामों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एलओसी को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमारा मानना है कि इन तकनीकों को हड्डी remodeling के लिए एक सच्चे अंग पर एक चिप विकसित करने के लिए नींव रखना ।
Introduction
हड्डी एक अत्यधिक गतिशील ऊतक है जिसके लिए तीन प्रमुख कोशिका प्रकारों के बीच जटिल समन्वय की आवश्यकता होती है: ऑस्टियोसाइट्स, ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट। इन कोशिकाओं के बीच बहुकोशिकीय बातचीत हड्डी के नुकसान के लिए जिम्मेदार होती है जो पक्षाघात और दीर्घकालिक गतिहीनता के दौरान और हड्डी गठन के लिए होती है जो विकास और व्यायाम के जवाब में होती है। ऑस्टियोसाइट्स, सबसे प्रचुर मात्रा में हड्डी कोशिका प्रकार, हड्डी पर लागू यांत्रिक उत्तेजनाओं के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं। यांत्रिक उत्तेजना ऑस्टियोसाइट मेटाबोलिक गतिविधि को बदल देती है और प्रमुख संकेत अणुओं में वृद्धि होती है1,2. इस प्रक्रिया के माध्यम से, जिसे मेचनोट्रांसडुक्शन के रूप में जाना जाता है, ऑस्टियोसाइट्स सीधे ऑस्टियोब्लास्ट (हड्डी बनाने वाली कोशिकाओं) और ऑस्टियोप्लास्ट (बोन रिसोरबिंग कोशिकाओं) की गतिविधियों का समन्वय कर सकते हैं। हड्डी होमोस्टोसिस को बनाए रखने के लिए हड्डी गठन और हड्डी अवशोषण दरों के बीच एक तंग विनियमन की आवश्यकता होती है; हालांकि, इस प्रक्रिया में व्यवधान ों के परिणामस्वरूप ऑस्टियोपोरोसिस या ऑस्टियोपेट्रोसिस जैसे रोग राज्य हो सकते हैं।
इन तीन सेल प्रकारों के बीच बातचीत की जटिलता माइक्रोफ्लूइडिक और लैब-ऑन-ए-चिप (एलओसी) प्रौद्योगिकियों का उपयोग करते हुए जांच करने के लिए अच्छी तरह से उधार देता है। इस उद्देश्य के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में हड्डी पुनर्मॉडलिंग प्रक्रिया में अस्थि अवशोषण और गठन (कार्यात्मक परिणामों) का विश्लेषण करने के लिए एक एलओसी मंच की अवधारणा का सबूत स्थापित किया है। मंच सेलुलर बातचीत, बदल लोडिंग वातावरण, और जांच दवा स्क्रीनिंग के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हाल के वर्षों में, हड्डी के रीमॉडलिंग को विनियमित करने वाले आणविक सिग्नलिंग रास्तों की जांच के लिए विभिन्न माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण विकसित किए गए हैं; हालांकि, इन प्रणालियों के कई अप्रत्यक्ष मार्कर के माध्यम से रीमॉडलिंग की मात्रा है कि कार्यात्मक गतिविधि3,4 ,5,,66,7का संकेत कर रहे हैं ., हमारी प्रणाली का एक लाभ यह है कि इसका उपयोग कार्यात्मक परिणामों के प्रत्यक्ष परिमाणीकरण के लिए किया जा सकता है। बोन रीमॉडलिंग एक दीर्घकालिक प्रक्रिया है। इस प्रकार, अस्थि अवशोषण और गठन के प्रत्यक्ष परिमाणीकरण के लिए एक एक कुल प्रणाली की आवश्यकता होती है जिसे न्यूनतम कई हफ्तों से,8,9,10,,11महीनों तक बनाए रखा जा सकता है।, इस प्रकार, एलओसी प्लेटफॉर्म को विकसित करते समय, हमने गठन और अवशोषण के लिए आवश्यक दीर्घकालिक खेती प्रोटोकॉल स्थापित किए और सात सप्ताह11तक के लिए सिस्टम के भीतर कोशिकाओं को बनाए रखा है। इसके अतिरिक्त, हमने मंच में दोनों सेल प्रकारों के लिए उपयुक्त खेती सब्सट्रेट्स को शामिल किया; ऑस्टियोप्लास्ट सीधे हड्डी पर सुसंस्कृत थे, और ऑस्टियोब्लास्ट, जिन्हें प्लास्टिक अनुयायी माना जाता है, पॉलीस्टीरिन डिस्क पर सुसंस्कृत थे। इसके अलावा, हमने11,,12के पुनर्मॉडलिंग विश्लेषण के लिए बंध्यता, दीर्घकालिक साइटोटॉक्सिकिटी और चिप डिसअसिबल से संबंधित मुद्दों को संबोधित किया ।
एलओसी प्लेटफॉर्म का उपयोग मैट्रिक्स विरूपण के माध्यम से ऑस्टियोसाइट मेचनोट्रांसडुक्शन को प्रेरित करने के लिए भी किया जा सकता है। एलओसी के साथ जोड़ी बनाने के लिए एक 3डी मुद्रित यांत्रिक लोडिंग उपकरण विकसित किया गया था और कोशिकाओंको 13तक फैलाने के लिए विमान की डिटेंक्शन से एक स्थिर लागू किया गया था । इस मैकेनिकल लोड को समायोजित करने के लिए एलओसी के भीतर कुएं की गहराई बढ़ाई गई थी। इस छोटे पैमाने पर, सरल यांत्रिक लोडिंग डिवाइस को सीमित इंजीनियरिंग अनुभव के साथ प्रयोगशालाओं द्वारा आसानी से उत्पादित किया जा सकता है, और हमने पहले 3 डी मुद्रित घटकों13के चित्र साझा किए हैं। वर्तमान कार्य में, हम नियंत्रण रेखा के सफल उपयोग के लिए आवश्यक कुछ उपन्यास तकनीकों का प्रदर्शन करते हैं । विशेष रूप से, हम चिप निर्माण, कार्यात्मक सब्सट्रेट्स पर सेल सीडिंग, यांत्रिक लोडिंग और मात्राीकरण को फिर से तैयार करने के लिए चिप डिसअसम्बले का प्रदर्शन करते हैं । हमारा मानना है कि इन तकनीकों का स्पष्टीकरण एक दृश्य प्रारूप से लाभान्वित होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख ऑस्टियोसाइट्स, ऑस्टियोप्लास्ट और ऑस्टियोब्लास्ट की रचनात्मकता के लिए बोन रीमॉडलिंग एलओसी प्लेटफॉर्म बनाने की नींव का वर्णन करता है। चिप के भीतर कुएं की गहराई और आकार में फेरबदल करके, यांत्रिक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ग्रांट नग (सीबीएटी 1060990 और ईबीएस 1700299) के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन ने सपोर्ट किया था। इसके अलावा, यह सामग्री ग्रांट नंबर (2018250692) के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित काम पर आधारित है। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित करें।
Materials
| Acrylic sheet | Optix | — | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | — | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | — | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | — | — | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | — | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | — | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
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