골연세포 메카노트랜스덕션 을 자극하고 뼈 리모델링의 기능적 결과 분석을 위한 Lab-On-A-Chip 플랫폼
Summary
여기서는 랩 온 어 칩 플랫폼 내에서 뼈 리모델링을 분석하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 3D 프린팅 된 기계적 로딩 장치는 셀룰러 매트릭스를 변형시킴으로써 골혈구 기계화 변환을 유도하기 위해 플랫폼과 페어링 될 수 있습니다. 이 플랫폼은 또한 파골 세포와 파골 세포 (재흡수 / 형성)에서 뼈 리모델링 기능 결과를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
뼈 리모델링은 골격 성장 및 수리뿐만 아니라 기계 환경의 변화에 적응하는 데 필요한 엄격하게 규제되는 프로세스입니다. 이 과정에서 메카노에민성 골세포는 이화 파골세포와 단백 동화 골아세포 사이의 반대 반응을 조절합니다. 이 프로세스를 조절하는 매우 복잡한 신호 경로를 더 잘 이해하기 위해 당사의 실험실은 소규모 시스템 내에서 뼈 리모델링의 기능적 결과(형성 및 재흡수)를 분석하기 위한 기초 실험실 온 어 칩(LOC) 플랫폼을 개발했습니다. 뼈 리모델링은 몇 주에서 몇 달까지 진행되는 긴 과정이므로 시스템 내에서 장기 세포 배양 프로토콜을 개발했습니다. 골아세포 및 파골세포는 LOC 내의 기능활성 기판상에서 성장시키고 최대 7주 동안 유지하였다. 그 후, 칩을 분해하여 뼈 형성 및 재흡수의 정량화를 허용하였습니다. 또한 LOC 플랫폼과 페어링되는 3D 프린팅 기계 적재 장치를 설계했으며 셀룰러 매트릭스를 변형하여 골혈구 메카노 트랜스듀션을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 LOC 플랫폼 내에서 골세포, 골세포 및 파골세포에 대한 세포 배양 프로토콜을 최적화했으며 불임 및 세포 독성에 대한 우려를 해결했습니다. 여기서는 LOC의 제조 및 살균, 기능성 기판의 시딩 셀, 기계적 부하 유도 및 LOC 분해를 통해 엔드포인트 결과를 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이러한 기술이 뼈 리모델링을위한 진정한 오르간 온 칩을 개발하기위한 토대를 마련한다고 믿습니다.
Introduction
뼈는 세 가지 주요 세포 유형 중 복잡한 조정을 필요로하는 매우 역동적 인 조직입니다: 골세포, 골세포, 파골 세포. 이 세포 사이 다세포 상호 작용은 마비 와 장기 부동성 도중 생기는 뼈 손실에 및 성장과 운동에 응하여 생기는 뼈 대형에 책임 있습니다. 가장 풍부한 뼈 세포 유형인 골세포는 뼈에 가해지는 기계적 자극에 매우 민감합니다. 기계적 자극은 골혈구 대사 활성을 변화시키고 주요 신호 분자1,,2의증가로 이어집니다. 이 과정을 통해, 메카노 트랜스 덕션으로 알려진, 골세포는 직접 골아세포 (뼈 형성 세포)와 파골 세포 (뼈 재소자 세포)의 활동을 조정할 수 있습니다. 뼈 항상성을 유지 하려면 뼈 형성 및 뼈 흡수 속도 사이 엄격한 규제 필요; 그러나, 이 프로세스에 있는 중단은 골다공증 골다공증 골다공증 골다공증골페트로증과 같은 질병 국가 귀착될 수 있습니다.
이 3개의 세포 모형 사이 상호 작용의 복잡성은 마이크로 유체 및 실험실 에 칩 (LOC) 기술을 이용한 조사에 잘 빌려준다. 이를 위해 우리 연구실은 최근 뼈 리모델링 과정에서 뼈 재흡수 및 형성(기능적 결과)을 분석하기 위한 LOC 플랫폼의 개념 증명을 확립했습니다. 이 플랫폼은 세포 상호 작용, 변경된 로딩 환경 및 조사용 약물 스크리닝 연구에 사용될 수 있습니다. 최근, 뼈 리모델링을 조절 하는 분자 신호 경로 조사 하기 위해 다양 한 미세 유체 장치 개발 되었습니다.; 그러나, 이러한 시스템의 대부분은 기능 적 활동3,,4,,5,,6,,7을나타내는 간접 마커를 통해 리모델링을 정량화한다. 우리 시스템의 장점은 기능적 결과의 직접 정량화에 사용할 수 있다는 것입니다. 뼈 리모델링은 장기적인 과정입니다. 이와 같이, 골 흡수 및 형성의 직접 정량화는,,8개월, 9,810,911까지최소 몇 주 동안 유지될 수 있는 배양 시스템을 필요로 한다. 따라서 LOC 플랫폼을 개발할 때 형성 및 재흡수에 필요한 장기 배양 프로토콜을 확립하고 최대 7주 동안 시스템 내에서 세포를유지관리했습니다 11. 추가적으로, 우리는 플랫폼에 두 세포 모형을 위한 적당한 배양 기판을 통합했습니다; 골골세포는 뼈에 직접 배양되었고, 플라스틱 부착으로 알려진 조골 세포는 폴리스티렌 디스크에서 배양되었습니다. 또한, 리모델링 분석을 위한 불임, 장기 세포독성 및 칩 분해에 관한 문제를해결하였으며 11,,12.
LOC 플랫폼은 또한 매트릭스 변형을 통해 골혈구 메카노 트랜스듀션을 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 3D 프린팅 기계적 로딩 장치는 LOC와 페어링하고 평면 소멸에서 정적을 적용하여셀(13)을스트레칭하도록 개발되었다. 이러한 기계적 하중을 수용하기 위해 LOC 내의 웰 깊이가 증가했습니다. 이 작은 규모, 간단한 기계 적재 장치는 제한된 엔지니어링 경험이있는 실험실에서 쉽게 생산 할 수 있으며 이전에 3D 인쇄 구성 요소(13)의도면을 공유했습니다. 현재 작업에서, 우리는 LOC의 성공적인 사용에 필요한 새로운 기술의 일부를 보여줍니다. 구체적으로, 우리는 칩 제조, 기능 기판에 셀 시드, 기계적 로딩 및 리모델링 정량화를위한 칩 분해를 보여줍니다. 우리는 이러한 기술에 대한 설명이 시각적 형식의 이점을 얻을 수 있다고 믿습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 골혈구, 파골세포 및 조골 세포배양용 뼈 리모델링 LOC 플랫폼을 제작하기 위한 기초를 설명합니다. 칩 내의 우물의 깊이와 크기를 변경함으로써, 기계적 하중으로 골혈구를 자극하고 뼈 리모델링의 기능적 결과를 정량화하기 위한 여러 구성이 개발되었습니다(그림1B).
칩 조립 중에 플라즈마 산화 프로토콜을 최적화하는 것은…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 그랜트 Nos. (CBET 1060990 및 EBMS 1700299)에서 국립 과학 재단에 의해 지원되었다. 또한, 이 자료는 그랜트 번호 (2018250692)에 따라 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원 되는 작업을 기반으로합니다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.
Materials
| Acrylic sheet | Optix | — | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | — | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | — | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | — | — | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | — | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | — | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
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