Summary

골연세포 메카노트랜스덕션 을 자극하고 뼈 리모델링의 기능적 결과 분석을 위한 Lab-On-A-Chip 플랫폼

Published: May 21, 2020
doi:

Summary

여기서는 랩 온 어 칩 플랫폼 내에서 뼈 리모델링을 분석하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 3D 프린팅 된 기계적 로딩 장치는 셀룰러 매트릭스를 변형시킴으로써 골혈구 기계화 변환을 유도하기 위해 플랫폼과 페어링 될 수 있습니다. 이 플랫폼은 또한 파골 세포와 파골 세포 (재흡수 / 형성)에서 뼈 리모델링 기능 결과를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

뼈 리모델링은 골격 성장 및 수리뿐만 아니라 기계 환경의 변화에 적응하는 데 필요한 엄격하게 규제되는 프로세스입니다. 이 과정에서 메카노에민성 골세포는 이화 파골세포와 단백 동화 골아세포 사이의 반대 반응을 조절합니다. 이 프로세스를 조절하는 매우 복잡한 신호 경로를 더 잘 이해하기 위해 당사의 실험실은 소규모 시스템 내에서 뼈 리모델링의 기능적 결과(형성 및 재흡수)를 분석하기 위한 기초 실험실 온 어 칩(LOC) 플랫폼을 개발했습니다. 뼈 리모델링은 몇 주에서 몇 달까지 진행되는 긴 과정이므로 시스템 내에서 장기 세포 배양 프로토콜을 개발했습니다. 골아세포 및 파골세포는 LOC 내의 기능활성 기판상에서 성장시키고 최대 7주 동안 유지하였다. 그 후, 칩을 분해하여 뼈 형성 및 재흡수의 정량화를 허용하였습니다. 또한 LOC 플랫폼과 페어링되는 3D 프린팅 기계 적재 장치를 설계했으며 셀룰러 매트릭스를 변형하여 골혈구 메카노 트랜스듀션을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 LOC 플랫폼 내에서 골세포, 골세포 및 파골세포에 대한 세포 배양 프로토콜을 최적화했으며 불임 및 세포 독성에 대한 우려를 해결했습니다. 여기서는 LOC의 제조 및 살균, 기능성 기판의 시딩 셀, 기계적 부하 유도 및 LOC 분해를 통해 엔드포인트 결과를 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이러한 기술이 뼈 리모델링을위한 진정한 오르간 온 칩을 개발하기위한 토대를 마련한다고 믿습니다.

Introduction

뼈는 세 가지 주요 세포 유형 중 복잡한 조정을 필요로하는 매우 역동적 인 조직입니다: 골세포, 골세포, 파골 세포. 이 세포 사이 다세포 상호 작용은 마비 와 장기 부동성 도중 생기는 뼈 손실에 및 성장과 운동에 응하여 생기는 뼈 대형에 책임 있습니다. 가장 풍부한 뼈 세포 유형인 골세포는 뼈에 가해지는 기계적 자극에 매우 민감합니다. 기계적 자극은 골혈구 대사 활성을 변화시키고 주요 신호 분자1,,2의증가로 이어집니다. 이 과정을 통해, 메카노 트랜스 덕션으로 알려진, 골세포는 직접 골아세포 (뼈 형성 세포)와 파골 세포 (뼈 재소자 세포)의 활동을 조정할 수 있습니다. 뼈 항상성을 유지 하려면 뼈 형성 및 뼈 흡수 속도 사이 엄격한 규제 필요; 그러나, 이 프로세스에 있는 중단은 골다공증 골다공증 골다공증 골다공증골페트로증과 같은 질병 국가 귀착될 수 있습니다.

이 3개의 세포 모형 사이 상호 작용의 복잡성은 마이크로 유체 및 실험실 에 칩 (LOC) 기술을 이용한 조사에 잘 빌려준다. 이를 위해 우리 연구실은 최근 뼈 리모델링 과정에서 뼈 재흡수 및 형성(기능적 결과)을 분석하기 위한 LOC 플랫폼의 개념 증명을 확립했습니다. 이 플랫폼은 세포 상호 작용, 변경된 로딩 환경 및 조사용 약물 스크리닝 연구에 사용될 수 있습니다. 최근, 뼈 리모델링을 조절 하는 분자 신호 경로 조사 하기 위해 다양 한 미세 유체 장치 개발 되었습니다.; 그러나, 이러한 시스템의 대부분은 기능 적 활동3,,4,,5,,6,,7을나타내는 간접 마커를 통해 리모델링을 정량화한다. 우리 시스템의 장점은 기능적 결과의 직접 정량화에 사용할 수 있다는 것입니다. 뼈 리모델링은 장기적인 과정입니다. 이와 같이, 골 흡수 및 형성의 직접 정량화는,,8개월, 9,810,911까지최소 몇 주 동안 유지될 수 있는 배양 시스템을 필요로 한다. 따라서 LOC 플랫폼을 개발할 때 형성 및 재흡수에 필요한 장기 배양 프로토콜을 확립하고 최대 7주 동안 시스템 내에서 세포를유지관리했습니다 11. 추가적으로, 우리는 플랫폼에 두 세포 모형을 위한 적당한 배양 기판을 통합했습니다; 골골세포는 뼈에 직접 배양되었고, 플라스틱 부착으로 알려진 조골 세포는 폴리스티렌 디스크에서 배양되었습니다. 또한, 리모델링 분석을 위한 불임, 장기 세포독성 및 칩 분해에 관한 문제를해결하였으며 11,,12.

LOC 플랫폼은 또한 매트릭스 변형을 통해 골혈구 메카노 트랜스듀션을 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 3D 프린팅 기계적 로딩 장치는 LOC와 페어링하고 평면 소멸에서 정적을 적용하여셀(13)을스트레칭하도록 개발되었다. 이러한 기계적 하중을 수용하기 위해 LOC 내의 웰 깊이가 증가했습니다. 이 작은 규모, 간단한 기계 적재 장치는 제한된 엔지니어링 경험이있는 실험실에서 쉽게 생산 할 수 있으며 이전에 3D 인쇄 구성 요소(13)의도면을 공유했습니다. 현재 작업에서, 우리는 LOC의 성공적인 사용에 필요한 새로운 기술의 일부를 보여줍니다. 구체적으로, 우리는 칩 제조, 기능 기판에 셀 시드, 기계적 로딩 및 리모델링 정량화를위한 칩 분해를 보여줍니다. 우리는 이러한 기술에 대한 설명이 시각적 형식의 이점을 얻을 수 있다고 믿습니다.

Protocol

1. 칩 마스크 준비 참고: 1.1단계 – 1.3단계는 칩 마스크를 처음 받으면 한 번만 수행하면 됩니다. 사용 중에 마스크가 절하지 않도록 합니다. 미세 유체 마스크의 설계는 이전에11,,14를기술했다. 마스크는 사내에서 설계되었으며 고해상도 스테레오리소그래피(그림1A)를사용하여 상업적으로 제작되었?…

Representative Results

얕은 웰 구성은 조골 세포 및 골골아의 기능 적 활성을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 파골 세포와 파골 세포에 의한 재흡수를 통한 뼈 형성은 몇 주에서 몇 달까지의 순서로 배양 시간을 필요로합니다. MC3T3-E1 프리골아세포로부터의 뼈 형성은 알리자린 레드 및 폰 코사 얼룩11,,15를사용하여 정량화되었다. 49일째에, 알리자린 …

Discussion

이 기사에서는 골혈구, 파골세포 및 조골 세포배양용 뼈 리모델링 LOC 플랫폼을 제작하기 위한 기초를 설명합니다. 칩 내의 우물의 깊이와 크기를 변경함으로써, 기계적 하중으로 골혈구를 자극하고 뼈 리모델링의 기능적 결과를 정량화하기 위한 여러 구성이 개발되었습니다(그림1B).

칩 조립 중에 플라즈마 산화 프로토콜을 최적화하는 것은…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 그랜트 Nos. (CBET 1060990 및 EBMS 1700299)에서 국립 과학 재단에 의해 지원되었다. 또한, 이 자료는 그랜트 번호 (2018250692)에 따라 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원 되는 작업을 기반으로합니다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.

Materials

Acrylic sheet Optix 3.175 mm thick
Angled dispensing tips Jensen Global JG18-0.5X-90 Remove plastic connector prior to use
Biopsy punch Robbins Instruments RBP-10 1 mm diameter
Bone wafers Boneslices.com 0.4 mm thick Bovine cortical bone
Bovine calf serum Hyclone SH30072
Calipers Global Industrial T9F534164
Cell spatula TPP 99010
Chip mask ProtoLabs Custom-designed Print material: Accura SL 5530
Cork borer Fisher Scientific 07-865-10B
Cotton tipped applicator Puritan 806-WCL
Culture dish (100 mm) Corning 430591 Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm) Corning 430597 Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape 3M Company Scotch 237
Fetal bovine serum Hyclone SH30910
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Leveling box Custom-made 3D printed
Masking tape 3M Company Scoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblasts ATCC CRL-2593 Subclone 4
Mechanical loading device Custom-made 3D printed
Minimum essential alpha medium Gibco 12571-063
MLO-Y4 osteocytes Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tape Duck Brand Standard packaging tape
Paraffin film Bemis Parafilm PM999
Penicillin/streptomycin Invitrogen p4333
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kit Dow Corning Sylgard 184
Polystyrene coverslips Nunc Thermanox 174942 Sterile, tissue culture treated
Oven Quincy Lab 12-180
RAW264.7 preosteoclasts ATCC TIB-71
Scalpel BD Medical 372611
Silicone tubing Saint-Gobain Tygon ABW00001 ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks software Dassault Systèmes Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesive Loctite 2323879 Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml) BD Medical 309646 Sterile
Syringe pump Harvard Apparatus 70-2213 Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatula Fisher Scientific 21-401-10
Two-part expoxy Loctite 1395391 5 minute quick set
Type I collagen Corning 354236 Rat tail collagen
Vacuum desiccator Bel-Art F42010-0000
Waterproof sealant Gorilla 8090001 100% silicone sealant

References

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Truesdell, S. L., George, E. L., Van Vranken, C. C., Saunders, M. M. A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling. J. Vis. Exp. (159), e61076, doi:10.3791/61076 (2020).

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