Summary
Aqui, apresentamos protocolos para analisar a remodelagem óssea dentro de uma plataforma lab-on-a-chip. Um dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D pode ser emparelhado com a plataforma para induzir a mechanostransdução de osteócitos, deformando a matriz celular. A plataforma também pode ser usada para quantificar os resultados funcionais de remodelação óssea de osteoclastos e osteoblastos (reabsorção/formação).
Abstract
A remodelagem óssea é um processo bem regulado que é necessário para o crescimento e reparo esquelético, bem como adaptação às mudanças no ambiente mecânico. Durante esse processo, os osteócitos mecanosensíveis regulam as respostas opostas entre os osteoclastos catabólicos e osteoblastos anabólicos. Para entender melhor as vias de sinalização altamente intrincadas que regulam esse processo, nosso laboratório desenvolveu uma plataforma fundacional lab-on-a-chip (LOC) para analisar resultados funcionais (formação e reabsorção) de remodelação óssea dentro de um sistema de pequena escala. Como a remodelagem óssea é um processo demorado que ocorre na ordem de semanas a meses, desenvolvemos protocolos de culturing celular de longo prazo dentro do sistema. Os teoblastos e osteoclastos foram cultivados em substratos de atividade funcional dentro do LOC e mantidos por até sete semanas. Posteriormente, os chips foram desmontados para permitir a quantificação da formação e reabsorção óssea. Além disso, projetamos um dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D que combina com a plataforma LOC e pode ser usado para induzir mecanotransdução de osteócitos, deformando a matriz celular. Otimizamos protocolos de cultivo celular para osteócitos, osteoblastos e osteoclastos dentro da plataforma LOC e abordamos preocupações de esterilidade e citotoxicidade. Aqui, apresentamos os protocolos para fabricação e esterilização do LOC, semeamento de células em substratos funcionais, indução de carga mecânica e desmontagem do LOC para quantificar os resultados do ponto final. Acreditamos que essas técnicas estabelecem as bases para o desenvolvimento de um verdadeiro órgão-em-um-chip para a remodelagem óssea.
Introduction
Osso é um tecido altamente dinâmico que requer uma coordenação intrincada entre os três principais tipos de células: osteócitos, osteoblastos e osteoclastos. As interações multicelulares entre essas células são responsáveis pela perda óssea que ocorre durante a paralisia e a imobilidade a longo prazo e pela formação óssea que ocorre em resposta ao crescimento e exercício. Os osteócitos, o tipo de célula óssea mais abundante, são altamente sensíveis a estímulos mecânicos aplicados ao osso. A estimulação mecânica altera a atividade metabólica dos osteócitos e leva a um aumento nas moléculas de sinalização chave1,2. Através desse processo, conhecido como mecanotransdução, os osteócitos podem coordenar diretamente as atividades de osteoblastos (células formadoras ósseas) e osteoclastos (células de resorização óssea). A manutenção da homeostase óssea requer uma regulação rigorosa entre a formação óssea e as taxas de reabsorção óssea; no entanto, interrupções nesse processo podem resultar em estados da doença, como osteoporose ou osteopetrose.
A complexidade das interações entre esses três tipos de células se presta bem à investigação utilizando tecnologias microfluidas e lab-on-a-chip (LOC). Para isso, nosso laboratório estabeleceu recentemente a prova do conceito de uma plataforma LOC para análise de reabsorção e formação óssea (resultados funcionais) no processo de remodelação óssea. A plataforma pode ser usada para o estudo de interações celulares, ambientes de carregamento alterados e triagem de medicamentos investigacionais. Nos últimos anos, vários dispositivos microfluidos foram desenvolvidos para investigar as vias de sinalização molecular que regulam a remodelagem óssea; no entanto, muitos desses sistemas quantificam a remodelação através de marcadores indiretos que são indicativos de atividade funcional3,4,5,6,7. Uma vantagem do nosso sistema é que ele pode ser usado para quantificação direta de resultados funcionais. A remodelagem óssea é um processo de longo prazo. Como tal, a quantificação direta da reabsorção e formação óssea requer um sistema de cultivo que pode ser mantido por um mínimo de várias semanas a meses8,,9,,10,,11. Assim, ao desenvolver a plataforma LOC, estabelecemos protocolos de cultivo de longo prazo necessários para formação e reabsorção e mantivemos células dentro do sistema por até sete semanas11. Além disso, incorporamos substratos de cultivo apropriados para ambos os tipos de células na plataforma; osteoclastos foram cultivados diretamente no osso, e os osteoblastos, que são conhecidos por serem adeptos de plástico, foram cultivados em discos de poliestireno. Além disso, abordamos questões relativas à esterilidade, citotoxicidade a longo prazo e desmontagem de chips para análise de remodelagem11,12.
A plataforma LOC também pode ser usada para induzir mecanotransdução de osteócitos através da deformação matricial. Um dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D foi desenvolvido para emparelhar com o LOC e aplicar uma distensão estática fora do plano para esticar as células13. Para acomodar esta carga mecânica, a profundidade do poço dentro do LOC foi aumentada. Este dispositivo de carregamento mecânico simples e de pequena escala pode ser facilmente produzido por laboratórios com experiência de engenharia limitada, e já compartilhamos desenhos dos componentes impressos em 3D13. No trabalho atual, demonstramos algumas das novas técnicas necessárias para o uso bem-sucedido do LOC. Especificamente, demonstramos fabricação de chips, semeamento celular em substratos funcionais, carga mecânica e desmontagem de chips para remodelação da quantificação. Acreditamos que a explicação dessas técnicas se beneficia de um formato visual.
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Protocol
1. Preparação da máscara de chip
NOTA: As etapas 1.1 - 1.3 só precisam ser realizadas uma vez após o recebimento inicial da máscara do chip. Garantem que a máscara não se curva durante o uso. O desenho das máscaras microfluidas foi descrito anteriormente11,14. As máscaras foram projetadas internamente e fabricadas comercialmente usando estereótografia de alta resolução(Figura 1A).
- Cubra a superfície superior da máscara com folhas plásticas para proteger esta superfície do adesivo. Fixe a máscara do chip a uma folha de acrílico igualmente dimensionada usando adesivo de spray. Aperte as peças durante a noite para permitir que o adesivo cure completamente. Depois que o adesivo estiver seco, remova o lençol plástico da parte superior da máscara.
- Conecte a parte inferior da folha de acrílico a uma caixa de nivelamento impresso em 3D(Figura Suplementar 1, Arquivos Suplementares 1-4) usando fita dupla face. Pressione firmemente para garantir uma ligação apertada.
- Sele quaisquer pequenas aberturas perto da parede destacável da caixa de nivelamento com um selante impermeável. Deixe o selante curar por 24 h.
- Limpe a superfície da máscara com 70% de etanol (EtOH). Coloque a caixa de nivelamento com a máscara de chip desejada no forno. Use um trator digital para garantir que a parte superior da máscara esteja nivelada. Ajuste os parafusos de nivelamento, se necessário.
2. Fabricação pdms
NOTA: Um design de chip de poço raso (1 mm) é usado para ensaios de atividade funcional (formação e reabsorção) e um projeto de chip de poço profundo (10 mm) é usado para estudos de carregamento mecânico. A parte inferior do poço profundo é formada pela fixação de uma membrana PDMS fina separada(Figura 1B).
- Camada da tampa (Camada 1)
- Combine 63 g de pré-polímero PDMS e 6,3 g de agente de cura (proporção 10:1) em um copo plástico. Misture bem com uma espátula de célula descartável e degas em um dessecador a vácuo por 30 min.
- Despeje lentamente a mistura na caixa de nivelamento preparada. Deixe o PDMS sentar por 30 min e depois asse a 45 °C por 18 h.
- Solte as bordas do PDMS com uma espátula de laboratório afilada e remova a folha de polímero da caixa de nivelamento.
- Corte as tampas individuais ao tamanho (70 mm x 34 mm) usando um bisturi e um modelo impresso em 3D.
- Perfurar furos de acesso através de cada tampa com um soco de biópsia (1 mm de diâmetro).
- Limpe as tampas com fita adesiva.
NOTA: Se as tampas não estiverem sendo usadas imediatamente, enrole cada uma na fita de embalagem e armazene à temperatura ambiente (RT).
- Camada de bem e microcanal (Camada 2)
- Combine o pré-polímero PDMS e o agente de cura (proporção 10:1) em um copo plástico. O design de poço raso requer 43 g de pré-polímero e 4,3 g de agente de cura, e o projeto de poço profundo requer 227 g de pré-polímero e 22,7 g de agente de cura. Misture o polímero vigorosamente e degas por 30 min.
NOTA: Isto pressupõe uma dimensão de máscara de 152,4 mm x 152,4 mm. - Despeje lentamente a mistura sobre a máscara pré-nivelada apropriada. Deixe o PDMS sentar por 30 min e depois asse a 45 °C por 18 h.
- Solte as bordas do PDMS com uma espátula de laboratório catrantes e retire cuidadosamente o polímero da máscara. Use um bisturi e um modelo impresso em 3D para cortar chips individuais.
NOTA: Para estudos de carregamento é importante que as dimensões do chip (70 x 34 mm) sejam precisas e que o poço esteja localizado no centro do chip. - Limpe a superfície do PDMS com fita adesiva.
NOTA: Se os chips não estiverem sendo usados imediatamente, enrole cada chip na fita de embalagem e armazene em RT.
- Combine o pré-polímero PDMS e o agente de cura (proporção 10:1) em um copo plástico. O design de poço raso requer 43 g de pré-polímero e 4,3 g de agente de cura, e o projeto de poço profundo requer 227 g de pré-polímero e 22,7 g de agente de cura. Misture o polímero vigorosamente e degas por 30 min.
- Membrana PDMs fina (Camada 3)
NOTA: Esta camada é usada apenas para o design de poços profundos.- Adicione 12,7 g de pré-polímero PDMS e 1,3 g de agente de cura (proporção 10:1) a um copo plástico. Misture vigorosamente e degas por 30 min.
- Despeje lentamente o polímero na caixa de nivelamento preparada e raspe completamente o copo de plástico para remover o máximo de PDMS possível.
- Use espátula celular para espalhar PDMS por toda a superfície.
NOTA: Se o polímero não for distribuído manualmente, a tensão superficial será suficiente para evitar que o polímero forme uma folha uniforme. - Deixe o PDMS sentar por 30 min e depois asse a 45 °C por 18 h.
- Solte as bordas do PDMS com uma espátula afilada e remova cuidadosamente a folha PDMS da caixa de nivelamento. Corte membranas individuais que correspondam às dimensões da camada 2.
- Meça a espessura da membrana no centro da membrana usando pinças. Descarte quaisquer membranas que estejam fora da espessura desejada (0,5 mm ± 0,1 mm).
- Limpe cuidadosamente as membranas com fita adesiva e coloque em um pedaço de filme de parafina.
NOTA: Se as membranas não estiverem sendo utilizadas imediatamente, cubra a parte superior da membrana com fita adesiva e armazene em RT.
3. Substratos da atividade funcional
NOTA: Os discos de poliestireno e os wafers ósseos devem ser anexados ao fundo dos poços que serão utilizados para culturas de osteoblasto e osteoclast, respectivamente.
- Discos de poliestireno(Figura 1C)
- Coloque fita adesiva na parte de trás de uma cultura de tecido tratada deslizamento de cobertura de poliestireno. Corte os discos circulares da lâmina usando um borer de cortiça afiado (5,4 mm de diâmetro). Submergir os discos em 70% de EtOH e sair durante a noite.
- Esfregue suavemente a superfície superior do disco com um aplicador de ponta de algodão embebido em 70% de EtOH. Certifique-se de que a borda externa do disco está completamente limpa.
- Usando dois pares de fórceps, segure o disco e remova o backup da fita adesiva. Coloque o disco tratado lado para baixo e limpe a parte traseira com um aplicador de ponta de algodão.
- Mergulhe a extremidade de madeira de um aplicador de algodão em uma mistura desgasesada de PDMS não curado e coloque uma pequena quantidade do polímero na parte inferior do poço desejado.
NOTA: O PDMS não curado pode ser armazenado a -20 °C. - Coloque o disco de poliestireno, tratado de lado para cima, no poço e pressione suavemente para baixo no disco com um cotonete. Certifique-se de que nenhum PDMS não curado entre em contato com o lado tratado do disco.
NOTA: Se o PDMS entrar em contato com a superfície tratada do disco, remova o disco do poço e repita as etapas 3.1.4 e 3.1.5 com um novo disco. - Deixe o chip sentar em uma superfície nivelada por 30 min e depois asse a 65 °C por 4 h.
- Bolachas ósseas
- Use fórceps para colocar um wafer ósseo (6 mm de diâmetro, 0,4 mm de espessura) na parte inferior de um prato de 100 mm. Segure o wafer firme com os fórceps e etch suavemente um 'X' na parte de trás do wafer com um bisturi.
NOTA: Durante o processo de imagem, o 'X' é usado para distinguir entre a parte de trás do wafer e a superfície em que as células foram semeadas. - Use a extremidade de madeira de um aplicador de ponta de algodão para adicionar uma pequena quantidade de PDMS não curado ao fundo do poço desejado. Coloque o wafer ósseo, marcado de lado para baixo, no poço e use um aplicador de ponta de algodão para pressionar o wafer para baixo.
- Deixe o chip sentar em uma superfície nivelada por 30 min e depois asse a 65 °C por 4 h.
- Use fórceps para colocar um wafer ósseo (6 mm de diâmetro, 0,4 mm de espessura) na parte inferior de um prato de 100 mm. Segure o wafer firme com os fórceps e etch suavemente um 'X' na parte de trás do wafer com um bisturi.
4. Montagem e esterilização de chips
- Ative as superfícies da camada 1 e da camada 2 com um limpador de plasma para 30 s usando uma configuração de potência de média radiofrequência (RF) (equivalente a aproximadamente 10,2 W).
- Alinhe os orifícios de acesso na camada 1 com os microcanais na camada 2 e pressione firmemente as duas camadas juntas.
- Para o design de poço profundo, repita a etapa 4.1 com a camada 2 e a camada 3. Durante o tratamento plasmático, use fita dupla face para anexar a película de parafina da camada 3 a uma superfície plana.
- Use um bisturi para cortar o excesso de material da membrana PDMS. Retire cuidadosamente a folha de filme de parafina da parte inferior do chip
- Asse o chip a 65 °C por 10 min para aumentar a força de ligação entre as camadas pDms.
- Insira pontas de distribuição em ângulo (18 Gauge, 0,5 em, 90°) nos orifícios de acesso na tampa. Segure as pontas de distribuição na tampa com um epóxi de duas partes. Use uma ponta de micropipeta para aplicar o epóxi em torno de cada ponta de distribuição.
- Depois que o epóxi tiver curado completamente, limpe a superfície do chip com 70% de EtOH e coloque em um armário de biossegurança. Execute todas as etapas subseqüentes dentro do gabinete de biossegurança.
- Conecte uma seringa de 5 mL às pontas de distribuição com tubos de silicone estéreis (1/32'' ID, ~10 cm de comprimento) e encha o chip inteiro com 70% de EtOH para pelo menos 30 s. Para o projeto de poçor-raso, administre todos os líquidos com uma bomba de seringa definida a uma taxa de fluxo de 4 mL/h. Para o projeto do poço profundo, administre todos os líquidos dispensando lentamente a seringa manualmente.
- Remova o EtOH do chip e esterilize o chip com luz UV durante a noite.
- Lave o chip 3 vezes com dH2O. Encha o chip com dH2O, retire a tubulação das pontas de distribuição e incuba por pelo menos 48 h a 37 °C.
5. Conjunto de dispositivos de carregamento mecânico
NOTA: Os processos de projeto e fabricação do dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D(Figura 2A-C)foram previamente descritos e todos os arquivos de design para componentes impressos foram previamente fornecidos13.
- Autoclave todos os componentes do dispositivo de carregamento por 30 min a 121 °C.
NOTA: Para evitar a derção dos componentes impressos, enrole cada peça individualmente em papel alumínio e coloque sobre uma superfície plana dura durante o processo de autoclaving. O hardware de metal pode ser embrulhado. Complete todas as etapas subseqüentes dentro de um gabinete de biossegurança. - Coloque uma mola de compressão ao redor do eixo da placa e insira a placa no orifício central na parte inferior da base(Figura 2D).
- Conecte o bloco de discagem à parte inferior da base usando quatro parafusos de auto-toque.
- Coloque uma segunda mola de compressão ao redor do parafuso central. Insira o parafuso no orifício em forma de hexagonal na parte inferior do mostrador e aparafusar o conjunto no orifício rosqueado no centro do bloco de discagem.
- Dane-se quatro impasses entre homens e mulheres na parte inferior da base.
- Remova a folga do dispositivo girando o mostrador no sentido anti-horário até que a parte superior da placa esteja abaixo da parte superior da base. Em seguida, gire lentamente o mostrador no sentido horário até que o topo da placa esteja nivelado com o topo da base.
6. Experimentação
NOTA: Os protocolos para experimentos de atividade funcional foram previamente fornecidos11,12.
- Estudos de carregamento (Figura 3)
- Seguindo o passo 4.9, use uma seringa de 5 mL para remover o dH2O do chip de poço profundo. Cubra a parte inferior do poço com 200 μL de 0,15 mg/mL tipo I de colágeno (CTI) em 0,02 M ácido acético por 1 h.
- Enxágüe o chip três vezes com o salino tamponado de fosfato de Dulbecco com cálcio e magnésio (DPBS++).
- Coloque o chip no porta-chip e a semente com osteócitos MLO-Y4 a uma densidade de 2 x 104 células/mL em meio alfa essencial mínimo (MEMα) suplementado com soro de bezerro de 5%, 5% de soro bovino fetal e 1% de penicilina/estreptomicina.
- Retire o tubo das pontas de distribuição e coloque o chip em um prato de cultura de poço profundo (150 mm x 25 mm). Incubar células a 37 °C e 5% CO2 por 72 h.
- Conecte tubos estéreis às pontas de distribuição e use uma seringa de 5 mL para remover o meio de cultura gasto do chip. Dispense lentamente em meio de cultura fresca para reabastecer o chip.
- Coloque o suporte do chip na inseta retangular na parte superior da base do dispositivo de carregamento. Alimente o tubo através das ranhuras localizadas na tampa do dispositivo de carregamento e fixe a tampa na base com quatro parafusos de cabeça de panela e porcas de cânume.
NOTA: Para garantir que a tampa permaneça nivelada, primeiro fixe dois parafusos que estão localizados diagonalmente um do outro antes de fixar os dois parafusos restantes. - Aplique carga nas células girando o mostrador no sentido horário até que o deslocamento de chapa desejado seja alcançado.
NOTA: O dispositivo foi projetado para que uma rotação do mostrador equivale a um deslocamento de placa de 1 mm. O campo de tensão gerado na parte superior da membrana PDMS foi previamente modelado em função do deslocamento de chapas utilizando análise de elementofinte (FEA)13. - Coloque o dispositivo de carregamento em uma caixa de ponta de micropipete P1000 vazia. Incubar as células com a carga aplicada por 15 min.
NOTA: O período de tempo de carregamento utilizado aqui serve de exemplo. Podem ser utilizados tempos de carregamento alternativos. - Após a incubação, remova a carga das células girando o mostrador no sentido anti-horário até que a placa retorne à posição inicial original. Remova a tampa do dispositivo e coloque o suporte do chip na placa de cultura do poço profundo. Incubar as células por um período de recuperação de carga pós-carga de 90 min.
NOTA: Mais uma vez, o período de tempo de recuperação utilizado aqui serve de exemplo. Tempos de recuperação alternativos podem ser usados. Para estudos de longo prazo, as células de alimentação a cada 72 horas. - Use uma seringa de 5 mL para remover o meio condicionado do chip.
NOTA: Este meio pode ser salvo e armazenado a -80 °C. - Remova o chip do suporte do chip e use uma espátula afilada para quebrar a ligação entre a tampa PDMS e a camada do poço.
NOTA: Os ensaios celulares agora podem ser realizados seguindo qualquer protocolo estabelecido para uma placa de cultura celular.
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Representative Results
A configuração de poço raso pode ser usada para analisar a atividade funcional de osteoblastos e osteoclastos. A formação óssea através de osteoblastos e reabsorção através de osteoclastos requer tempo de cultivo na ordem de várias semanas a meses. A formação óssea dos pré-osteoblastos MC3T3-E1 foi quantificada utilizando manchas de alizarina vermelha e von Kossa11,15. No dia 49, a área média da superfície manchada com vermelho alizarina foi de 10,7% ± 2,2% (erros médios ± padrão da média)11. A área de superfície média manchada com von Kossa foi de 6,4% ± 1,6%11. A Figura 4A mostra resultados típicos de formação de culturas de osteoblasto no dia 49 manchados com vermelho alizarin e von Kossa. A reabsorção óssea dos pré-osteoclastos RAW264.7 foi quantificada utilizando-se a coloração azul toluidina 11,15. No dia 30, a área média da superfície manchada com azul toluidina foi de 30,4% ± 4,5%11. A Figura 4B apresenta resultados típicos de reabsorção óssea de culturas de osteoclasto manchadas com azul toluidina no dia 30. A microscopia eletrônica de varredura foi realizada para verificar a presença de poços de reabsorção. Os resultados típicos são mostrados na Figura 4C. Esses resultados demonstram que as células dentro do dispositivo permanecem viáveis e funcionalmente ativas por pelo menos sete semanas.
Um dispositivo de carregamento impresso em 3D foi projetado e fabricado para acomodar a configuração do chip de poço profundo. Juntos, este sistema pode induzir a mecanotransdução de osteócitos esticando as células através de uma distensão estática fora do plano. A incubação de 48 h do chip descrito na etapa 4.9 provou ser um processo crítico para manter a viabilidade celular e a morfologia típica. Figura 5A mostra imagens representativas dos osteócitos MLO-Y4 a 72 h semeados em chips com e sem este período de incubação. Durante os ataques de carga, os osteócitos foram expostos a um gradiente de tensão induzido na membrana PDMS na qual as células foram semeadas (Vídeo Suplementar 1). As cepas equivalentes geradas durante esse processo foram modeladas com FEA13 e foi determinada a cepa equivalente média produzida na parte superior da membrana PDMS. A Figura 5B mostra a relação entre a tensão equivalente média e o deslocamento da chapa para valores entre 1 e 2 mm. Um mapa de calor representativo do gradiente de tensão induzida é mostrado na Figura 5C. Neste exemplo, um deslocamento de chapa de 1,5 mm gerou uma tensão equivalente média de 12,29% na parte superior da membrana. Este modelo também demonstra que as cepas induzidas perto do centro do poço são relativamente baixas e gradualmente aumentam radialmente para fora, com cepas máximas geradas diretamente acima da borda externa da placa. Após o carregamento, a viabilidade celular foi analisada com coloração de desidrogenase de lactato e o ensaio de células mortasanexados 14,16. Os resultados típicos são mostrados na Figura 5D,E,respectivamente.
Figura 1: Dispositivo microfluido. (A)Fabricar e nivelar a máscara do chip. (Esquerda) Esquema da máscara de chip de poço profundo que foi projetado internamente usando software CAD. (Meio) Imagem da máscara de chip de poço profundo que foi comercialmente impressa usando estereolitografia de alta resolução. (À direita) A máscara é colocada dentro de uma caixa de nivelamento impressa em 3D para garantir que a máscara permaneça nivelada durante a fundição da camada 2 dos chips. (B) Esboços esquemáticos dos projetos de poços rasos e poços profundos do dispositivo. (Topo) O desenho de poçor raso foi utilizado para análise da atividade funcional (formação e reabsorção) de osteoblastos e osteoclastos. Esta configuração é formada a partir de duas camadas PDMS. Um substrato de atividade funcional foi fixado na parte inferior da cultura bem antes de selar as camadas juntas. Os discos de poliestireno e wafers ósseos foram utilizados para culturas de osteoblasto e osteoclasto, respectivamente. (Embaixo) O design de poço profundo foi usado para aplicar carga mecânica em osteócitos. Esta configuração consiste em três camadas PDMS. O fundo do poço de cultura é formado pela membrana PDMS deformável (camada 3). (C) Etapas de fabricação do disco de poliestireno utilizado para culturas de osteoblasto. A parte de trás de uma cultura de tecido tratada enfureceu foi marcada com fita adesiva. Discos individuais foram cortados com um borer de cortiça. O disco foi limpo com etanol e um cotonete. O backup da fita foi removido e o disco foi anexado à parte inferior da cultura PDMS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Projeto e montagem do dispositivo de carregamento mecânico. (A) Imagem do dispositivo de carregamento mecânico montado. Quando juntamente com o design profundo do chip PDMS, o dispositivo de carregamento estica as células aplicando uma distensão fora do plano a uma membrana deformável. (B)Visão explodida do dispositivo. Todas as peças mostradas em azul foram impressas em 3D com um filamento de ácido poliláctico resistente ao calor. Todo o hardware é de aço inoxidável. (C) Mecanismo de tomada de parafuso do dispositivo de carga. A rotação do parafuso central (laranja) empurra a chapa (verde) para cima através da base. O movimento ascendente da chapa deforma a membrana PDMS do chip de poço profundo no qual as células foram semeadas. (D)Processo de montagem do dispositivo de carga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Experimento de carga mecânica. Todos os líquidos foram administrados e removidos do chip usando uma seringa de 5 mL conectada ao tubo de acesso. Um passo crítico nesse processo é a incubação de 48 h com água destilada estéril antes da semeação celular. Sem essa incubação as células apresentaram baixa viabilidade e morfologia atípica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados típicos da atividade funcional. (A) Resultados típicos de formação manchados com vermelho alizarin (esquerda) e von Kossa (direita) de culturas de osteoblasto MC3T3-E1 induzidas no dia 49. Imagens inteiras do disco medem 5,4 mm de diâmetro. (B) A reabsorção típica de osteoclastos resulta de preosteoclastos RAW264.7 induzidos pelo ativador receptor do ligante kappa-B do fator nuclear (RANKL). As células foram cultivadas em wafers ósseos e manchadas com toluidina azul no dia 30. (C) Imagens típicas de microscopia eletrônica de varredura verificando a presença de poços de reabsorção em wafers ósseos. A barra de escala na imagem superior representa 200 μm e a barra de escala na imagem inferior representa 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeitos da tensão mecanicamente induzida sobre os teócitos. (A) Imagens de osteócitos MLO-Y4 a 72 h no chip de poço profundo fabricado com (esquerda) e sem (direita) uma incubação de 48 h com água destilada antes da semeada celular. (B) A análise de elementos finitos foi utilizada para modelar a tensão equivalente média gerada na parte superior da membrana PDMS deformável com base no deslocamento da placa do dispositivo de carregamento. São mostrados resultados de deslocamentos entre 1,0 mm e 2,0 mm. (C) Mapa térmico do gradiente de tensão modelado induzido na membrana PDMS para um deslocamento de chapa de 1,5 mm.(D) Resultados típicos de uma mancha de desidrogenase de lactato de osteócitos induzidos por drogas que foram esticadas usando um deslocamento de 1,5 mm de plaqueta. Observa-se uma coloração celular mais leve perto da borda externa do poço, que corresponde à localização de valores de maior tensão indicativode dano celular e/ou morte. (E) Resultados representativos da citometria de fluxo da apoptose induzida por carga indicada por um ensaio de células mortas anexados em V. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: caixa de nivelamento impresso em 3D com parede destacável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo complementar 1: Nivelamento da caixa CAD arquivo 1. Clique aqui para ver este arquivo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
Arquivo Suplementar 2: Nivelamento da caixa CAD arquivo 2. Clique aqui para ver este arquivo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
Arquivo Suplementar 3: Nivelamento da caixa CAD arquivo 3. Clique aqui para ver este arquivo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
Arquivo suplementar 4: Lista de hardware da caixa de nivelamento. Clique aqui para ver este arquivo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
Vídeo suplementar 1: Dispositivo de carregamento mecânico. Clique aqui para ver este arquivo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
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Discussion
Este artigo descreve as bases para a fabricação de uma plataforma LOC remodelante óssea para cultivar osteócitos, osteoclastos e osteoblastos. Alterando a profundidade e o tamanho do poço dentro do chip, várias configurações foram desenvolvidas para estimular osteócitos com carga mecânica e quantificar os resultados funcionais da remodelagem óssea(Figura 1B).
Durante a montagem do chip, a otimização do protocolo de oxidação plasmática foi fundamental para eliminar as preocupações com vazamentos. Descobrimos que expor superfícies PDMS a 30 s de plasma de oxigênio gerado usando uma configuração média de energia RF (passo 4.1), igual a aproximadamente 10,2 W, foi suficiente para criar uma forte ligação entre as camadas. A integridade da ligação diminuiu quando foram utilizados tempos de exposição mais longos ou uma configuração de alimentação rf mais alta. Isso é consistente com relatórios anteriores que observaram uma superexposição do PDMS ao plasma de oxigênio aumentou a rugosidade da superfície e reduziu a adesividade17,18.
Além disso, a manutenção da alta viabilidade celular e da morfologia celular típica dependia criticamente do processo de cura do PDMS. O polímero PDMS consiste em oligômeros dimetilsiloxanos cruzados. Este processo de crosslinking depende tanto do tempo quanto da temperatura; no entanto, mesmo com a cura extensiva do polímero não consegue polimerizar totalmente19. Os oligômeros restantes foram mostrados para lixiviar do polímero a granel em meio de cultura celular circundante e foram até encontrados nas membranas das células cultivadas na superfície do polímero20. Vários grupos relataram efeitos citotóxicos de oligômeros PDMS não cruzados21,,22,23. Para resolver essa preocupação em nosso sistema, otimizamos o processo de cura do PDMS. Embora a taxa de cura para PDMS seja dependente da temperatura, as propriedades materiais de nossas máscaras de chip restringiram nossa temperatura de cura a 45 °C. Como tal, determinamos que os chips devem ser assados por um mínimo de 18 horas. Além disso, descobrimos que a incubação de chips com dH2O por pelo menos 48 h antes da semeação celular (etapa 4.9) foi necessária para reduzir os efeitos citotóxicos. Figura 5A mostra osteócitos MLO-Y4 cultivados em chips com e sem esse período de incubação.
A configuração de poço profundo, que foi projetada para acomodar a aplicação de carga mecânica, exige que o chip seja fabricado a partir de três camadas separadas. Ao contrário da configuração de poço raso, fabricar as porções de poço e membrana como uma única peça para a configuração de poços profundos fez com que a membrana dobrasse. Isso pode ser devido a uma diferença nas taxas de cura entre as porções grossas e finas do chip. Para superar esse problema, a camada de membrana foi construída separadamente e ligada à parte inferior do chip após o processo de cura. Para gerar uma camada de membrana separada com espessura uniforme, é fundamental que a caixa de nivelamento esteja completamente nivelada antes de adicionar o PDMS (etapa 1.4). Como tal, o uso de um trator digital é recomendado para garantir um alto grau de precisão. Além disso, durante a etapa 2.3.2, é fundamental remover o máximo de PDMS do copo de plástico possível. Inconsistências nesta etapa levarão a altos desvios nas espessuras das membranas e, em última instância, a desvios elevados na variedade média de substrato usada para induzir a mecanotransdução de osteócitos.
Nossa plataforma de remodelagem óssea fornece um alto grau de versatilidade. Este sistema pode ser usado para investigar uma variedade de fatores que regulam a remodelagem óssea, como mecanotransdução induzida por carga, sinalização multicelular, inflamação ou efeitos medicamentosos. Por exemplo, o sistema foi utilizado para analisar os efeitos combinados da carga mecânica e inflamação na remodelação óssea em um ambiente induzido por drogas14. A carga mecânica foi aplicada em osteócitos tratados com bisfosfonato. A análise proteica do meio condicionado revelou um aumento significativo nos níveis de leptina e osteonectina e uma diminuição significativa nos níveis de CCL21 e CD36 quando comparados aos osteócitos que não foram carregados mecanicamente14.
Os protocolos aqui apresentados fornecem uma base para a cultura de cada tipo de célula dentro do LOC, bem como métodos para induzir carga mecânica e quantificar a atividade funcional. Seguindo em frente, estamos trabalhando para um verdadeiro órgão ósseo em um chip. Além disso, acreditamos que o uso do nosso sistema para desenvolver sistemas de modelagem matemática poderia melhorar muito nossa compreensão dos complexos processos de sinalização multicelular que regulam a remodelagem óssea24,25.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência sob o Título de Fundação Nº 1060990 e EBMS 1700299. Além disso, este material é baseado no trabalho apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação da Fundação Nacional de Ciência sob bolsa nº (2018250692). Quaisquer opiniões, conclusões, conclusões ou recomendações expressas neste material são as dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
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