Платформа Lab-On-A-Chip для стимулирования остеоцитной механотрансдукции и анализа функциональных результатов ремоделирования костей
Summary
Здесь мы представляем протоколы для анализа костной ремоделирования в лаборатории на чипе платформы. 3D печатных механических погрузочных устройств может быть в паре с платформой, чтобы вызвать остеоцит механотрансдукции путем деформации клеточной матрицы. Платформа также может быть использована для количественной оценки костной ремоделирования функциональных исходов остеокластов и остеобластов (резорбция/образование).
Abstract
Реконструкция костей является жестко регулируемым процессом, который необходим для роста и ремонта скелета, а также адаптации к изменениям в механической среде. В ходе этого процесса механочувствительные остеоциты регулируют противоположные реакции между катаболическими остеокластами и анаболическими остеобластами. Чтобы лучше понять очень сложные сигнальные пути, которые регулируют этот процесс, наша лаборатория разработала фундаментальную платформу лаборатории на чипе (LOC) для анализа функциональных результатов (формирование и резорбция) ремоделирования костей в рамках мелкомасштабной системы. Поскольку ремоделирование костей является длительным процессом, который происходит на порядок от нескольких недель до нескольких месяцев, мы разработали долгосрочные протоколы культивирования клеток в системе. Остеобласты и остеокласты выращивались на субстратах функциональной активности в пределах LOC и поддерживались до семи недель. После этого, чипы были разобраны, чтобы обеспечить количественную оценку формирования костей и резорбции. Кроме того, мы разработали 3D-печатное механическое устройство погрузки, которое сочетается с платформой LOC и может быть использовано для индуцирования остеоцитов механотрансдукции путем деформации клеточной матрицы. Мы оптимизировали протоколы культивирования клеток для остеоцитов, остеобластов и остеокластов на платформе LOC и рассмотрели проблемы стерильности и цитотоксичности. Здесь мы представляем протоколы для изготовления и стерилизации LOC, посева ячеек на функциональных субстратов, вызывая механическую нагрузку, и разборки LOC для количественной оценки конечных результатов. Мы считаем, что эти методы закладывают основу для разработки истинного органа-на-чип для костной ремоделирования.
Introduction
Кость является высокодинамической тканью, которая требует сложной координации между тремя основными типами клеток: остеоцитами, остеобластами и остеокластастами. Многоклеточные взаимодействия между этими клетками отвечают за потерю костной массы, которая происходит во время паралича и долгосрочной неподвижности, а также за формирование костей, которое происходит в ответ на рост и физические упражнения. Остеоциты, наиболее распространенный тип костных клеток, очень чувствительны к механическим раздражителям, применяемым к кости. Механическая стимуляция изменяет метаболическую активность остеоцитов и приводит к увеличению ключевых сигнальных молекул1,,2. Благодаря этому процессу, известному как механотрансдукция, остеоциты могут непосредственно координировать деятельность остеобластов (костяных образующих клеток) и остеокластов (клетки костного resorbing). Поддержание костного гомеостаза требует жесткой регуляции между формированием костей и скоростью резорбции костей; однако, сбои в этом процессе могут привести к заболеваниям, таким как остеопороз или остеопетроз.
Сложность взаимодействия между этими тремя типами клеток хорошо поддается исследованию с использованием микрофлюидных и лабораторных технологий (LOC). С этой целью наша лаборатория недавно установила доказательство концепции платформы LOC для анализа резорбции костей и формирования (функциональные результаты) в процессе ремоделирования костей. Платформа может быть использована для изучения клеточных взаимодействий, измененных сред погрузки и скрининга наркотиков. В последние годы были разработаны различные микрофлюидные устройства для исследования молекулярных сигнальных путей, которые регулируют ремоделирование костей; однако, многие из этих систем количественно ремоделирования через косвенные маркеры, которые свидетельствуют о функциональной деятельности3,4,,5,,6,7. Преимущество нашей системы в том, что она может быть использована для прямой количественной оценки функциональных результатов. Реконструкция костей является долгосрочным процессом. Таким образом, прямая количественная оценка резорбции и образования костей требует культивирования системы, которая может поддерживаться в течение как минимум нескольких недель домесяцев8,9,,10,11. Таким образом, при разработке платформы LOC, мы установили долгосрочные протоколы культивирования, необходимые для формирования и резорбции и поддерживали клетки в системе до семи недель11. Кроме того, мы включили соответствующие культивирование субстратов для обоих типов клеток в платформу; остеокласты культивировались непосредственно на кости, а остеобласты, которые, как известно, являются пластиковыми приверженцами, культивировались на полистироловых дисках. Далее мы рассмотрели вопросы, касающиеся бесплодия, долгосрочной цитотоксичности и разборки чипов для ремоделирования анализа11,12.
Платформа LOC также может быть использована для индуцирования остеоцитов механотрансдукции через матричную деформацию. 3D печатных механических погрузочных устройств был разработан в паре с LOC и применить статические из плоскости distention растянуть клетки13. Для учета этой механической нагрузки была увеличена глубина скважины в пределах ЛОК. Это небольшое, простое механическое устройство погрузки может быть легко произведено лабораториями с ограниченным инженерным опытом, и мы ранее делились чертежами 3D печатных компонентов13. В текущей работе мы демонстрируем некоторые из новых методов, необходимых для успешного использования LOC. В частности, мы демонстрируем изготовление чипов, посев клеток на функциональных субстратах, механическую загрузку и разборку чипов для ремоделирования количественной оценки. Мы считаем, что объяснение этих методов выгоду от визуального формата.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описаны основы для изготовления кости ремоделирования LOC платформы для культивирования остеоцитов, остеокластов и остеобластов. Изменяя глубину и размер скважины в чипе, были разработаны несколько конфигураций для стимулирования остеоцитов с механической нагрузкой и к?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом при Гранте Nos. (CBET 1060990 и EBMS 1700299). Кроме того, этот материал основан на работе, поддерживаемой Программой стипендий Национального научного фонда по стипендии в рамках Гранта No (2018250692). Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, являются мнениями авторов и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда.
Materials
| Acrylic sheet | Optix | — | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | — | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | — | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | — | — | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | — | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | — | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. . Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
