Summary
Här presenterar vi protokoll för analys av benremodeling inom en lab-on-a-chip plattform. En 3D-tryckt mekanisk lastningsenhet kan paras ihop med plattformen för att inducera osteocyte mekanostransduktion genom att deformera cellmatrisen. Plattformen kan också användas för att kvantifiera ben remodeling funktionella resultat från osteoklaster och osteoblaster (resorption /bildning).
Abstract
Benremodeling är en hårt reglerad process som krävs för skeletttillväxt och reparation samt anpassning till förändringar i den mekaniska miljön. Under denna process, mekanokänsliga osteocyter reglera motsatta svar mellan katabola osteoklaster och anabola osteoblaster. För att bättre förstå de mycket invecklade signalvägarna som reglerar denna process har vårt labb utvecklat en grundläggande lab-on-a-chip (LOC) plattform för att analysera funktionella resultat (bildning och resorption) av ben remodeling inom ett småskaligt system. Som ben remodeling är en lång process som sker i ordning veckor till månader, utvecklade vi långsiktiga cell odling protokoll inom systemet. Osteoblasts och osteoklaster odlades på funktionella verksamhet substrat inom LOC och underhålls i upp till sju veckor. Efteråt demonterades chips för att möjliggöra kvantifiering av benbildning och resorption. Dessutom har vi utformat en 3D-tryckt mekanisk lastningsenhet som parar ihop med LOC-plattformen och kan användas för att inducera osteocyte mekanotransduktion genom att deformera cellmatrisen. Vi har optimerat cellodlingsprotokoll för osteocyter, osteoblaster och osteoklaster inom LOC-plattformen och har tagit upp frågor om sterilitet och cytotoxicitet. Här presenterar vi protokollen för att tillverka och sterilisera LOC, sådd celler på funktionella substrat, inducera mekanisk belastning och demontering loc att kvantifiera slutpunkt resultat. Vi tror att dessa tekniker lägga grunden för att utveckla en sann orgel-på-ett-chip för ben ombyggnad.
Introduction
Ben är en mycket dynamisk vävnad som kräver invecklad samordning mellan de tre stora celltyperna: osteocyter, osteoblaster och osteoklaster. Flercelliga interaktioner mellan dessa celler är ansvariga för benförlust som uppstår under förlamning och långsiktig orörlighet och för benbildning som uppstår som svar på tillväxt och motion. Osteocyter, den vanligaste bencellstypen, är mycket känsliga för mekaniska stimuli som appliceras på benet. Mekanisk stimulering förändrar osteocyte metabolisk aktivitet och leder till en ökning av viktiga signalering molekyler1,2. Genom denna process, känd som mekanotransduktion, kan osteocyter direkt samordna verksamheten i osteoblaster (benbildande celler) och osteoklaster (benresorbing celler). Att upprätthålla ben homeostas kräver en snäv reglering mellan benbildning och benresorption priser; störningar i denna process kan dock resultera i sjukdomstillstånd som osteoporos eller osteopetrosis.
Komplexiteten i interaktioner mellan dessa tre celltyper lämpar sig väl för undersökning med hjälp av mikrofluidiska och lab-on-a-chip (LOC) teknik. För detta ändamål har vårt labb nyligen etablerat proof of concept av en LOC plattform för att analysera ben resorption och bildning (funktionella resultat) i ben remodeling processen. Plattformen kan användas för studier av cellulära interaktioner, förändrade lastningsmiljöer och prövningsläkemedelsscreening. Under de senaste åren har olika mikrofluidiska enheter utvecklats för att undersöka de molekylära signalvägarna som reglerar benremodeling; Många av dessa system kvantifierar dock ombyggnad genom indirekta markörer som tyder på funktionell aktivitet3,,4,,5,,6,7. En fördel med vårt system är att det kan användas för direkt kvantifiering av funktionella resultat. Ben remodeling är en långsiktig process. Som sådan kräver direkt kvantifiering av benresorption och bildning ett odlingssystem som kan upprätthållas i minst flera veckor till månader8,9,10,11. Således, när vi utvecklar LOC-plattformen, etablerade vi långsiktiga odlingsprotokoll som är nödvändiga för bildning och resorption och har underhållit celler i systemet i upp till sju veckor11. Dessutom införlivade vi lämpliga odlingssubstrat för båda celltyperna i plattformen; Osteoklaster odlades direkt på ben, och osteoblaster, som är kända för att vara plast anhängare, odlades på polystyren skivor. Vidare tog vi upp frågor som rör sterilitet, långsiktig cytotoxicitet och spånmontering för ombyggnad analys11,12.
LOC-plattformen kan också användas för att inducera osteocyte mekanotransduktion genom matrisdeformation. En 3D-tryckt mekanisk lastningsanordning har utvecklats för att paras ihop med LOC och applicera en statisk ut ur plandistention för att sträcka cellerna13. För att rymma denna mekaniska belastning ökades brunnens djup inom LOC. Denna småskaliga, enkla mekaniska lastningsanordning kan enkelt produceras av laboratorier med begränsad teknisk erfarenhet, och vi har tidigare delat ritningar av 3D-tryckta komponenter13. I det aktuella arbetet visar vi några av de nya tekniker som krävs för en framgångsrik användning av LOC. Specifikt visar vi chip tillverkning, cell sådd på funktionella substrat, mekanisk lastning och chip demontering för ombyggnad kvantifiering. Vi tror att förklaringen av dessa tekniker dra nytta av ett visuellt format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av spånmask
OBS: Steg 1.1 - 1.3 behöver endast utföras en gång vid första mottagandet av spånmasken. De ser till att masken inte bugar under användning. Utformningen av mikrofluidiska masker beskrevs tidigare11,14. Masker utformades internt och tillverkades kommersiellt med hjälp av högupplöst stereolitografi (figur 1A).
- Täck maskens övre yta med plastfolie för att skydda denna yta från lim. Fäst spånmasken på ett lika stort akrylplåt med spraylim. Kläm ihop bitarna över natten så att limmet kan botas helt. När limmet är torrt, ta bort plastfolie från toppen av masken.
- Fäst botten av akrylarket på en 3D-tryckt utjämningslåda(tilläggsfigur 1, tilläggsfiler 1-4)med dubbelsidig tejp. Tryck ordentligt för att säkerställa en tät bindning.
- Täta alla små öppningar nära nivelleringsboxens avtagbara vägg med ett vattentätt tätningsmedel. Låt tätningsmedlet härda i 24 timmar.
- Rengör maskens yta med 70% etanol (EtOH). Placera nivelleringslådan med önskad spånmask i ugnen. Använd en digital gradskiva för att säkerställa att maskens överkant är jämn. Justera nivelleringsskruvarna om det behövs.
2. PDMS tillverkning
OBS: En grundbrunn (1 mm) chipdesign används för funktionella aktivitetsanalyser (bildning och resorption) och en djupbrunnskonstruktion (10 mm) används för mekaniska belastningsstudier. Botten av den djupa brunnen bildas genom att fästa ett separat tunt PDMS-membran (figur 1B).
- Locklager (lager 1)
- Kombinera 63 g PDMS prepolymer och 6,3 g härdningsmedel (10:1 förhållande) i en plastmugg. Blanda noggrant med en disponibel cellspatel och degas i en vakuumsickator i 30 min.
- Häll långsamt blandningen i den förberedda utjämningslådan. Låt PDMS sitta i 30 min och sedan grädda i 45 °C i 18 timmar.
- Lossa kanterna på PDMS med en avsmalnande laboratoriespatel och ta bort polymerarket från nivelleringslådan.
- Kapa enskilda lock till storlek (70 mm x 34 mm) med hjälp av en skalpell och en 3D-tryckt mall.
- Stansåtkomst hål genom varje lock med en biopsi punch (1 mm diameter).
- Ytrengör locken med förpackningstejp.
OBS: Om locken inte används omedelbart, linda in var och en i förpackningstejp och förvara i rumstemperatur (RT).
- Brunns- och mikrokanalskikt (lager 2)
- Kombinera PDMS prepolymer och härdningsmedel (10:1 förhållande) i en plastmugg. Den grunda brunnsdesignen kräver 43 g prepolymer och 4,3 g härdningsmedel, och den djupa designen kräver 227 g prepolymer och 22,7 g härdningsmedel. Blanda polymeren kraftigt och degas i 30 min.
OBS: Detta förutsätter en maskdimension på 152,4 mm x 152,4 mm. - Häll långsamt blandningen över lämplig förstyrt mask. Låt PDMS sitta i 30 min och sedan grädda i 45 °C i 18 timmar.
- Lossa kanterna på PDMS med en avsmalnande laboratoriespatel och skala försiktigt polymeren bort från masken. Använd en skalpell och 3D-tryckt mall för att skära ut enskilda marker.
OBS: För lastningsstudier är det viktigt att spånmåtten (70 x 34 mm) är exakta och att brunnen ligger i mitten av chippet. - Ytan rengör PDMS med förpackningstejp.
OBS: Om chipsen inte används omedelbart, linda in varje chip i förpackningstejp och förvara på RT.
- Kombinera PDMS prepolymer och härdningsmedel (10:1 förhållande) i en plastmugg. Den grunda brunnsdesignen kräver 43 g prepolymer och 4,3 g härdningsmedel, och den djupa designen kräver 227 g prepolymer och 22,7 g härdningsmedel. Blanda polymeren kraftigt och degas i 30 min.
- Tunt PDMS-membran (lager 3)
OBS: Detta lager används endast för djupbrunn design.- Tillsätt 12,7 g PDMS prepolymer och 1,3 g härdningsmedel (10:1 förhållande) till en plastkopp. Blanda kraftigt och degas i 30 min.
- Häll långsamt polymer i beredd nivelleringslåda och skrapa plastmuggen noggrant för att ta bort så mycket PDMS som möjligt.
- Använd cellspatel för att sprida PDMS över hela ytan.
OBS: Om polymeren inte sprids ut manuellt räcker ytspänningen för att förhindra att polymeren bildar ett enhetligt ark. - Låt PDMS sitta i 30 min och sedan grädda i 45 °C i 18 timmar.
- Lossa kanterna på PDMS med en avsmalnande spatel och ta försiktigt bort PDMS-arket från utjämningslådan. Skär enskilda membran som matchar måtten på skikt 2.
- Mät membrantjockleken i mitten av membranet med hjälp av bromsok. Kassera alla membran som ligger utanför önskad tjocklek (0,5 mm ± 0,1 mm).
- Rengör försiktigt membran med förpackningstejp och placera på en bit paraffinfilm.
OBS: Om membranen inte används omedelbart, täck toppen av membranet med förpackningstejp och förvara på RT.
3. Substrat för funktionell aktivitet
Polystyren skivor och benrån måste fästas på botten av brunnar som kommer att användas för osteoblaster respektive osteoklasterkulturer.
- Polystyrenskivor (figur 1C)
- Placera maskeringstejp på baksidan av en vävnadskultur som behandlats polystyren coverslip. Kapa runda skivor från täcket med en slipad korkborare (5,4 mm diameter). Sänk ner skivorna i 70% EtOH och lämna över natten.
- Skrubba försiktigt skivans övre yta med en bomullsspetsad applikator indränkt i 70% EtOH. Se till att skivans ytterkant rengörs ordentligt.
- Med två par pincett håller du skivan och tar bort maskeringstejpens baksida. Placera skivan behandlas sida ner och rengör baksidan med en bomullsspets applikator.
- Doppa träänden av en bomullsspetsad applikator i en avgasad blandning av ohärdat PDMS och placera en liten mängd av polymeren på botten av önskad brunn.
OBS: Återstående oskyddade PDMS kan lagras vid -20 °C. - Placera polystyrenskivan, den behandlade sidan uppåt, i brunnen och tryck försiktigt ner skivan med en bomullspinne. Se till att ingen ohärdad PDMS kommer i kontakt med den behandlade sidan av skivan.
OBS: Om PDMS kommer i kontakt med skivans behandlade yta tar du bort skivan från brunnen och upprepar steg 3.1.4 och 3.1.5 med en ny skiva. - Låt chippet sitta på en plan yta i 30 min och grädda sedan vid 65 °C i 4 timmar.
- Benrån
- Använd pincett för att placera ett benrån (6 mm diameter, 0,4 mm tjock) på undersidan av en 100 mm skål. Håll wafer stadigt med pincetten och etsa försiktigt ett "X" på baksidan av rånet med en skalpell.
OBS: Under bildtagningsprocessen används "X" för att skilja mellan baksidan av rånet och ytan på vilken cellerna såddes. - Använd träänden av en bomullsspetsapplikator för att lägga till en liten mängd ohärdade PDMS till botten av önskad brunn. Placera benråspen, markerad sida nedåt, i brunnen och använd en bomullsspetsapplikator för att trycka ner rånet.
- Låt chippet sitta på en plan yta i 30 min och grädda sedan vid 65 °C i 4 timmar.
- Använd pincett för att placera ett benrån (6 mm diameter, 0,4 mm tjock) på undersidan av en 100 mm skål. Håll wafer stadigt med pincetten och etsa försiktigt ett "X" på baksidan av rånet med en skalpell.
4. Spånmontering och sterilisering
- Aktivera ytorna på skikt 1 och skikt 2 med ett plasmarengöringsmedel för 30 s med hjälp av en medelstor radiofrekvensinställning (RF) (motsvarande cirka 10,2 W).
- Rikta in åtkomsthålen i lager 1 mot mikrokanalerna i lager 2 och tryck ihop de två skikten ordentligt.
- För den djupa designen, upprepa steg 4.1 med lager 2 och lager 3. Under plasmabehandlingen, använd dubbelsidig tejp för att fästa paraffinfilmen i skikt 3 till en plan yta.
- Använd en skalpell för att trimma bort överflödigt material från PDMS-membranet. Dra försiktigt bort papegonsk film från botten av chipet
- Grädda chippet vid 65 °C i 10 min för att öka bindningsstyrkan mellan PDMS-skikten.
- Sätt i vinklade dispenseringsspetsar (18 gauge, 0,5 in, 90°) i åtkomsthålen i locket. Fäst dispenseringsspetsarna på locket med en epoxi i två delar. Använd en mikropipette spets för att tillämpa epoxi runt varje dispensering spets.
- När epoxiet är helt härdat, ytrengör chipet med 70% EtOH och placerar i ett biosäkerhetsskåp. Utför alla efterföljande steg i biosäkerhetsskåpet.
- Anslut en 5 ml-spruta till dispenseringsspetsarna med steril silikonslang (1/32'' ID, ~10 cm i längd) och fyll hela chipet med 70% EtOH i minst 30 s. För den grunda brunnskonstruktionen, administrera alla vätskor med en sprutpump inställd på ett flöde på 4 ml/h. För den djupa designen, administrera alla vätskor genom att långsamt dosera sprutan för hand.
- Ta bort EtOH från chipet och sterilisera chipet med UV-ljus över natten.
- Tvätta chipet 3 gånger med dH2O. Fyll chippet med dH2O, ta bort slangen från dispenseringsspetsarna och inkubera i minst 48 timmar vid 37 °C.
5. Montering av mekanisk lastningsanordning
OBS: Design- och tillverkningsprocesserna för den 3D-tryckta mekaniska lastningsanordningen(figur 2A-C)har tidigare beskrivits och alla designfiler för tryckta komponenter har tidigare tillhandahållits13.
- Autoklav alla komponenter i lastenheten i 30 min vid 121 °C.
OBS: För att undvika skevhet av tryckta komponenter, linda varje bit individuellt i folie och placera på en hård plan yta under autoklaveringsprocessen. Metallhårdvara kan slås ihop. Utför alla efterföljande steg i ett biosäkerhetsskåp. - Placera en kompressionsfjäder runt pläterens axel och för in skivan i det centrala hålet på botten av basen (figur 2D).
- Fäst ratten blocket på botten av basen med hjälp av fyra självgängande skruvar.
- Placera en andra kompressionsfjäder runt den centrala skruven. Sätt in skruven i det sexkantiga hålet i botten av ratten och skruva fast enheten i det gängade hålet i mitten av rattblocket.
- Skruva fyra manliga-kvinnliga dödlägen i botten av basen.
- Ta bort slack från enheten genom att vrida ratten moturs tills toppen av skivan är under toppen av basen. Vrid sedan långsamt ratten medurs tills toppen av skivan är i nivå med toppen av basen.
6. Experiment
PROTOKOLL för funktionella aktivitetsexperiment tillhandahölls tidigare11,12.
- Lastningsstudier (figur 3)
- Efter steg 4.9, använd en 5 ml spruta för att ta bort dH2O från djupbrunnschipet. Täck botten av brunnen med 200 μL av 0,15 mg/ml typ I kollagen (CTI) i 0,02 M ättiksyra för 1 h.
- Skölj chipet tre gånger med Dulbeccos fosfatbuffrade koksaltlösning med kalcium och magnesium (DPBS++).
- Placera chip i spånhållaren och utsäde med MLO-Y4 osteocyter vid en densitet av 2 x 104 celler/ml i minsta väsentliga alfa medium (MEMα) kompletteras med 5% kalv serum, 5% fetala nötkreatur serum, och 1% penicillin/streptomycin.
- Ta bort slangen från dispenseringsspetsarna och placera chippet i en djupbrunnsodlingsskål (150 mm x 25 mm). Inkubera celler vid 37 °C och 5% CO2 för 72 timmar.
- Fäst sterila slangar på dispenseringsspetsarna och använd en 5 ml-spruta för att ta bort använt odlingsmedium från chipet. Dispensera långsamt i färskt odlingsmedium för att fylla på chippet.
- Placera spånhållaren i den rektangulära infälldheten ovanpå lastenhetens bas. Mata slangen genom slitsarna som sitter på lastanordningens lock och fäst locket på basen med fyra panhuvudskruvar och hexmuttrar.
OBS: För att säkerställa att locket förblir plant, först säkra två skruvar som är placerade diagonalt från varandra innan de återstående två skruvarna säkras. - Belasta cellerna genom att vrida ratten medurs tills önskad plåtförskjutning har uppnåtts.
OBS: Enheten är utformad så att en rotation av ratten motsvarar en plåtförskjutning på 1 mm. Stamfältet som genererades på toppen av PDMS-membranet modellerades tidigare som en funktion av plåtförskjutning med finit elementanalys (FEA)13. - Placera lastenheten i en tom P1000 micropipette spets låda. Inkubera cellerna med den applicerade belastningen i 15 min.
Den laddningstid som används här fungerar som ett exempel. Alternativa laddningstider kan användas. - Efter inkubationen tar du bort belastningen från cellerna genom att vrida ratten moturs tills skivan återgår till det ursprungliga utgångsläget. Ta bort locket från enheten och placera spånhållaren i den djupa kulturplattan. Inkubera cellerna under en 90-min återhämtningsperiod efter belastning.
Obs: Återigen fungerar återhämtningsperioden som används här som ett exempel. Alternativa återställningstider kan användas. För långtidsstudier, mata celler var 72 h. - Använd en 5 ml-spruta för att ta bort det konditionerade mediet från chipet.
OBS: Detta medium kan sparas och lagras vid -80 °C. - Ta bort chipet från spånhållaren och använd en avsmalnande spatel för att bryta bindningen mellan PDMS-locket och brunnsskiktet.
Cellulära analyser kan nu utföras enligt alla protokoll som fastställts för en cellodlingsplatta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den grunda brunnskonfigurationen kan användas för att analysera funktionell aktivitet hos osteoblaster och osteoklaster. Benbildning via osteoblaster och resorption via osteoklaster kräver odlingstider i ordningen på flera veckor till månader. Benbildning från MC3T3-E1 pre-osteoblasts kvantifierades med alizarin röd och von Kossa fläckar11,15. Dag 49 var den genomsnittliga ytan som färgats med alizarinrött 10,7 % ± 2,2 % (medelvärdet ± standardfel i medelvärdet)11. Den genomsnittliga ytan färgas med von Kossa var 6,4% ± 1,6%11. Figur 4A visar typiska bildningsresultat från osteoblastkulturer på dag 49 färgade med alizarin röd och von Kossa. Benresorption från RAW264.7 pre-osteoclasts kvantifierades med toluidin blå färgning 11,15. Dag 30 var den genomsnittliga ytan som färgats med toluidinblå 30,4 % ± 4,5 %11. Figur 4B visar typiska ben resorption resultat från osteoklalast kulturer färgas med toluidin blå på dag 30. Scanning elektronmikroskopi utfördes för att kontrollera förekomsten av resorption gropar. Typiska resultat visas i figur 4C. Dessa resultat visar att celler i enheten förblir livskraftiga och funktionellt aktiva i minst sju veckor.
En 3D-tryckt lastningsenhet har utformats och tillverkats för att rymma den djupa spånkonfigurationen. Tillsammans kan detta system framkalla osteocyte mekanotransduktion genom att sträcka cellerna via en statisk out-of-plane distention. 48 h inkubation av chipet som beskrivs i steg 4.9 har visat sig vara en kritisk process för att upprätthålla cellens livskraft och typisk morfologi. Figur 5A visar representativa bilder av MLO-Y4 osteocyter vid 72 h sådd i chips med och utan denna inkubationstid. Under anfall av lastning, osteocyter utsattes för en stam gradient inducerad på PDMS membran där cellerna var sådd (Kompletterande Video 1). De motsvarande stammar som genererades under denna process modellerades med FEA13 och den genomsnittliga motsvarande stam som produceras på toppen av PDMS membranet fastställdes. Figur 5B visar förhållandet mellan genomsnittlig likvärdig stam och plåtförskjutning för värden mellan 1 och 2 mm. En representativ värmekarta över den inducerade stamgradienten visas i figur 5C. I det här exemplet genererade en plåtförskjutning på 1,5 mm en genomsnittlig motsvarande stam på 12,29% på membranets ovankant. Denna modell visar också att de stammar som induceras nära mitten av brunnen är relativt låga och gradvis öka radiellt utåt, med maximala stammar som genereras direkt ovanför den yttre kanten av pläter. Efter lastning analyserades cellens livskraft med laktatdehydrogenasfärgning och annexin V- och dödcellsanalys14,16. Typiska resultat visas i figur 5D,E, respektive.
Bild 1: Mikrofluidisk anordning. (A)Tillverkning och utjämning av spånmasken. -Jag vet inte vad du ska ta dig till. Schematisk av den djupa chipmask som utformades internt med HJÄLP av CAD-programvara. -Jag är inte så bra som jag vet. Bild av den djupa chipmasken som trycktes kommersiellt med hjälp av högupplöst stereolitografi. -Jag vet inte vad du ska ta. Masken placeras i en 3D-tryckt nivelleringslåda för att säkerställa att masken förblir jämn under gjutningen av lager 2 av chipsen. (B)Schematiska skisser av den grunda brunnen och djupbrunnsdesign av enheten. -Jag vet inte vad du ska gå till. Den grunda-väl design användes för att analysera funktionell aktivitet (bildande och resorption) av osteoblaster och osteoklaster. Den här konfigurationen bildas från två PDMS-lager. Ett funktionellt aktivitetssubstrat säkrades till botten av kulturen långt innan tätning skikten tillsammans. Polystyren skivor och ben rån användes för osteoblast och osteoklast kulturer, respektive. -Jag vet inte vad du ska ta dig till. Den djupa brunnsdesignen användes för att applicera mekanisk belastning på osteocyter. Den här konfigurationen består av tre PDMS-lager. Botten av kulturbrunnen bildas av det deformerbara PDMS-membranet (skikt 3). (C)Tillverkningssteg för polystyrenskivan som används för osteoblasterkulturer. Baksidan av en vävnad kultur behandlas coverslip markerades med maskeringstejp. Enskilda skivor skars ut med en kork-borer. Skivan rengjordes med etanol och en bomullspinne. Bandet stöd togs bort och skivan var fäst på botten av PDMS kultur väl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Konstruktion och montering av den mekaniska lastanordningen. (A)Bild på den monterade mekaniska lastladdningsanordningen. I kombination med PDMS-chippets djupbrunnsdesign sträcker lastenheten ut celler genom att applicera en ut ur plandistention på ett deformerbart membran. (B)Spräng-vy av enheten. Alla delar som visas i blått var 3D tryckt med en värmebeständig polymjölksyra glödtråd. All hårdvara är rostfritt stål. (C)Skruvuttagsmekanismen på lastenheten. Rotation av den centrala skruven (orange) skjuter skivan (grön) uppåt genom basen. Den uppåtgående rörelsen av platen deformerar PDMS membranet i djup-väl chip som cellerna har sådd. (D)Monteringsprocessen för lastanordningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mekaniskt lastningsexperiment. Alla vätskor administrerades och avlägsnades från chipet med en 5 ml spruta ansluten till åtkomstslangen. Ett kritiskt steg i denna process är 48 h inkubation med sterilt destillerat vatten före cell sådd. Utan denna inkubation celler visade låg livskraft och atypiska morfologi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Typiska funktionella aktivitetsresultat. (A) Typiska bildning resultat färgas med alizarin röd (vänster) och von Kossa (höger) från inducerad MC3T3-E1 osteoblast kulturer på dag 49. Hela skivbilder mäter 5,4 mm i diameter. (B)Typiska osteoklalastresorption resultat från RAW264.7 preosteoclasts inducerad med receptoraktivator av nukleärfaktor kappa-B ligand (RANKL). Celler var odlade på ben rån och färgas med toluidin blå på dag 30. (C)Typiska skanningselektronmikroskopibilder som verifierar närvaron av resorption gropar på benrån. Skalfältet i den övre bilden representerar 200 μm och skalfältet i den nedre bilden representerar 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Effekter av mekaniskt inducerad belastning på osteocyter. (A)Bilder av MLO-Y4 osteocyter vid 72 timmar i djupbrunnschipet som tillverkats med (vänster) och utan (höger) en 48 timmars inkubation med destillerat vatten före cellsådning. B)Finita elementanalys användes för att modellera den genomsnittliga ekvivalenta belastning som genererades på toppen av det deformerbara PDMS-membranet baserat på förskjutningen av lastanordningsplåten. Resultat från förskjutningar mellan 1,0 mm och 2,0 mm visas. (C)Värmekarta över den modellerade stamgradienten som induceras på PDMS-membranet för en plåtförskjutning på 1,5 mm.(D)Typiska resultat av en laktatdehydrogenasfläck av läkemedelsinducerade osteocyter som sträcktes med en förskjutning på 1,5 mm pläter. En lättare cell färgning observeras nära den yttre kanten av brunnen, vilket motsvarar placeringen av högre stamvärden som tyder på cellskador och / eller död. E)Representativa flödescytometriresultat av belastningsinducerad apoptos som anges i en bilagain V och död cellanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsblanta bild 1: 3D-tryckt utjämningslåda med löstagbar vägg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: Utjämningsruta CAD-fil 1. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Tilläggsfil 2: Utjämningsruta CAD-fil 2. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Tilläggsfil 3: Utjämningsruta CAD-fil 3. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Tilläggsfil 4: Maskinvarulista för utjämningsbox. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande video 1: Mekanisk lastningsanordning. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel beskriver grunden för tillverkning av ett ben remodeling LOC plattform för odling osteocyter, osteoklaster och osteoblaster. Genom att ändra djupet och storleken på brunnen inom chipet utvecklades flera konfigurationer för att stimulera osteocyter med mekanisk belastning och kvantifiera funktionella resultat av benremodeling (figur 1B).
Under chip montering, optimera plasma oxidation protokollet var avgörande för att eliminera läckage oro. Vi fann att utsätta PDMS ytor till 30 s syre plasma genereras med hjälp av en medelstor RF effektinställning (steg 4.1), lika med cirka 10,2 W, var tillräcklig för att skapa en stark bindning mellan skikten. Bindningens integritet minskade när längre exponeringstider eller en högre RF-effektinställning användes. Detta är förenligt med tidigare rapporter som noterade en överexponering av PDMS till syreplasma ökad ytjämnhet och minskad limhet17,18.
Dessutom var upprätthålla hög cell livskraft och typiska cell morfologi kritiskt beroende av PDMS härdning processen. PDMS polymer består av tvärbundna dimetylsiloxan oligomerer. Denna tvärbindningsprocess är både tids- och temperaturberoende. men även med omfattande härdning polymeren misslyckas med att helt polymerisera19. De återstående oligomererna har visat sig läcka ut från bulkpolymeren i omgivande cellodlingsmedium och har till och med hittats i membranen hos celler som odlas på polymerytan20. Flera grupper har rapporterat cytotoxiska effekter från icke-crosslinked PDMS oligomers21,22,23. För att ta itu med denna oro i vårt system optimerade vi PDMS härdningsprocessen. Även om härdningshastigheten för PDMS är temperaturberoende, begränsade materialegenskaperna hos våra spånmasker vår härdningstemperatur till 45 °C. Som sådan bestämde vi att chipsen skulle bakas i minst 18 timmar. Vidare har vi funnit att inkubera chips med dH2O i minst 48 timmar före cell sådd (steg 4.9) var nödvändigt att minska cytotoxiska effekter. Figur 5A visar MLO-Y4 osteocyter odlade i chips med och utan denna inkubationstid.
Den djupa konfigurationen, som var utformad för att rymma mekanisk belastning ansökan, kräver att chipet tillverkas från tre separata lager. Till skillnad från den grunda brunnskonfigurationen, tillverkade brunnen och membranportioner som ett enda stycke för den djupa brunnskonfigurationen orsakade membranet att varp. Detta kan bero på en skillnad i härdning priser mellan tjocka och tunna delar av chipet. För att lösa detta problem konstruerades membranskiktet separat och limmades till botten av chipet efter härdningsprocessen. För att generera ett separat membranskikt med jämn tjocklek är det viktigt att nivelleringsboxen är helt jämn innan PDMS tillsätts (steg 1.4). Som sådan rekommenderas användning av en digital gradskiva för att säkerställa en hög grad av noggrannhet. Dessutom, under steg 2.3.2, är det viktigt att ta bort så mycket PDMS från plastkoppen som möjligt. Inkonsekvenser vid detta steg kommer att leda till höga avvikelser i membrantjocklekar, och i slutändan höga avvikelser i den genomsnittliga substratstam som används för att framkalla osteocyte mekanotransduktion.
Vår benremodelingsplattform ger en hög grad av mångsidighet. Detta system kan användas för att undersöka en mängd faktorer som reglerar ben remodeling, såsom belastning-inducerad mekanotransduktion, flercellig signalering, inflammation, eller läkemedelseffekter. Till exempel användes systemet för att analysera de kombinerade effekterna av mekanisk belastning och inflammation på ben remodeling i en läkemedelsinducerad miljö14. Mekanisk belastning tillämpades på bisfosfonat-behandlade osteocyter. Proteinanalys av det konditionerade mediet visade en signifikant ökning av nivåerna av leptin och osteonectin och en signifikant minskning av nivåerna av CCL21 och CD36 jämfört med osteocyter som inte var mekaniskt laddade14.
De protokoll som presenteras här ger en grund för odling av varje celltyp inom LOC samt metoder för att inducera mekanisk belastning och kvantifiera funktionell aktivitet. Framåt arbetar vi mot ett riktigt benorgan-på-ett-chip. Dessutom tror vi att använda vårt system för att utveckla matematiska modelleringssystem kan avsevärt öka vår förståelse av de komplexa flercelliga signalprocesser som reglerar ben remodeling24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation under Grant Nos.(CBET 1060990 och EBMS 1700299). Detta material är också baserat på arbete som stöds av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Anslag nr (2018250692). Alla åsikter, resultat, slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis National Science Foundations åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic sheet | Optix | -- | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | -- | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | -- | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | -- | -- | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | -- | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | -- | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
