Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu
Summary
Burada, bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kemik remodeling analiz için protokoller sıyoruz. Bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı hücresel matris deforme ederek osteosit mekanostransdüksiyon neden platform ile eşleştirilmiş olabilir. Platform aynı zamanda osteoklastlar ve osteoblastlar (rezorpsiyon / oluşumu) kemik remodeling fonksiyonel sonuçları ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Kemik remodeling iskelet büyüme ve onarım yanı sıra mekanik ortamda değişikliklere adapte için gerekli olan sıkı düzenlenmiş bir süreçtir. Bu süreçte, mekanosensit osteositler katabolik osteoklastlar ve anabolik osteoblastlar arasındaki karşıt tepkileri düzenler. Bu süreci düzenleyen son derece karmaşık sinyal yollarını daha iyi anlamak için, laboratuvarımız küçük ölçekli bir sistem içinde kemik remodeling fonksiyonel sonuçları (oluşumu ve rezorpsiyon) analiz etmek için temel bir laboratuvar-on-a-chip (LOC) platformu geliştirdi. Kemik remodeling hafta lar ay sırasına göre meydana gelen uzun bir süreç olduğundan, sistem içinde uzun vadeli hücre culturing protokolleri geliştirdi. Osteoblastlar ve osteoklastlar LOC içinde fonksiyonel aktivite substratları üzerinde yetiştirilen ve yedi haftakadar muhafaza edildi. Daha sonra, talaşkemik oluşumu ve rezorpsiyon kantitatifikasyon uyracak şekilde söküldü. Ayrıca, loc platformu ile eşleşen ve hücresel matris deforme ederek osteosit mekanotransdüksiyon ikna etmek için kullanılabilir bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı tasarladık. Loc platformu içinde osteositler, osteoblastlar ve osteoklastlar için hücre kültür protokollerini optimize ettik ve sterilite ve sitotoksisite ile ilgili endişeleri ele aldık. Burada, LOC’un üretilmesi ve sterilizasyonu, fonksiyonel yüzeylerde hücrelerin tohumlanması, mekanik yükün indüklenmesi ve uç nokta sonuçlarını ölçmek için LOC’un sökülmesi için protokoller sunuyoruz. Bu tekniklerin kemik remodeling için gerçek bir organ-on-a-chip geliştirmek için zemin yatıyordu inanıyoruz.
Introduction
Kemik üç ana hücre tipleri arasında karmaşık koordinasyon gerektiren son derece dinamik bir dokudur: osteositler, osteoblastlar, ve osteoklastlar. Bu hücreler arasındaki çok hücreli etkileşimler felç ve uzun süreli hareketsizlik sırasında meydana gelen kemik kaybından ve büyüme ve egzersize yanıt olarak oluşan kemik oluşumundan sorumludur. Osteositler, en bol kemik hücre tipi, kemiğe uygulanan mekanik uyaranlara karşı son derece duyarlıdır. Mekanik stimülasyon osteosit metabolik aktivitesini değiştirir ve anahtar sinyal molekülleri bir artışa yol açar1,2. Bu süreç sayesinde, mekanotransdüksiyon olarak bilinen, osteositler doğrudan osteoblastlar (kemik oluşturan hücreler) ve osteoklastlar (kemik rezorbülasyon hücreleri) faaliyetlerini koordine edebilirsiniz. Kemik homeostazBakımı kemik oluşumu ve kemik rezorpsiyon oranları arasında sıkı bir düzenleme gerektirir; ancak, bu süreçte ki aksaklıklar osteoporoz veya osteopetrozis gibi hastalık durumlarına neden olabilir.
Bu üç hücre tipi arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı, mikroakışkan ve laboratuvar-on-a-chip (LOC) teknolojilerini kullanarak araştırmaya iyi katkıda bulunur. Bu amaçla, laboratuvarımız son zamanlarda kemik rezorpsiyon ve oluşumu (fonksiyonel sonuçlar) kemik remodeling sürecinde analiz etmek için bir LOC platformu kavramı kanıtı kurmuştur. Platform hücresel etkileşimlerin, değiştirilmiş yükleme ortamlarının ve araştırma ilaç taraması nın incelenmesi nde kullanılabilir. Son yıllarda, çeşitli mikroakışkan cihazlar kemik remodeling düzenleyen moleküler sinyal yollarını araştırmak için geliştirilmiştir; ancak, bu sistemlerin çoğu fonksiyonel aktivite3,4,,5,,6,7göstergesidir dolaylı belirteçleri ile remodeling ölçmek . Sistemimizin bir avantajı, fonksiyonel sonuçların doğrudan ölçülmesi için kullanılabilmesidir. Kemik remodeling uzun vadeli bir süreçtir. Bu nedenle, kemik rezorpsiyonu ve oluşumunun doğrudan nicelleştirilmesi, en az birkaç hafta8ile 8 ,9,,10,11arasında tutulabilen bir kültür sistemi gerektirir. Böylece LOC platformünü geliştirirken, oluşum ve rezorpsiyon için gerekli uzun vadeli kültür protokolleri oluşturduk ve sistem içinde yedi haftaya kadar hücreleri koruduk11. Ayrıca, her iki hücre tipi için uygun culturing yüzeyleri platforma dahil ettik; osteoklastlar doğrudan kemik üzerine, ve plastik yapışık olduğu bilinen osteoblastlar polistiren diskler üzerinde kültürlendi. Ayrıca, remodeling analizi11,,12için sterilite, uzun vadeli sitotoksisite ve talaş demontaj ile ilgili konuları ele aldı.
LOC platformu da matris deformasyon yoluyla osteosit mechanotransdüksiyon indüklemek için kullanılabilir. 3D baskılı mekanik yükleme cihazı LOC ile eşleştirmek ve hücreleri13germek için düzlem dışında statik bir dağıtım uygulamak için geliştirilmiştir. Bu mekanik yükü karşılamak için LOC içindeki kuyunun derinliği artırıldı. Bu küçük ölçekli, basit mekanik yükleme cihazı kolayca sınırlı mühendislik deneyimi ile laboratuvarlar tarafından üretilebilir, ve biz daha önce 3D baskılı bileşenlerin çizimleri paylaştık13. Mevcut çalışmada, LOC’un başarılı kullanımı için gerekli olan bazı yeni teknikleri gösteriyoruz. Bu tekniklerin açıklanmasının görsel bir formattan yararlandığına inanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, osteositler, osteoklastlar ve osteoblastlar için bir kemik remodeling LOC platformu imal için temelleri açıklanmaktadır. Çip içindeki kuyunun derinliğini ve boyutunu değiştirerek, osteositlerin mekanik yük ile uyarLanması ve kemik remodelinginin fonksiyonel sonuçlarının ölçülmesi için birden fazla konfigürasyon geliştirilmiştir(Şekil 1B).
Talaş montajı sırasında plazma oksidasyon protokolünün optimize edil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Grant Nos( CBET 1060990 ve EBMS 1700299) kapsamında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından Hibe No (2018250692) kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yazarların görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı’nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.
Materials
| Acrylic sheet | Optix | — | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | — | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | — | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | — | — | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | — | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | — | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
References
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. . Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
