Summary

Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu

Published: May 21, 2020
doi:

Summary

Burada, bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kemik remodeling analiz için protokoller sıyoruz. Bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı hücresel matris deforme ederek osteosit mekanostransdüksiyon neden platform ile eşleştirilmiş olabilir. Platform aynı zamanda osteoklastlar ve osteoblastlar (rezorpsiyon / oluşumu) kemik remodeling fonksiyonel sonuçları ölçmek için kullanılabilir.

Abstract

Kemik remodeling iskelet büyüme ve onarım yanı sıra mekanik ortamda değişikliklere adapte için gerekli olan sıkı düzenlenmiş bir süreçtir. Bu süreçte, mekanosensit osteositler katabolik osteoklastlar ve anabolik osteoblastlar arasındaki karşıt tepkileri düzenler. Bu süreci düzenleyen son derece karmaşık sinyal yollarını daha iyi anlamak için, laboratuvarımız küçük ölçekli bir sistem içinde kemik remodeling fonksiyonel sonuçları (oluşumu ve rezorpsiyon) analiz etmek için temel bir laboratuvar-on-a-chip (LOC) platformu geliştirdi. Kemik remodeling hafta lar ay sırasına göre meydana gelen uzun bir süreç olduğundan, sistem içinde uzun vadeli hücre culturing protokolleri geliştirdi. Osteoblastlar ve osteoklastlar LOC içinde fonksiyonel aktivite substratları üzerinde yetiştirilen ve yedi haftakadar muhafaza edildi. Daha sonra, talaşkemik oluşumu ve rezorpsiyon kantitatifikasyon uyracak şekilde söküldü. Ayrıca, loc platformu ile eşleşen ve hücresel matris deforme ederek osteosit mekanotransdüksiyon ikna etmek için kullanılabilir bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı tasarladık. Loc platformu içinde osteositler, osteoblastlar ve osteoklastlar için hücre kültür protokollerini optimize ettik ve sterilite ve sitotoksisite ile ilgili endişeleri ele aldık. Burada, LOC’un üretilmesi ve sterilizasyonu, fonksiyonel yüzeylerde hücrelerin tohumlanması, mekanik yükün indüklenmesi ve uç nokta sonuçlarını ölçmek için LOC’un sökülmesi için protokoller sunuyoruz. Bu tekniklerin kemik remodeling için gerçek bir organ-on-a-chip geliştirmek için zemin yatıyordu inanıyoruz.

Introduction

Kemik üç ana hücre tipleri arasında karmaşık koordinasyon gerektiren son derece dinamik bir dokudur: osteositler, osteoblastlar, ve osteoklastlar. Bu hücreler arasındaki çok hücreli etkileşimler felç ve uzun süreli hareketsizlik sırasında meydana gelen kemik kaybından ve büyüme ve egzersize yanıt olarak oluşan kemik oluşumundan sorumludur. Osteositler, en bol kemik hücre tipi, kemiğe uygulanan mekanik uyaranlara karşı son derece duyarlıdır. Mekanik stimülasyon osteosit metabolik aktivitesini değiştirir ve anahtar sinyal molekülleri bir artışa yol açar1,2. Bu süreç sayesinde, mekanotransdüksiyon olarak bilinen, osteositler doğrudan osteoblastlar (kemik oluşturan hücreler) ve osteoklastlar (kemik rezorbülasyon hücreleri) faaliyetlerini koordine edebilirsiniz. Kemik homeostazBakımı kemik oluşumu ve kemik rezorpsiyon oranları arasında sıkı bir düzenleme gerektirir; ancak, bu süreçte ki aksaklıklar osteoporoz veya osteopetrozis gibi hastalık durumlarına neden olabilir.

Bu üç hücre tipi arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı, mikroakışkan ve laboratuvar-on-a-chip (LOC) teknolojilerini kullanarak araştırmaya iyi katkıda bulunur. Bu amaçla, laboratuvarımız son zamanlarda kemik rezorpsiyon ve oluşumu (fonksiyonel sonuçlar) kemik remodeling sürecinde analiz etmek için bir LOC platformu kavramı kanıtı kurmuştur. Platform hücresel etkileşimlerin, değiştirilmiş yükleme ortamlarının ve araştırma ilaç taraması nın incelenmesi nde kullanılabilir. Son yıllarda, çeşitli mikroakışkan cihazlar kemik remodeling düzenleyen moleküler sinyal yollarını araştırmak için geliştirilmiştir; ancak, bu sistemlerin çoğu fonksiyonel aktivite3,4,,5,,6,7göstergesidir dolaylı belirteçleri ile remodeling ölçmek . Sistemimizin bir avantajı, fonksiyonel sonuçların doğrudan ölçülmesi için kullanılabilmesidir. Kemik remodeling uzun vadeli bir süreçtir. Bu nedenle, kemik rezorpsiyonu ve oluşumunun doğrudan nicelleştirilmesi, en az birkaç hafta8ile 8 ,9,,10,11arasında tutulabilen bir kültür sistemi gerektirir. Böylece LOC platformünü geliştirirken, oluşum ve rezorpsiyon için gerekli uzun vadeli kültür protokolleri oluşturduk ve sistem içinde yedi haftaya kadar hücreleri koruduk11. Ayrıca, her iki hücre tipi için uygun culturing yüzeyleri platforma dahil ettik; osteoklastlar doğrudan kemik üzerine, ve plastik yapışık olduğu bilinen osteoblastlar polistiren diskler üzerinde kültürlendi. Ayrıca, remodeling analizi11,,12için sterilite, uzun vadeli sitotoksisite ve talaş demontaj ile ilgili konuları ele aldı.

LOC platformu da matris deformasyon yoluyla osteosit mechanotransdüksiyon indüklemek için kullanılabilir. 3D baskılı mekanik yükleme cihazı LOC ile eşleştirmek ve hücreleri13germek için düzlem dışında statik bir dağıtım uygulamak için geliştirilmiştir. Bu mekanik yükü karşılamak için LOC içindeki kuyunun derinliği artırıldı. Bu küçük ölçekli, basit mekanik yükleme cihazı kolayca sınırlı mühendislik deneyimi ile laboratuvarlar tarafından üretilebilir, ve biz daha önce 3D baskılı bileşenlerin çizimleri paylaştık13. Mevcut çalışmada, LOC’un başarılı kullanımı için gerekli olan bazı yeni teknikleri gösteriyoruz. Bu tekniklerin açıklanmasının görsel bir formattan yararlandığına inanıyoruz.

Protocol

1. Talaş maskesi hazırlama NOT: Adım 1.1 – 1.3 yalnızca fiş maskesinin ilk alınmasından sonra bir kez yapılması gerekir. Maskenin kullanım sırasında eğilmemesini sağlarlar. Mikroakışkan maskelerin tasarımı daha önce11,14olarak tanımlanmıştır. Maskeler şirket içinde tasarlanmış ve yüksek çözünürlüklü stereolitografi kullanılarak ticari olarak üretilmiştir (Şekil 1…

Representative Results

Sığ-iyi yapılandırma osteoblastlar ve osteoklastların fonksiyonel aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Osteoblastlar yoluyla kemik oluşumu ve osteoklastlar yoluyla rezorpsiyon birkaç hafta ay sırasına göre kültür asyon süreleri gerektirir. MC3T3-E1 ön osteoblastlarından kemik oluşumu alizarin kırmızısı ve von Kossa lekeleri kullanılarak ölçüldü11,15. 49. günde alizarin kırmızısı ile boyanm…

Discussion

Bu makalede, osteositler, osteoklastlar ve osteoblastlar için bir kemik remodeling LOC platformu imal için temelleri açıklanmaktadır. Çip içindeki kuyunun derinliğini ve boyutunu değiştirerek, osteositlerin mekanik yük ile uyarLanması ve kemik remodelinginin fonksiyonel sonuçlarının ölçülmesi için birden fazla konfigürasyon geliştirilmiştir(Şekil 1B).

Talaş montajı sırasında plazma oksidasyon protokolünün optimize edil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Grant Nos( CBET 1060990 ve EBMS 1700299) kapsamında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından Hibe No (2018250692) kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yazarların görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı’nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.

Materials

Acrylic sheet Optix 3.175 mm thick
Angled dispensing tips Jensen Global JG18-0.5X-90 Remove plastic connector prior to use
Biopsy punch Robbins Instruments RBP-10 1 mm diameter
Bone wafers Boneslices.com 0.4 mm thick Bovine cortical bone
Bovine calf serum Hyclone SH30072
Calipers Global Industrial T9F534164
Cell spatula TPP 99010
Chip mask ProtoLabs Custom-designed Print material: Accura SL 5530
Cork borer Fisher Scientific 07-865-10B
Cotton tipped applicator Puritan 806-WCL
Culture dish (100 mm) Corning 430591 Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm) Corning 430597 Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape 3M Company Scotch 237
Fetal bovine serum Hyclone SH30910
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Leveling box Custom-made 3D printed
Masking tape 3M Company Scoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblasts ATCC CRL-2593 Subclone 4
Mechanical loading device Custom-made 3D printed
Minimum essential alpha medium Gibco 12571-063
MLO-Y4 osteocytes Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tape Duck Brand Standard packaging tape
Paraffin film Bemis Parafilm PM999
Penicillin/streptomycin Invitrogen p4333
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kit Dow Corning Sylgard 184
Polystyrene coverslips Nunc Thermanox 174942 Sterile, tissue culture treated
Oven Quincy Lab 12-180
RAW264.7 preosteoclasts ATCC TIB-71
Scalpel BD Medical 372611
Silicone tubing Saint-Gobain Tygon ABW00001 ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks software Dassault Systèmes Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesive Loctite 2323879 Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml) BD Medical 309646 Sterile
Syringe pump Harvard Apparatus 70-2213 Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatula Fisher Scientific 21-401-10
Two-part expoxy Loctite 1395391 5 minute quick set
Type I collagen Corning 354236 Rat tail collagen
Vacuum desiccator Bel-Art F42010-0000
Waterproof sealant Gorilla 8090001 100% silicone sealant

References

  1. Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
  2. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  3. Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
  4. Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
  5. Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
  6. Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
  7. Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
  8. Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
  9. Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
  10. Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
  11. George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
  12. Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , (2019).
  13. Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
  14. George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
  15. George, E. L. . Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).
  16. York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
  17. Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
  18. Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
  19. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
  20. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  21. Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
  22. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
  23. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  24. Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
  25. Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).

Play Video

Cite This Article
Truesdell, S. L., George, E. L., Van Vranken, C. C., Saunders, M. M. A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling. J. Vis. Exp. (159), e61076, doi:10.3791/61076 (2020).

View Video