Summary
Vi presenterar en modell av skandinaviska hjärtsjukdomar med hjälp av kardiomyocyter som härrör från mänskliga inducerad pluripotenta stamceller, tillsammans med en metod för kvantitativ utvärdering av vävnadsskador som orsakas av ischemi. Denna modell kan ge en användbar plattform för läkemedelsscreening och ytterligare forskning om ischemisk hjärtsjukdom.
Abstract
Ischemisk hjärtsjukdom är en betydande dödsorsak över hela världen. Det har därför varit föremål för en enorm mängd forskning, ofta med små djurmodeller som gnagare. Människohjärtats fysiologi skiljer sig dock avsevärt från gnagarhjärtats, vilket understryker behovet av kliniskt relevanta modeller för att studera hjärtsjukdom. Här presenterar vi ett protokoll för att modellera ischemisk hjärtsjukdom med hjälp av kardiomyocyter differentierade från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPS-CMs) och att kvantifiera skador och funktionella nedskrivningar av de ischemiska kardiomyocyter. Exponering för 2% syre utan glukos och serum ökar andelen skadade celler, vilket indikeras genom färgning av kärnan med propidium iodid, och minskar cellulär livskraft. Dessa villkor minskar också kontraktility av hiPS-CMs som bekräftas av förskjutning vektor fält analys av mikroskopiska videobilder. Detta protokoll kan vidare ge en bekväm metod för personligt anpassad läkemedelsscreening genom att underlätta användningen av hiPS-celler från enskilda patienter. Därför kan denna modell av ischemisk hjärtsjukdom, baserad på iPS-CMs av mänskligt ursprung, ge en användbar plattform för läkemedelsscreening och ytterligare forskning om ischemisk hjärtsjukdom.
Introduction
Ischemisk hjärtsjukdom (IHD) är erkänd över hela världen som den vanligaste dödsorsaken, och det uppskattades vara ansvarig för mer än nio miljoner dödsfall i 20161. Förekomsten av hjärt-kärlsjukdom fortsätter att öka, och globaliseringen verkar ha bidragit till förekomsten av riskfaktorer hjärtsjukdomar i utvecklingsländerna. Därför är studien av IHD blir allt mer brådskande2.
Experimentella modeller av hjärt-kärlsjukdom är avgörande för att studera mekanismerna för sjukdom, noggrannhet diagnos, och utveckling av nya terapier. Flera experimentella modeller har föreslagits av många laboratorier. Det är av yttersta vikt att välja en modell med betydande fördelar; genomförbarhet, repeterbarhet och likhet med mänskliga sjukdomar är nyckelfaktorer vid valet av modeller för hjärt- ochkärlsjukdomar 3. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som bär på specifika kardiomyopati-associerade mutationer är ett lovande alternativ till djurmodeller4. Även om många strategier har beskrivits för att inducera kardiomyocyter med hjälp av iPSCs5,6,77,8,9, här ger vi en enkel metod för att producera en IHD-modell med hjälp av kardiomyocyter differentierade från hiPSCs, där mödosamt urval av kardiomyocyte med hjälp av markörer inte tillämpas. I denna metod väljs kardiomyocyter funktionellt genom att analysera spontan kontraktion.
Induktion av kardiomyocyter med hjälp av hiPSCs undviker djuroffer och tekniskt svårt kirurgi. Upprättande av djurmodeller av IHD kräver utmanande kirurgiska tekniker10. Att perfekt simulera de olika patofysiologiska aspekterna av mänskliga hjärtsjukdomar som hjärtfrekvens och actionpotentialer från gnagares fysiologi är nästan omöjligt. Tillsammans med moral och etik att använda djurmodeller, är utvecklingen av nya experimentella modeller än djurmodeller absolut nödvändigt. Kardiomyocyter differentierade från mänskliga iPS-celler bättre efterlikna det fysiologiska tillståndet i det mänskliga hjärtat. I detta protokoll upprättar vi en modell av IHD med hjälp av kardiomyocyter som härrör från hiPS-celler (hiPS-CMs). I vår modell leder berövande av syre och glukos till en minskning av den kontraktila kraft och livskraft hiPS-CMs. Vår metod ger en ny metod för modell-IHD och visar en ny plattform för studiet av denna sjukdom.
Protocol
1. underhållskulturen för hiPSC
- Coat en sex-brunn kultur tallrik med laminin (Tabell över material).
- Späd laminin till 0,5 μg/mL i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt utspädd laminin i en sex-brunnsplatta med en volym av 2,0 mL/brunn.
- Inkubera plattan vid 37 °C i 30 min.
- Ta bort lamininlösningen från brunnarna.
- Frö hiPSCs i 2 mL iPSC underhållsmedium (Tabell of Materials) på de belagda brunnarna vid en densitet av 3 × 104 celler/brunn utan att ytan torkas.
- Subkultur hiPSCs.
- Förbered 0,5× cell dissociation enzymer (Tabell av material) lösning.
- Blanda 10 μL på 0,5 M etendiamintetraacetisk (EDTA) och 10 mL PBS för att göra 0,5 mM EDTA/PBS.
- Späd 10 mL av 1× cell dissociation enzymer till 0,5× genom att lägga till 10 mL av 0,5 mM EDTA/PBS.
- Aspirera det förbrukade mediet från brunnarna.
- Tillsätt 2 mL/brunn av PBS för att tvätta cellerna och kassera sedan PBS.
- Tillsätt 800 μL av 0,5×cells dissociationsenzymerna, och inkubera cellerna i 7 min vid 37 °C i en befuktad inkubator som innehåller 5% CO2.
OBS: 0,05% trypsin-EDTA kan användas för att separera celler. - Ta försiktigt bort 0,5×-lösning för celldesociationsenzymer.
- Tvätta cellerna med 2 mL PBS, kassera sedan PBS.
OBS: Var skonsam eftersom cellerna lätt lossnar efter att lägga till cell dissociation enzymer lösning. - Tillsätt 1 mL iPS underhållsmedium (Tabell of Materials) innehållande 10 μM Y-27632.
OBS: Lägga till Y-27632 ökar överlevnaden för hiPSCs. - Rubba celler med hjälp av en cell skrapa, och samla dem i en 15 mL centrifugrör.
- Räkna antalet celler. Justera celltätheten till 1,5 × 104 celler/mL genom att tillsätta iPS-underhållsmedium som innehåller 10 μM Y-27632.
OBS: Använd inte centrifugeringen för att förhindra cellskador. - Frö 2 mL cellblandning på den lamininbelagda sex-brunnsplattan (slutlig densitet: 3 × 104 celler/brunn).
- Inkubera cellerna vid 37 °C i en befuktad inkubator som innehåller 5% CO2.
- Ersätt odlingsmediet med iPS underhållsmedium utan Y-27632 dag 1, 4, 5 och 6.
- Förbered 0,5× cell dissociation enzymer (Tabell av material) lösning.
- Subkultur cellerna på dag 7.
OBS: Subkultur cellerna av dag 7 för att hämma slumpmässig differentiering av hiPSCs.
2. Induktion av hjärtdifferentiering av hiPSCs
- Coat en 96-väl kultur tallrik med laminin (Tabell över material).
- Späd laminin till 1,675 μg/mL med PBS.
- Tillsätt den utspädda lamininlösningen på en 96-brunnsplatta vid en volym av 0,1 mL/brunn.
- Inkubera plattan vid 37 °C i 30 min.
- Frö hiPSCs på en 96-väl platta vid en densitet av 3 × 104 celler / väl.
- Föröka hiPSCs vid 37 °C i en befuktad inkubator som innehåller 5% CO2.
- En dag senare, ersätt mediet med 200 μL/brunns iPS tillväxtmedium (Tabell of Materials).
- Byt medium varje dag i ytterligare 2–3 dagar tills cellerna når 70%–80 % konfluency.
- Tillämpa differentieringsmedia.
- Aspirera det förbrukade mediet och byt ut det långsamt mot 200 μL/brunn av förvörd differentieringsmedium A (Tabell of Materials).
- Placera plattan vid 37 °C i en befuktad inkubator som innehåller 5% CO2.
- Efter 48 h, aspirera mediet och ersätt långsamt det med 200 μL/brunn av förvörd differentieringsmedium B (Tabell of Materials).
- Placera plattan vid 37 °C i en befuktad inkubator som innehåller 5% CO2.
OBS: Det är oerhört viktigt att differentieringsmedierna hålls fräscha. De kommer gradvis att förlora sin differentieringseffekt, vanligtvis inom två veckor. Aliquot fresh medium och förvara vid −20 °C vid behov.
- Applicera kardiomyocyte underhållsmedium.
- Efter 48 h, aspirera mediet och långsamt ersätta det med 200 μL/brunn av förvörd kardiomyocyte underhållsmedium (Tabell of Materials).
- Placera plattan vid 37 °C i en befuktad inkubator som innehåller 5% CO2.
- Byt ut kardiomycytdifferentieringsmediet varannan dag fram till dag 30.
OBS: Det är viktigt att varaktigheten av tillämpningen av differentiering media A och B är exakt inställd på 48 h för att säkerställa den exakta uttryckssekvensen av gener som krävs för differentiering.
3. Exponering för ischemi
- Beröva odlingsmediet av näringsämnen och syre.
- Förbered Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) utan glukos och serum.
- Aspirera kultur medium från brunnarna i 96-brunnsplattan som innehåller hiPS-CMs.
- Tillsätt det näringsfattiga mediet till brunnarna med en volym på 200 μL/brunn.
- Placera odlingsplattan i en hypoxisk inkubator (Table of Materials).
- Ingjuta kvävegas, och bibehålla den interna syrekoncentrationen vid 2% och CO2 koncentration vid 5% för 24 h.
- Gå vidare till önskade analyser: t ex,lönsamhetsanalys, bedömning av kontraktilitet, eller bedömning av cellulär skada.
4. Bedömning av cellulär livskraft med hjälp av MTT-analys
- Använd MTT-analyssatsen (Table of Materials) för att kvantitativt bedöma cellernas livskraft.
OBS: Exponering för 1 mM väteperoxid i DMEM för 1 h kan användas för att skada celler (positiv kontroll). Exponering för 0 mM väteperoxid i DMEM kan användas för den negativa kontrollen.- Tillsätt 10 μL MTT-reagens till cellerna med hjälp av en upprepande pipettor.
- Blanda försiktigt i en minut på en orbital shaker.
- Inkubera cellerna för 3–4 h vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator. Efter inkubation kommer den formazan som produceras i cellerna att visas som mörka kristaller i brunnarnas botten.
- När du har tagit bort supernatanten ska de olösliga formazankristallerna lösas upp i 100 μL dimetylsulfoxidlösning (DMSO). Denna lösning kommer att lösa upp formazan kristaller, producerar en lila lösning.
FÖRSIKTIGHET: DMSO kan irritera ögon, andningsorganen, och hud. Använd lämpliga handskar och ögon-/ansiktsskydd. - Mät upp absorbansen för varje prov med en mikroplattläsare vid en våglängd på 570 nm.
5. Bedömning av kontraktsbarheten för iPS-CMs
- Om den inte är installerad, erhålla Particle Image Velocimetry ImageJ plugin11 https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv och installera.
- Med hjälp av en faskontrast mikroskop, spela in videobilder av hiPS-CMs med hjälp av 4× objektivet på ~ 20 bilder per sekund för ~ 10 s, och spara som "analyze.avi". För en jämförelse av kontraktilitet mellan före och efter ischemi, bekräfta att platsen för intresse registreras.
OBS: Ett mikroskop med ett automatiserat stadium är användbart för att rikta platsen för intresse. Filmfil ska vara i .avi-format för senare analys. Om inte, konvertera filmen till .avi. - Skapa mappstruktur enligt bild 1. Ett exempel på "joblist.txt" anges i tilläggsfil.
- Analysera diskreta tvådimensionella vektorfält av cellulär förskjutning.
- Starta Fiji (ImageJ) programvara12, gå till Plugins > Makron > Redigera och öppna "vector_analysis.ijm" (Kompletterande Coding File).
- Klicka på Kör. Analys kommer att utföras automatiskt.
OBS: Förskjutningsvektorer D(x,y) beräknas för varje 16 × 16 pixlar mellan referensramen (den första bildrutan) och alla efterföljande bildrutor (bildrutor 1 jämfört med 2, 1 mot 3, 1 mot 4 osv.). Resultatet beräknas för varje bildruta och sparas som "vec_x.txt" (x är ett ramtal). En vektor av maximal förskjutning, M(x, y), definieras för varje (x, y) par enligt följande:
där k representerar det ramnummer vid vilket | Dk (x,y)| = max [| D2 (x,y)|, | D3 (x,y)|, ..., | Dn (x,y)|] och n betecknar den sista bildrutan. Resultatet sparas som "Max_vector.txt". | M(x, y)| representerar den maximala förskjutningen som orsakas av kardiomyocytekontraktion vid analyspunkten (x, y). Kontraktilitetsvärde C i godtyckliga enheter beräknas på följande sätt:
Detta värde sparas vid kolumn 7, rad 1 i "Max_vector.txt". C representerar summan av förskjutning för alla (x, y). Ju större del där förskjutningen på grund av hjärtinfarkt kontraktion är stor, desto större värde av C. Vektorfältet för maximal förskjutning, M(x, y), överlagras med faskontrastbild av den första bildrutan ("Phase_contrast.png") och sparas som "Overlaid.png". Eftersom omfattningen av förskjutningsvektorn beräknas utifrån den första bildrutan i videon är det att föredra att hiPS-CMs är vid vilande diastolisk period för den första bildrutan.
6. Bedömning av cellulära skador med hjälp av flödescytometri
- Späd en 1 mg/mL lösning av propidium-iodid till 1:1 000 i PBS.
- Stain de fristående cellerna med propidium iodid.
- Aspirera mellanstora och placera den i en lämpligt storlek centrifugrör.
- Centrifugera röret vid 1 000 × g i 5 min, och avlägsna försiktigt supernatanten för att inte förlora sedimenterade celler.
- Inkubera cellerna med den utspädda propidiummidogenlösningen i rumstemperatur i 15 min i mörker.
- Centrifugera röret vid 1 000 × g i 5 min, och avlägsna försiktigt supernatanten för att inte förlora sedimenterade celler.
- Rekonstruera cellerna i ~1 mL PBS.
OBS: Det är viktigt att samla loss flytande celler från mediet för att exakt kvantifiera cellulära skador.
- Fläcken bifogade celler med propidium iodid.
- Tvätta bifogade celler två gånger med PBS försiktigt, sedan kassera PBS.
- Inkubera cellerna med den utspädda propidiummidodidlösningen i 15 min i mörker.
- Aspirera propidiummididlösningen.
- Lösgör cellerna med hjälp av 0,25% trypsin. Flytta celllösningen i ett centrifugrör.
- Centrifugera röret vid 1 000 × g i 5 min, och avlägsna försiktigt supernatanten för att inte förlora sedimenterade celler.
- Rekonstruera cellerna i ~1 mL PBS.
- Blanda de flytande och bifogade cellerna för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analys.
- För celllösningen genom ett 30 μm filter.
OBS: Att skicka cellerna till ett filter är mycket viktigt för en noggrann FACS-mätning. - Analysera proverna med hjälp av ett FACS-system.
7. Immunfärgning
- Åtgärda cellprovet.
- Aspirera kulturmediet.
- Tillsätt 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna tre gånger med PBS.
OBS: Färsk paraformaldehydlösning rekommenderas för optimal fixering.
- Permeabilisera cellerna med 0,2% Triton X-100 i 15 min, sedan kasta reagens.
- Tillsätt 3% bovint serumalbumin för att blockera cellerna i 30 min.
- Applicera primär antikropp.
- Kassera bovint serumalbuminlösning från odlingsplattan.
- Inkubera cellerna med primära antikroppar över natten vid 4 °C.
- Ta bort antikroppslösningen.
- Tvätta cellerna tre gånger med PBS.
- Applicera sekundär antikropp.
- Kassera PBS-lösning från odlingsplattan.
- Inkubera cellerna med sekundära antikroppar i 30 min vid rumstemperatur i mörker.
OBS: Primär anti-hjärt troponin T (TNNT2) mus monoklonal antikropp används vid en utspädning av 1:750 i 3% BSA. Alexa Fluor 488-konjugerad sekundär get anti-mus antikropp späds ut till 1:1,000 i 3% BSA.
- Ytterligare färgning av kärna och aktinfibrer.
- Ta bort antikroppslösningen.
- Inkubera cellerna i reagens för färgning av kärnan (Tabell över material) och aktinfärgningsreagens ( Tabell ofMaterials) i PBS i 30 min vid rumstemperatur i mörker.
OBS: 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) eller Hoechst 33342 kan användas för nukleär färgning. - Tvätta cellerna tre gånger med PBS.
- Fånga fluorescensbilder med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
Representative Results
Framgångsrikt differentierade celler visar spontan kontraktion under mikroskopet (Video 1). Typiskt, 50% av brunnar visar spontana kontraktion i <20 dagar( Kompletterande Figur 1). Hjärtmarkörprotein (t.ex. cTnT) kan användas för att bekräfta framgångsrik differentiering (figur 2).
Typiskt visar celler från den ischemiska gruppen lägre bärkraft i MTT-analyser (Figur 3A) och kontraktilitet (Figur 3E,F, Tilläggsfigur 2) än de från normoxisk kontrollgrupp. Också förhållandet mellan propidium iodid-positiva celler är högre i den ischemiska gruppen än i kontrollgruppen (Figur 3B–D), vilket indikerar högre cellulära skador.
Bild 1: Mappstruktur för förskjutning vektoranalys med hjälp av imageJ.
"joblist.txt" beskriver sökvägen till filmfiler varje rad. Om det finns tre filer att analysera kommer det att finnas tre mappar (movie1, movie2 och movie3), där "analyze.avi" (filmen av intresse) ska placeras. När analysen har utförts av "vector_analysis.ijm" kod, filer kommer att genereras (anges i blått) i varje film mapp. Information som lagras i varje fil förklaras i detalj i huvudtexten. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Representativ bild av hjärtmarkörfärgning.
Uttryck av hjärt markörprotein hjärt troponin T (cTnT). Blå: 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), röd: aktin, grön: cTnT. Inset: striated uttryck av cTnT, som motsvarar den sarcomere strukturen. Skala bar, 50 μm. Denna siffra har modifierats från Wei et al.13. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bilder av cellulär viability assay, bedömning av cellulära skador, och kontraktilitet.
(A) Jämförelse av cellulär viability (MTT-analys). Högre absorbans indikerar högre bärkraft. n = 5 för varje villkor. (B, C, och D) Flödescytometrianalys av propidium-iodid (PI)-färgade celler. Ischemiska celler uppvisar en minskad framåt scatter intensitet och ökad PI fluorescens, jämfört med kontrollen. (D) Andel AV PI-färgade celler i flödescytometrianalysen. n = 3 för varje villkor. (E) Analys av iPS-CMs kontraktilitet med hjälp av ImageJ programvara. De röda och blå vektorerna anger de största respektive de minsta sammandragningarna. Skala bar, 100 μm. (F) Kvantitativ analys av kontraktsiteten iPS-CM med hjälp av kod. n = 3 för kontroll och n = 8 för ischemiskt tillstånd. Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet. För den statistiska analysen utfördes oparad tvåstjärtad Students t-test. *: p < 0,05, **: p < 0,01. : p < 0.0001. Denna siffra citeras från Wei et al.13 Vänligenklicka här för att visa en större version av denna figur.
Video 1: Differentierade celler visar spontan sammandragning under mikroskopet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Kompletterande figur 1: Kaplan-Meier-analys av procentuell andel prover utan spontan kontraktion. 50% av iPS-CM prover visade kontraktion på dag 20. På dag 30, 64,4% av proverna visade kontraktion. n = 83. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: Bedömning av hjärtkontraktilitet. Skalad kontraktilitet som erhållits genom att dividera kontraktilitet C med antalet analyspunkter (x, y) ritades för kontroll och ischemiska grupper före och efter exponeringen för 24 h hypoxi. n = 3 för kontroll och n = 8 för ischemiskt tillstånd. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3: Bedömning av innehållet i kardiomyocyter. Immunfärgning av hjärt markör protein på en 96 väl platta. Grön: cTnT, Blå: DAPI. Hastigheten för de differentierade cellerna beräknades till 20,7 ± 9,6% genom att dela arealen i cTnT-färgade regionen med den i DAPI-färgade regionen. Skalstång = 1 mm. n = 4 för kontrolltillstånd. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande Kodning Fil. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Forskare använder ofta laboratoriet små djurmodeller för att utföra IHD-experiment. Här utvecklade vi en cellkulturmodell av mänsklig IHD för att utföra sådana experiment.
Det största problemet en användare av detta protokoll kan möta är låg hastighet av differentierade kardiomyocyter. Flera steg bör vidtas med stor omsorg för att förbättra graden av framgångsrik differentiering: (a) vara skonsam vid pipettering eftersom cellerna lätt lossnar efter tillsättning av cellen dissociation enzymer reagens, b) om man lägger till Y-27632 ökar överlevnadsgraden för iPS-celler vid lösgöring, och c) tidpunkten för medelstora förändringar i början av differentiering bör vara exakt 48 h från varandra för att säkerställa kontrollerat uttryck för gener som är involverade i differentiering.
Angående de extracellulära matrisproteiner som används för beläggning av ytan på odlingsplattan, kan andra material än laminin vi använde i detta protokoll användas. Till exempel används Matrigel14,15, och gelatin16,17 för den matarfria underhållskulturen hos hiPSCs. Enligt Haraguchi et al., hiPSCs seedade på Matrigel var framgångsrikt differentieras till hjärt cell ark18.
Det finns ett antal föregående studier angående odlingsmodeller för sjukdomsmodellering med hjälp av kardiomyocyter som härrör från hiPSCs. När det gäller modellering av ischemi-reperfusion skada, manipuleringar av den cellulära miljön, såsom hyperkalemi, acidos, och laktat ackumulering, har införts19. Andra metoder är cell pelletering för att hindra syre diffusion20 och metabolisk hämning med hjälp av cyanid21. I det nuvarande protokollet uppnåddes cellskada genom relativt enkel metod, nämligen 24 h berövande av syre och näringsämnen. Man bör dock se till att överväga korrekta patofysiologiska processer av den ischemiska hjärtsjukdomen, eftersom det verkligen finns skillnader mellan sjukdomen in vivo och sjukdomsmodellen för det aktuella protokollet, såsom närvaron eller frånvaron av tredimensionell cellulär miljö och blod.
Angående den teknologiska aspekten av utvärderingen av kardiomyocytefunktionen rapporterade Toepfer et al. en MatLab-baserad algoritm för att bestämma sarkomerkontraktion och avslappning i hiPS-CMs22. Smith et al. rapporterade en avancerad metod för hög genomströmning elektrofysiologisk analys av retbara celler som härrör från hiPS-CMs, med hjälp av sofistikerade nanotopografiskt mönstrade multielektrod arrayer23,24. Fördelen med vårt protokoll är att det bara kräver konventionell programvara och förbrukningsvaror, såsom imageJ programvara och 96-brunnsplattor.
Med avseende på syrenivån i hjärtat, syretrycket i vener som når hjärtat tros vara 40 mmHg25. Enligt McDougal et al., det extracellulära syretrycket under hypoxi beräknas vara <12,8 mmHg26. Genom att tillämpa metoden av Rond o.a.27, beräknas syretrycket i odlingsmediet (salthalt: 35‰) under det hypoxiska tillståndet (2% syre) vid 37 °C som behandlats med det aktuella protokollet till 14,9 mmHg, vilket är högre än uppskattningen ovan. Intressant, Al-Ani et al. rapporterade att det finns en gradient av syre tryck i odlingsmediet, och syretrycket påverkas av celltyp, sådd densitet, och medelhög volym28. Vanligtvis är syrekoncentrationen längst ner på odlingsplattan där celler bor den lägsta. Därför skulle effekten av djup i odlingsmediet ytterligare minska det effektiva syretrycket nära hiPS-CMs. För att inducera tillräckliga skador på hiPS-CMs med hjälp av hypoxiskt tillstånd, måste noggrann uppmärksamhet ägnas åt djupet av medium och cellernas densitet.
Vår hiPS-CM-modell, som ligger mycket nära de fysiologiska tillstånden hos mänskliga hjärt myocyter, efterliknar med fördel mänsklig IHD. Djurmodellbaserade metoder inkluderar etiska, tekniska och akademiska frågor. Särskilt in vivo modeller kräver en avancerad teknik för mikrokirurgi för att uppnå reproducerbara data: t.ex., ocklusion av den främre fallande grenen av vänster kranskärl i gnagare3. HiPS-CM-modellen som beskrivs häri övervinner dessa kritiska hinder och ger en användbar, relevant och repeterbar plattform för hjärt-kärlsjukdom.
Vissa begränsningar bör dock noteras. En uppenbar skillnad mellan iPS-inducerad kardiomyocyter och normala kardiomyocyter är frånvaron av T-tubuli29, och vi inte inkludera humoral faktorer såsom vävnadsskador inducerad av leukocyter och aktivering av ett komplement system i vår studie. Dessutom bör graden av differentierade kardiomyocyter i denna modell (20,7 ± 9,6%, Kompletterande Figur 3) förbättras. Den nyligen publicerade publikationen av Halloin et al. beskriver en skalbar, kemiskt definierad metod för att inducera hiPS-CM renhet av >95% av kemiska WNT-vägmodulatorer utan krav på något urval av markörer30. Ändå är vår modell av mänskliga IHD relativt enkel och kliniskt tillämplig (t.ex. drog screening med hjälp av patient-härledda iPS celler). Vår modell är också en unik plattform för att ytterligare belysa mekanismer som ligger bakom IHDs.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av JSPS KAKENHI, Fonden för främjande av gemensam internationell forskning (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Författarna erkänner tacksamt Central Research Laboratory, Okayama University Medical School för hjälp av FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
| Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
| Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
| Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
| Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
| Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
| FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
| Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
| Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
| Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
| iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
| iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
| Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
| MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
| Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |
References
- Naghavi, M. Global Burden of Disease Self-Harm, C. Global, regional, and national burden of suicide mortality 1990 to 2016: systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. BMJ. 364, 94 (2019).
- Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. Mortality From Ischemic Heart Disease. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375 (2019).
- Oh, J. G., Ishikawa, K. Experimental Models of Cardiovascular Diseases: Overview. Methods in Molecular Biology. 1816, 3-14 (2018).
- Brodehl, A., et al. Human Induced Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Genetic Cardiomyopathies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), (2019).
- Garbern, J. C., et al. Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells via p53-Induced Quiescence. Circulation. , (2019).
- Horikoshi, Y., et al. Fatty Acid-Treated Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes Exhibit Adult Cardiomyocyte-Like Energy Metabolism Phenotypes. Cells. 8 (9), (2019).
- Hu, D., et al. Metabolic Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Inhibition of HIF1alpha and LDHA. Circulation Research. 123 (9), 1066-1079 (2018).
- Correia, C., et al. Distinct carbon sources affect structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 8590 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Tamargo, J., et al. Genetically engineered mice as a model for studying cardiac arrhythmias. Frontiers in Bioscience. 12, 22-38 (2007).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Wei, H., Wang, C., Guo, R., Takahashi, K., Naruse, K. Development of a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 520 (3), 600-605 (2019).
- Ghaedi, M., Niklason, L. E. Human Pluripotent Stem Cells (iPSC) Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 55-92 (2019).
- Hou, J., et al. Retaining mTeSR1 Medium during Hepatic Differentiation Facilitates Hepatocyte-Like Cell Survival by Decreasing Apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (4), 1533-1543 (2018).
- Yoshida, K., et al. Differentiation of mouse iPS cells into ameloblast-like cells in cultures using medium conditioned by epithelial cell rests of Malassez and gelatin-coated dishes. Medical Molecular Morphology. 48 (3), 138-145 (2015).
- Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods in Molecular Biology. 1340, 79-95 (2015).
- Haraguchi, Y., Matsuura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Simple suspension culture system of human iPS cells maintaining their pluripotency for cardiac cell sheet engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (12), 1363-1375 (2015).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro Models of Ischemia-Reperfusion Injury. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Strijdom, H., Genade, S., Lochner, A. Nitric Oxide synthase (NOS) does not contribute to simulated ischaemic preconditioning in an isolated rat cardiomyocyte model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 18 (2), 99-112 (2004).
- Cavalheiro, R. A., et al. Potent cardioprotective effect of the 4-anilinoquinazoline derivative PD153035: involvement of mitochondrial K(ATP) channel activation. PLoS One. 5 (5), 10666 (2010).
- Toepfer, C. N., et al. SarcTrack. Circulation Research. 124 (8), 1172-1183 (2019).
- Smith, A. S. T., et al. NanoMEA: A Tool for High-Throughput, Electrophysiological Phenotyping of Patterned Excitable Cells. Nano Letters. , (2019).
- Smith, A. S., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).
- Sitkovsky, M., Lukashev, D. Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors. Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).
- McDougal, A. D., Dewey, C. F. Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).
- Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. Chapter A6. Section 6.2. Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , Reston, VA. (2006).
- Al-Ani, A., et al. Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported. PLoS One. 13 (10), 0204269 (2018).
- Cadet, J. S., Kamp, T. J. A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).
- Halloin, C., et al. Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture. Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).
