Summary
Denne protokol beskriver et dynamisk kultursystem til fremstilling af kontrollerede størrelsesggreg aggregater af humane pluripotente stamceller og yderligere stimulerer differentiering i cerebellar organoider under kemisk definerede og feeder-fri betingelser ved hjælp af en engangsbioreaktor.
Abstract
Lillehjernen spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af balance og motorisk koordination, og en funktionel defekt i forskellige cerebellar neuroner kan udløse cerebellar dysfunktion. De fleste af de nuværende viden om sygdomsrelaterede neuronal fænotyper er baseret på postmortem væv, hvilket gør forståelse af sygdomsprogression og udvikling vanskelig. Dyremodeller og udødeliggjorte cellelinjer er også blevet brugt som modeller for neurodegenerative lidelser. Men de ikke fuldt ud opsummere menneskelige sygdomme. Humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) har et stort potentiale for sygdomsmodellering og udgør en værdifuld kilde til regenerative tilgange. I de seneste år, generation af cerebrale organoider fra patient-afledte iPSCs forbedret udsigterne for neurodegenerative sygdom modellering. Men, protokoller, der producerer et stort antal organoider og et højt udbytte af modne neuroner i 3D-kultur systemer mangler. Den protokol, der præsenteres, er en ny metode til reproducerbar og skalerbar generation af humane iPSC-afledte organoider under kemisk definerede betingelser ved hjælp af skalerbare engangsbioreaktorer, hvor organoider får cerebellaridentitet. De genererede organoider er karakteriseret ved ekspression af specifikke markører på både mRNA- og proteinniveau. Analysen af specifikke grupper af proteiner gør det muligt at detektionere forskellige cerebellar cellepopulationer, hvis lokalisering er vigtig for evalueringen af organoid struktur. Organoid kryosektring og yderligere immunstaining af organoid skiver bruges til at vurdere tilstedeværelsen af specifikke cerebellar cellepopulationer og deres rumlige organisation.
Introduction
Fremkomsten af humane pluripotente stamceller (KPC'er) udgør et fremragende værktøj til regenerativ medicin og sygdomsmodellering, fordi disse celler kan differentieres i de fleste celle slægter af den menneskelige krop1,,2. Siden deres opdagelse, PSC differentiering ved hjælp af forskellige tilgange er blevet rapporteret til at modellere forskellige sygdomme, herunder neurodegenerative lidelser3,4,5,6.
For nylig har der været rapporter om 3D-kulturer stammer fra kvikskranker, der ligner menneskelige cerebrale strukturer; disse kaldes hjerneorganoider3,,7,8. Generationen af disse strukturer fra både sunde og patientspecifikke kvikskranker giver en værdifuld mulighed for at modellere menneskelig udvikling og neuroudviklingsmæssige lidelser. Men de metoder, der anvendes til at generere disse velorganiserede cerebrale strukturer er vanskelige at anvende for deres store produktion. At producere strukturer, der er store nok til at opsummere væv morfogenese uden nekrose inde i organoider, protokoller stole på den oprindelige neurale engagement i statiske forhold, efterfulgt af indkapsling i hydrogels og efterfølgende kultur i dynamiske systemer3. Sådanne tilgange kan dog begrænse den potentielle opskalering af organoidproduktionen. Selv om der er gjort en indsats for at dirigere PSC differentiering til specifikke regioner i centralnervesystemet, herunder kortikale, striatal, midbrain, og rygmarv neuroner9,10,11,12, generation af specifikke hjerneregioner i dynamiske forhold er stadig en udfordring. Især er generationen af modne cerebellar neuroner i 3D-strukturer endnu ikke beskrevet. Muguruma et al. banebrydende generation af kultur betingelser, der opsummerer tidlig cerebellar udvikling13 og for nylig rapporteret en protokol, der giver mulighed for menneskelige embryonale stamceller til at generere en polariseret struktur, der minder om første trimester cerebellum7. Modningen af cerebellar neuroner i de rapporterede undersøgelser kræver imidlertid dissociation af organoider, sortering af cerebellar stamfader, og coculture med feeder celler i en monolayer kultur system7,14,15,16. Derfor er den reproducerbare generering af de ønskede cerebellar organoider til sygdomsmodellering under definerede betingelser stadig en udfordring forbundet med kultur og feeder kilde variation.
Denne protokol præsenterer optimale kulturbetingelser for 3D-udvidelse og effektiv differentiering af menneskelige kvikskranker i cerebellar-neuroner ved hjælp af enkeltbrugsaustielle hjulbioreaktorer (se tabel over materialer for specifikationer), i det følgende kaldet bioreaktorer. Bioreaktorer er udstyret med et stort lodret løbehjul, som i kombination med en U-formet bund giver en mere homogen forskydningsfordeling inde i beholderen, hvilket muliggør skånsom, ensartet blanding og partikelsuspension med reducerede omrøringshastigheder17. Med dette system kan der opnås form- og størrelsesstyrede celleaggreggre, hvilket er vigtigt for en mere homogen og effektiv differentiering. Desuden kan et større antal iPSC-afledte organoider genereres på en mindre besværlig måde.
Det vigtigste træk ved de organoider, som er 3D flercellede strukturer normalt dannet af stamceller, er selvorganisering af forskellige celletyper, der danner specifikke former som dem, der ses i human morfogenese18,19,20. Derfor er organoid morfologi et vigtigt kriterium, der skal evalueres under differentieringsprocessen. Kryosektion af organoider og yderligere immunstaining af organoid skiver med et bestemt sæt af antistoffer giver mulighed for rumlig visualisering af molekylære markører til at analysere celleproliferering, differentiering, cellepopulationidentitet og apoptose. Med denne protokol, ved immunstaining organoid kryosektioner, en indledende effektiv neurale engagement er observeret af 7th dag differentiering. Under differentiering observeres flere cellepopulationer med cerebellaridentitet. Efter 35 dage i dette dynamiske system, cerebellar neuroepithelium organiserer langs en apicobasal akse, med et apikale lag af prolifererende forfædre og basalt placeret postmitotiske neuroner. Under modningsprocessen, fra dag 35-90 af differentiering, forskellige typer af cerebellar neuroner kan ses, herunder Purkinje celler (Calbindin+), granulatceller (PAX6+/ MAP2+), Golgi celler (Neurogranin+), unipolar børste celler (TBR2+), og dyb cerebellar kerner projektion neuroner (TBR1+). Også, en ikke-betydelig mængde celledød er observeret i de genererede cerebellar organoids efter 90 dage i kultur.
I dette system, humane iPSC-afledte organoider modnes i forskellige cerebellar neuroner og overleve i op til 3 måneder uden behov for dissociation og feeder coculture, giver en kilde til humane cerebellar neuroner til sygdom modellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Passaging og vedligeholdelse af menneskelige iPC'er i monolagskultur
- Fremstilling af plader
- Kældermembranmatrixen (se Materialetabel)skal opoptælles ved 4 °C, og der tilberedes 60 μL aliquots. Nedfryser aliquots ved -20 °C.
- At pels brønde af en 6 godt plade, tø en aliquot af kælderen membran matrix på is. Når optøet tilsættes 60 μL til 6 ml DMEM-F12. Forsigtigt resuspendret ved pipetting op og ned.
- Der tilsættes 1 ml fortyndet kældermembranmatrixopløsning til hver brønd på en 6 brøndplade, og der inkuberes ved RT i mindst 1 time, før den passerer eller opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
- Videredeling af iPSC-kolonier med EDTA
- Vedligehold iPSCs i monolagskultur i 6 brøndplader i inkubatoren ved 37 °C, 95 % luftfugtighed og 5% CO2.
BEMÆRK: I denne protokol blev der anvendt tre forskellige humane iPSC-linjer: F002.1A.1321, human episomal iPSC-linje (iPSC6.2)22og kommercielt opnået iPS-DF6-9-9T.B (se tabel over materialer). - Før aflevering inkuberes de opbevarede plader (trin 1.1) ved stuetemperatur (RT) i 15 minutter, og mTesR1-mediet forberedes (tabel 1).
- Aspirere opløsningen fra pladen ved hjælp af en serologisk pipette, og tilsæt straks 0,5 ml mTeSR1-medium til hver brønd.
- Aspirere det brugte medium fra brønden indeholdende iPSCs og vask én gang ved hjælp af 1 ml 0,5 mM EDTA pr brønd.
- Der tilsættes 1 ml 0,5 mM EDTA til hver brønd og inkuberes ved RT i 5 min.
- Aspirere EDTA og fjerne cellerne fra brøndene ved forsigtigt at tilføje mTeSR1 medium og pipettere kolonierne ved hjælp af en P1000 mikropipette. Opsaml cellerne i et konisk rør.
BEMÆRK: Cellerne må ikke pipettes op og ned mere end 3x. - Der tilsættes 1 ml celleaffjedring (fortyndet 1:4) til hver brønd, så hver brønd indeholder 1,5 ml medium, efter at celleaffjedringen er tilsat. Returnere celler til inkubatoren ved 5% CO2, 37 °C.
- Udskift det brugte medie dagligt og passagen hver 3.
- Vedligehold iPSCs i monolagskultur i 6 brøndplader i inkubatoren ved 37 °C, 95 % luftfugtighed og 5% CO2.
2. Såning af humane iPSC'er i bioreaktoren
- Inkuber iPSC'er dyrket som monolag i mTeSR1 suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer Y-27632 (ROCKi). Tilsæt 1 ml suppleret medium til hver brønd fra en 6 brønd væv kultur plade og inkubere i 1 time ved 37 °C, 95% fugtighed, og 5% CO2.
BEMÆRK: ROCKi bruges til at beskytte dissocierede iPSCs mod apoptose23. - Efter 1 h inkubation, aspirere det brugte medium fra hver brønd og vask 1x med 1 ml 1× PBS per brønd.
- Der tilsættes 1 ml af celleafrivemediet (se materialetabel)til hver brønd på en 6 brøndplade, og inkuberes ved 37 °C i 7 minutter, indtil cellerne let løsner sig fra brøndene med let omrystning.
- Pipette celledeachmentsmediet op og ned med en P1000-mikropipette, indtil cellerne løsner sig og dissociate i enkelte celler. Tilsæt 2 ml komplet cellekulturmedium til hver brønd for at inaktivere enzymatisk fordøjelse og pipette cellerne forsigtigt ind i et sterilt konisk rør.
- Centrifuge ved 210 × g i 3 min og fjern supernatanten.
- Resuspend cell pellet i kultur medium (dvs. mTeSR1 suppleret med 10 μM ROCKi) og tælle iPSCs med et hæmocytometer ved hjælp af trypan blå farvestof.
- Frø 15 × 106 enkeltceller i bioreaktoren (maksimalt volumen på 100 ml) med 60 ml mTeSR1 suppleret med 10 μM ROCKi ved en slutcelletæthed på 250.000 celler/ml.
- Isætning af beholderen med iPSC'erne i den universelle basisenhed, der er anbragt i inkubatoren ved 37 °C, 95 % fugtighed og 5 % CO2.
BEMÆRK: Bioreaktorens omrøring opretholdes i 24 timer ved at indstille den universelle basisenhedskontrol til 27 omdr./min. for at fremme iPSC-aggregering.
3. Differentiering og modning af humane iPSC-afledte aggregater i cerebellar organoider
- Definer dagen for enkeltcellesåning som dag 0.
- På dag 1 indsamles 1 ml af iPSC-aggregatprøven ved hjælp af en serologisk pipette. Bioreaktoren under omrøring bevares som før ved at placere den universelle basisenhed sammen med den bioreaktor, der indeholder aggregaterne, i et sterilt flow, før prøven opsamler. Plade celle suspension i en ultra-lav vedhæftet fil 24 godt plade. Kontroller, at iPSC-afledte aggregater dannes.
- Ansk af dem med et optisk mikroskop ved hjælp af en samlet forstørrelse på 40x eller 100x for at måle den samlede diameter.
- Mål området for aggregaterne i hvert billede ved hjælp af FIJI-software.
- Vælg "Analysér | “ Indstil målinger" fra menulinjen, og klik på "Område" og "OK".
- Vælg "Fil | Åbn" fra menulinjen for at åbne en gemt billedfil. Vælg det stregvalgsværktøj, der vises på værktøjslinjen, og opret en lige linje over skalalinjen, der vises i billedet. Vælg "Analysér | Indstil skalering" fra menulinjen.
- I "Kendt afstand"tilsættes flade af billedets skalalinje i μm. "Længdeenhed " defineressom μm. Klik på "Global" for at vedligeholde indstillingerne og "OK". Vælg Oval markering på værktøjslinjen.
- For hver samlet afgrænse området med det ovale værktøj. Vælg "Analysér | Mål". Beregn deres diameter baseret på målt område, i betragtning af at aggregater er omtrent sfæriske ved hjælp af
med A som det samlede område.
- Når den gennemsnitlige diameter af aggregaterne er 100 μm, erstatte 80% af det brugte medium med frisk mTeSR1 uden ROCKi. Når aggregaterne når op på 200-250 μm i diameter, erstattes alle brugt medium med gfCDM (tabel 1), så organoiderne sættes til bunds i bunden af bioreaktoren.
BEMÆRK: Hvis den gennemsnitlige samlede diameter overstiger 350 μm, bør differentieringsprotokollen ikke startes. Gentag såning af enkelte celler. Generelt tager det omkring 1 dag for den samlede at nå en gennemsnitlig diameter på 100 μm. - Bioreaktoren, der indeholder aggregaterne, indsættes i den universelle basisenhed, der er placeret i inkubatoren ved 37 °C, 95 % fugtighed og 5 % CO2.
- Reducer bioreaktormetrionen til 25 omdr./min.
- Gentag trin 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 2 for at evaluere den samlede diameter. Der tilsættes 30 μL FGF2 (slutkoncentration, 50 ng/ml) og 60 μL SB431542 (slutkoncentration, 10 μM) til 60 ml gfCDM-differentieringsmedium (tabel 1). Udskift alle brugt medium fra bioreaktoren med den supplerede gfCDM. Gentag trin 3.6.
BEMÆRK: SB431542 er afgørende for at hæmme mesendodermal differentiering, inducerende neuraldifferentiering24. FGF2 bruges til at fremme kaudaliseringen af det neuroepithelielle væv25. - Gentag trin 3.2, 3.3, 3.4 og 3.8 på dag 5.
BEMÆRK: Den samlede størrelse bør øges under differentieringsprotokollen. Diameteren er dog kun kritisk, når differentieringen starter, fordi denne parameter kan påvirke effekten af differentiering. - Gentag trin 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 7. Fortyndet FGF2 og SB431542 til 2/3: Der tilsættes 20 μL FGF2 og 40 μL SB431542 til 60 ml gfCDM-differentieringsmedium. Udskift alle brugt medium fra bioreaktoren med suppleret gfCDM. Gentag trin 3.6 og øge bioreaktor agitation til 30 rpm.
- Gentag trin 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 14. Der tilsættes 60 μL FGF19 (slutkoncentration, 100 ng/ml) til 60 ml gfCDM-differentieringsmedium. Udskift alle brugt medium fra bioreaktoren med gfCDM suppleret med FGF19. Gentag trin 3.6.
BEMÆRK: FGF19 bruges til at fremme polarisering af midten af hindhjernen strukturer26. - Gentag trin 3.2, 3.3, 3.4 og 3.11 på dag 18.
- Gentag trin 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 21. Alle brugte medier er erstattet af bioreaktoren med komplet neurobasalt medium (tabel 1). Gentag trin 3.6.
BEMÆRK: Neurobasal medium er et basalt medium, der anvendes til at opretholde den neuronale cellepopulation inden for organoid7. - Gentag trin 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 28. Der tilsættes 180 μL SDF1 (endelig koncentration, 300 ng/ml) til 60 ml komplet neurobasalt medium. Udskift alle brugt medium fra bioreaktoren med komplet neurobasal medium suppleret med SDF1. Gentag trin 3.6.
BEMÆRK: SDF1 bruges til at lette tilrettelæggelsen af forskellige cellelag27. - Gentag trin 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 35. Alle brugte medier er erstattet fra bioreaktoren med komplet BrainPhys-medium (tabel 1). Gentag trin 3.6.
BEMÆRK: BrainPhys er et neuronalt medium, der understøtter synaptisk aktive neuroner28. - Erstat 1/3 af det samlede volumen hver 3.
4. Fremstilling af organoider til kryosektion og immunhisemitri
- Indsamling af organoider til immunstaining
- Der udtages 1 ml prøve af mediumholdige organoider med en serologisk pipette fra bioreaktoren til et 15 ml konisk rør.
BEMÆRK: Organoider bør indsamles på forskellige tidspunkter for at vurdere effekten af differentiering, herunder dag 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 og 90. - Fjern supernatanten og vask én gang med 1 ml 1× PBS.
BEMÆRK: Organoiderne må ikke centrifugeres. Lad organoiderne bosætte sig i bunden af røret ved tyngdekraften. - Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA). Inkuberes ved 4 °C i 30 min. Fjern den brugte PFA og tilsæt 1 ml 1× PBS.
- Organoiderne opbevares i 1 ml 1× PBS ved 4 °C, indtil de behandles til krysinfektion.
BEMÆRK: Organoiderne opbevares i 1x PBS i højst 1 uge efter fikseringen.
- Der udtages 1 ml prøve af mediumholdige organoider med en serologisk pipette fra bioreaktoren til et 15 ml konisk rør.
- Fremstilling af organoider til krysinfektion
- Fjern supernatanten fra de lagrede organoider. Der tilsættes 1 ml 15 % saccharose (w/v, fortyndet i 1× PBS), blandes godt ved forsigtig hvirvlende og inkuberes natten over ved 4 °C.
- Der klargøres en opløsning på 15 % saccharose/7,5 % gelatine (tabel 2), og der vedligeholdes ved 37 °C under præparatet for at undgå gelatine til størkne.
- Fjern 15% saccharoseopløsningen, tilsæt 1 ml 15% saccharose/7,5% gelatine til organoiderne, og bland hurtigt ved blid hvirvlende. Inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Tilsæt 15% saccharose/7,5% gelatine opløsning til en plastbeholder op til halvdelen af sit volumen. Vent på størkning på RT.
- Efter 1 h inkubation, omhyggeligt placere en saccharose / gelatine dråbe, der indeholder organoider på størknede gelatine med en Pasteur pipette. Lad det størkne på RT i ca 15 min. Sørg for at undgå bobledannelse.
- Placer 15% saccharose/7,5% gelatine oven på organoiderne, indtil beholderen er fyldt. Vent på fuldstændig størkning på RT.
- Efter størkning inkuberes 20 min ved 4 °C.
- Skær gelatine i en terning, der indeholder organoids i midten og fastsætte gelatine terning på et stykke pap med en dråbe O.C.T. sammensatte.
- Placer 250 ml isopentan i en 500 ml kop og fyld en passende beholder med flydende nitrogen. Brug snævle og tykke handsker, omhyggeligt placere koppen indeholder isopentan på overfladen af flydende nitrogen og afkøles isopentane til -80 °C.
- Når -80 °C er nået, skal gelatineknalningen i koppennentan, indtil den fryser, og temperaturen holdes ved -80 °C. Afhængigt af størrelsen af terningen, kan det tage 1-2 min.
BEMÆRK: Undgå temperaturer under -80 °C eller overdreven frosttid, da det kan forårsage revner i terningen. - Når frosset, hurtigt gemme gelatine terningen på -80 °C og opbevares indtil kryosektion.
- Kryosektion af organoider
- Tænd for kryostaten, og definer både prøven (OT) og cryochamber (CT) temperaturer ved -25 °C.
- Når begge temperaturer stabiliseres, fastgør gelatineknalningen, der indeholder organoiderne på prøven, ved hjælp af O.C.T. forbindelse.
- Definer sektionstykkelse ved 12 μm.
- Skær terningen og saml 3-4 skiver på vedhæftningsmikroskopdias (se Tabel over materialer).
- Opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Immunstaining af organoider skiver
- Placer mikroskopdias, der indeholder organoidsektioner, i en koprende krukke med 50 ml forvarmet 1x PBS, der holder op til 10 objektglas tilbage mod bagsiden.
BEMÆRK: Alle organoidsektioner skal nedsænkes med væske. - Inkuberes i 45 minutter ved 37 °C for at degelatinisere objektglas.
- Vask 1x med 50 ml 1× PBS i 5 min. på RT: Overfør objektglassene til en koplingskrukke, der indeholder frisk 1× PBS.
- Overfør objektglassene til en koplingskrukke, der indeholder 50 ml frisklavet glycin (tabel 2), og inkuberes i 10 min. ved RT.
- Overfør objektglassene til en koplingskrukke, der indeholder 50 ml 0,1 % triton ( tabel2), og permeabilize i 10 minutter ved RT.
- Vask med 1× PBS i 5 min 2x.
- Opbered immunstainingskålen med 3 mm papir dyppet i 1× PBS. Tør rutsjebaner med et væv rundt om skiverne og læg dem på 3 mm papir. Med en Pasteur pipette dækkes hele diasfladen med blokerende opløsning (tabel 2) med ~0,5 ml pr. rutsjebane. Inkuber i 30 min på RT.
- Fjern overskydende blokerende opløsning og tør dias med et væv rundt om skiverne. 50 μL af det primære antistof (tabel 3) fortyndes ved blokerende opløsning over sektionerne og dækslerne med dækslerne. Læg skiverne i en tidligere tilberedt immunstainingskål. Inkuber natten over ved 4 °C.
- Overfør objektglassene til en koplingskrukke med 50 ml TBST (tabel 2), lad dækslerne falde, og vask med TBST i 5 min 3x.
- Der skal være 50 μL af det sekundære antistof, der fortyndes ved blokerende opløsning over sektionerne, og dæk dem med dækslerne. Læg skiverne i den tidligere tilberedte immunstainingskål. Inkuber i 30 min på RT, beskyttet mod lys.
- Overfør diasene til en koplingskrukke igen og vask med 50 ml TBST i 5 min 3x.
- Tør rutsjebanerne med et væv rundt om skiverne og læg skiverne i en tidligere forberedt immunstainingskål. Tilsæt 0,5 ml DAPI-opløsning over hele diasoverfladen med en Pasteur pipette. Inkuber i 5 min på RT.
- Gentag trin 4.4.9.
- Tør forsigtigt rutsjebanerne med et væv. Tilsæt 50 μL montering medium dråbe ved slip langs diaset og derefter forsigtigt sænke en coverslip på hver slide, lidt bøje det for at undgå bobler.
- Placer mikroskopdias, der indeholder organoidsektioner, i en koprende krukke med 50 ml forvarmet 1x PBS, der holder op til 10 objektglas tilbage mod bagsiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen blev indledt ved at fremme cellesammenlægning ved hjælp af 0,1 L bioreaktorer (Figur 1A). Enkeltcelleinokulering af iPSC'erne blev udført med 250.000 celler/ml seedet i 60 ml medium med en omrøringshastighed på 27 omdrejninger i minuttet. Dette blev defineret som dag 0. Efter 24 timer dannede cellerne effektivt sfæroidformede aggregater (dag 1, figur 1B), og morfologien var velholdt indtil dag 5 med en gradvis forøgelse af størrelsen, hvilket viser en høj grad af homogenitet i den samlede morfologi og størrelse over tid. (Figur 1B). En kvantitativ analyse ved mikroskopi afslørede også normal fordeling af aggregatstørrelser efter dag 1 (Figur 1C). Den samlede størrelse er en vigtig fysisk parameter, der kan få cellerne til at differentiere sig mod forskelligeslægter 29,30. Af denne grund, baseret på den samlede størrelse rapporteret i tidligere undersøgelser for at fremkalde en effektiv neurale31,32 og cerebellar engagement21, de genererede aggregater blev opretholdt i mTeSR1 medium på 25 rpm, indtil de nåede den ønskede diameter før du begynder differentiering (~ 200 μm). På dag 2 var gennemsnitsdiameteren 221,0 ± 54,4 μm (gennemsnitlig ± SD) for F002.1A.13 cellelinjen og 212,1 ± 42,1 μm for iPSC6.2 cellelinjen. Som sådan opnåede begge cellelinjer den optimale samlede størrelse på dette tidspunkt (Figur 1C).
Definition af den dag, hvor såning af iPSCs blev udført som dag 0, på dag 2, efter at have opnået den ønskede samlede diameter, neurale engagement blev induceret ved samtidig at bruge SB431542, FGF2, og insulin, fremme neuroectodermal differentiering, samt en moderat kaudalisering er nødvendig for midten af hindin mønstre. Derefter blev FGF19 og SDF1 føjet til kulturen på henholdsvis dag 14 og 28 for at fremme generationen af forskellige cerebellar-forfædre. For de første dage af neurale induktion, en rotation hastighed på 25 rpm blev brugt, som blev øget til 30 rpm efter 7 dage for at undgå ophobning og sammenklumpning af større aggregater (Figur 2A). Under differentiering, organoider viste en mere udtalt epitelisering ligner neurale rør-lignende strukturer med luminal rum (Figur 2B). Desuden viste evalueringen af organoiddiameterfordelingen en homogen størrelsesfordeling under den oprindelige cerebellar-forpligtelse indtil dag 14 (figur 2B).
Immunfluorescens analyse understøtter, at en effektiv neurale engagement i iPSC-afledte organoider er allerede opnået ved dag 7 af differentiering efter at have tilføjet FGF2 og SB431542. Kryosektionerne af organoider afslørede mange strukturer, der minder om neuralrørsfarvning for PAX6 og NESTIN, hvor de fleste celler i organoiderne udtrykker stammarkør NESTIN på dag 7 og 14 af differentiering (Figur 2C). Efterfølgende fremmede FGF19 og SDF1 produktionen af kontinuerligt voksende progenitorlag (PAX6+) og der blev opnået en effektiv neuronal differentiering, som det fremgår af udtrykket TUJ1, neuron-specifik klasse III beta-tubulin, ved dag 21 og 35 (Figur 2C). Desuden blev der observeret en effektiv cerebellardifferentiering efter 21 dage i 0,1 L VW-bioreaktorerne, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af to forskellige cellepopulationer: granulatcelleforædeler (BARLH1+ celler, Figur 3A) ) og Purkinje-celleforædninger (OLIG2+ celler, figur 3B). Efter 35 dage i kultur, forskellige cellepopulationer inden for organoids syntes at være organiseret i forskellige lag. Der blev observeret forskellige fladgegeformede strukturer i organoiderne med BARHL1+ dorsale cerebellar-stamfædre som et kontinuerligt lag på den overfladiske side af organoid (Figur 3C,D) og SOX2+ i luminalområdet af disse ovale strukturer (Figur 3D). Desuden syntes TUJ1+ nyfødte neuroner at migrere mod overfladen og genetablere radialjusteringen på organoidets ydre overflade (Figur 3E).
Efter generationen af cerebellar stamfader, yderligere modning blev fremmet ved hjælp af BrainPhys medium28 suppleret med neurotrofiske faktorer BDNF og GDNF. Immunfluorescensfarvning af organoid kryosektioner blev brugt til at påvise forskellige undertyper af cerebellar neuroner. Purkinje celler, GABAergic neuroner udtrykke calcium-bindende protein calbindin (CALB, Figur 3F),blev påvist i cerebellar organoids efter modning protokol. Desuden blev en anden større cerebellar neuronal type, granulceller, identificeret som en delmængde af celler, der sameksisterer PAX6 og MAP2 (Figur 3G). Interessant, en pulje af PAX6+ forfædre ikke udtrykker MAP2 blev opretholdt indtil 80 dages differentiering. Andre typer cerebellar neuroner blev også påvist, herunder unipolar børste celler udtrykker TBR2 (Figur 3H), og dyb cerebellar kerner projektion neuroner udtrykker TBR1 (Figur 3I). Ud over effektiv cerebellar differentiering og modning, denne 3D dynamisk kultur system ved hjælp af PBS 0,1 L VW bioreaktorer tilladt organoider at forblive levedygtige i op til 90 dage, uden væsentlig celledød og nekrose (Figur 3J).
Figur 1: Generering af størrelsesstyrede aggregater ved hjælp af skalerbare bioreaktorer. (A) Bioreaktorens designfunktioner. (B) Brightfield fotomikrograf viser aggregater fra to forskellige iPSC linjer på dag 1, 2 og 5. Skalabar = 100 μm. cC) Størrelsesfordelingen af flydende aggregater fra forskellige iPSC-linjer i bioreaktorerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Generering af humane iPSC-afledte organoider med 0,1 L-bioreaktorer. AA) Skematisk repræsentation af kulturproceduren for at tilskynde til differentiering af iPC'er til cerebellar organoids. Cellerne blev seedet med en massetæthed på 250.000 celler/ml, og en omrøringshastighed på 27 omdrejninger i minuttet blev anvendt til at fremme cellesammenlægning. I løbet af de første dage af differentiering, aggregater blev opretholdt på en omrøring hastighed på 25 rpm. Bagefter, for at undgå ophobning af større aggregater, agitation hastighed blev øget til 30 rpm. bB) Karakterisering af organoid form og størrelse. Brightfield fotomikrografer, der viser iPSC-afledte organoider under cerebellardifferentiering i 0,1 L VW-bioreaktorerne. Skalabar = 100 μm. Fordelingen af organoiddiametre viser, at kulturen opretholdt homogene organoids størrelser langs differentieringsprotokollen. (C)Effektiv neural induktion i iPSC-afledte organoider. Immunfluorescens for NESTIN, PAX6 og TUJ1 under cerebellardifferentiering. Skalabar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Effektiv cerebellardifferentiering og modning i humane iPSC-afledte organoider. (A-E) Effektiv cerebellar engagement. Immunstaining-analyse for BARHL1-, SOX2-, OLIG2-, NCAD- og TUJ1-markører ved angivne tidspunkter i cerebellardifferentieringsprotokollen. (F-I) Effektiv modning af humane iPSC-afledte cerebellar organoider. Immunfluorescens, der viser forskellige typer cerebellar neuroner, herunder Purkinje celler (CALB, F), granulatceller (PAX6 og MAP2, G), unipolar børste celler (TBR2), og dyb cerebellar kerner fremskrivninger neuroner (TBR1). jJ) Høj celle levedygtighed efter cerebellar modning. Levende/døde (calcein-AM, grøn og propidium iodid, rød) farvning af organoider viste høj cellelevedygtighed og ingen tegn på nekrotiske områder efter 80 dage i bioreaktorerne. Skalabar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Forberedelse af medier |
mTeSR1 Endeligt volumen: 500 ml |
1. Tø mTeSR1 5× supplement ved stuetemperatur (RT) eller ved 4 °C natten over og blandes med basalt medium 2. Opbevar hele mTeSR1 medium ved 4 °C i op til 2 uger eller forberede 40 ml aliquots og opbevares ved -20 °C 3. Forvard komplet mTeSR1 ved RT før brug |
|
gfCDM (vækstfaktorfrit kemisk defineret medium) Endeligt volumen: 60 ml |
30 ml Skinke's F12 30 ml IMDM 600 μL kemisk defineret lipidkoncentrat (1 % v/v) 2,4 μL monothioglycerol (450 μM) 30 μL apo-transferrin (lageropløsning ved 30 mg/ml i vand, endelig koncentration: 15 μg/ml) 300 mg krystalliseringsrens renset BSA (5 mg/ml) 42 μL insulin (koncentrationen i bestanden ved 10 mg/ml, endelig koncentration: 7 μg/ml) 300 μL P/S (0,5 % v/v, 50 U/ml penicillin/50 μg/ml streptomycin) |
|
|
Neurobasal Endeligt volumen: 60 ml |
60 ml neurobasalt medium 600 μL N2 supplement 600 μL glutamax I 300 μL P/S (0,5 % v/v). |
|
|
Komplet BrainPhys Endeligt volumen: 60 ml |
60 ml hjernefys 1.2 ml NeuroCult SM1 Neuronal Supplement 600 μL N2-tillæg 12 μL BDNF (endelig koncentration: 20 ng/ml) 12 μL GDNF (endelig koncentration: 20 ng/ml) 300 μL Dibutyryl-cAMP (beholdningskoncentration: 100 mg/ml i vand, endelig koncentration: 1 mM) 42 μL ascorbinsyre (beholdningskoncentration: 50 μg/ml i vand, endelig koncentration: 200 nM) |
|
| Lagerløsninger af vækstfaktorer og små molekyler |
Grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF/FGF2) Koncentrationen af bestand: 100 μg/ml |
1. Rekonstitueres i 5 mM Tris, pH 7,6, i en koncentration på 10 mg/ml 2. Fortyndes med 0,1 % BSA i PBS (v/v) til en endelig lagerkoncentration på 100 μg/ml |
|
Stromal celleafledt faktor 1 (SDF1) Koncentrationen af bestand: 100 μg/ml |
1. Rekonstitueres i vand i en koncentration på 10 mg/ml 2. Fortyndes med 0,1 % BSA (v/v) i PBS til en endelig lagerkoncentration på 100 μg/ml. |
|
|
Hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) Koncentrationen af bestand: 100 μg/ml |
||
|
Gliacelle-afledt neurotrofisk faktor (GDNF) Koncentrationen af bestand: 100 μg/ml |
||
|
Fibroblast vækstfaktor 19 (FGF19) Koncentrationen af bestand: 100 μg/ml |
1. Rekonstitueret i 5 mM natriumphosphat, pH 7.4, i en koncentration på 10 mg/ml 2. Fortyndes med 0,1 % BSA i PBS (v/v) til en endelig lagerkoncentration på 100 μg/ml |
|
|
ROCK-hæmmer Y-27632 Aktiekoncentration: 10mM |
Rekonstitueres i DMSO i en koncentration på 10 mM. | |
|
SB431542 Aktiekoncentration: 10mM |
||
|
Insulin Koncentrationen af aktier: 10 mg/ml |
1. Rekonstituere 10 mg insulin i 300 μL på 10 mM NaOH 2. Tilsæt forsigtigt 1 M NaOH, indtil opløsningen bliver klar gennemsigtig 3. Fyld til 1 ml med sterilt vand. |
Tabel 1: Stock løsninger og medier forberedelse. Opført er alle de komponenter og mængder, der anvendes til at forberede medierne til iPSCs vedligeholdelse og differentiering protokol, samt lagerløsninger af vækstfaktorer og små molekyler. For lagerløsninger er alle lagerkoncentration og protokoller for rekonstitution opført.
|
Gelatine/saccharose Endelig koncentration: 7,5%/15% w/w |
1. Vejer 15 g saccharose og 7,5 g gelatine i en steril Schott-glasflaske og blandes godt 2. Forvarsyd PBS 1× ved 65 °C 3. Tilsæt forvardet PBS 1× til en endelig vægt på 100 g og bland godt 4. Placer Schott-glasflasken i en varmeplade ved 65 °C, og ryst, indtil gelatinen smelter 5. Inkuber ved 37 °C, indtil opløsningen stabiliseres |
|
Glycin Endelig koncentration: 0,1 M |
Der tilsættes 0,37 g glycin til 50 ml frisklavet PBS 1×. |
|
Triton-løsning Endelig koncentration: 0,1 % m/v |
1. Forbered en 10 % Triton X-100 lager: 5 g Triton X-100 i 50 ml PBS 1× 2. Tilsæt 0,5 ml Triton X-100 lager til 50 ml PBS 1×. |
|
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,05 % m/v Tween-20 |
20 ml Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 ml Tween-20 (10 % lager: 5 g Tween-20 i 50 ml vand) Fyld til 1 L med vand. |
| Blokeringsløsning | Der tilsættes 5 ml føtalt kvægserum (FBS, slutkoncentration: 10 % v/v) til 50 ml TBST. |
| DAPI-løsning | Der tilsættes 15 μL DAPI-lageropløsning (1 mg/ml) til 10 ml afstileret vand |
| Mowiol | 1. Tilsæt 2,4 g Mowiol til 6 g g glycerol og ryst i 1 time i en forvarmet plade ved 50 °C 2. Tilsæt 6 ml destilleret vand og ryst i 2 timer 3. Tilsæt 12 ml Tris 200 mM (pH 8,5) og ryst i 10 min 4. Centrifuge ved 5.000 × g i 15 min. 5. Aliquot og opbevares ved -20 °C. |
Tabel 2: Opløsninger til fremstilling af organoider til kryosektion og immunstaining. Opført er alle de komponenter og mængder, der anvendes til at forberede de opløsninger, der anvendes til fremstilling af organoider til kryosektion og immunstaining.
| Antistof | Værtsarter | Fortynding |
| BARHL1 | Kanin | 1/500 |
| CALBINDIN | Kanin | 1/500 |
| KORT2 | Musen | 1/1000 |
| N-CADHERIN | Musen | 1/1000 |
| NESTIN | Musen | 1/400 |
| OLIG2 | Kanin | 1/500 |
| PAX6 | Kanin | 1/400 |
| SOX2 | Musen | 1/200 |
| TBR1 | Kanin | 1/200 |
| TBR2 | Kanin | 1/200 |
| TUJ1 | Musen | 1/1000 |
Tabel 3: Primære antistoffer. De primære antistoffer, klon, og optimeret fortyndinger anvendes til immunstaining er opført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behovet for store celletal samt definerede kulturbetingelser for at generere specifikke celletyper til lægemiddelscreening og regenerativ medicinapplikationer har været drivkraften bag udviklingen af skalerbare kultursystemer. I de seneste år, flere grupper har rapporteret den skalerbare generation af neurale forfædre og funktionelle neuroner32,33,34, giver betydelige fremskridt i udviklingen af nye modeller for neurodegenerative lidelser. Ikke desto mindre mangler der stadig en sammensummering af visse kritiske hændelser i forbindelse med embryonal udvikling, og vedligeholdelsen af de genererede funktionelle neuroner i suspension i lange perioder er endnu ikke opnået34. Præsenteret her er en dynamisk 3D kultur system i stand til at generere iPSC-afledte neurale organoider med cerebellar identitet, og yderligere fremme modning i funktionelle cerebellar neuroner under kemisk definerede og feeder-fri betingelser i dynamisk kultur.
Før du starter cerebellar differentiering, er det afgørende at opretholde kvaliteten af de menneskelige iPSCs. For ikke at kompromittere differentieringen bør der således ikke udføres mere end tre passager af iPSC'er fra optøning til bioreaktorinokulering. Et vigtigt skridt i differentieringsprotokollen er at evaluere den samlede størrelse. Den samlede størrelse spiller en afgørende rolle for at opnå differentiering i retning af en specifik cellelinje29. Udover det, er der en minimumsstørrelse tærskel, der synes at favorisere differentiering35. Som allerede rapporteret, den optimale iPSC-afledte samlede diameter til at fremme en effektiv neurale engagement31,32 og cerebellar differentiering21 er en ~ 200 μm diameter.
Derudover, i denne dynamiske protokol, den agitation hastighed, der anvendes i de første dage af kulturen er afgørende for at kontrollere den samlede diameter og neurale induktion. Kulturen startede ved 27 omdrejninger i minuttet, hvilket er tilstrækkeligt til at fremme iPSC-aggregering og undgå dannelse af større aggregater (diametre over 350 μm bør undgås). Den omrøring, der anvendes til at fremme cellesammenlægning efter enkeltcellesåning, kan øges til 30 omdr./min., uden at det påvirker cellernes levedygtighed. højere omrøringshastigheder forventes dog at producere mindre aggregater. Afhængigt af iPSC-linjen, 24 timer efter cellesåning med 27 o/min., forventes der to forskellige scenarier: de dannede aggregater har mindre diametre (<200 μm) eller har nået en række størrelser mellem 200-300 μm. Hvis aggregaterne er større end 350 μm ved 24 timer efter cellesåning, bør differentiering ikke udføres, og cellesåningen bør gentages, fordi differentieringens effektivitet vil være meget lav. Hvis aggregaterne er mindre end 200 μm, skal det brugte medium udskiftes med iPSC-vedligeholdelsesmediet, og omrøringshastigheden reduceres til 25 omdr./min. Med denne justering forventes den samlede diameter at stige fra dag 1 til dag 2, sandsynligvis på grund af sammenlægningen af individuelle aggregater, der fremmes af faldet i omrøringshastigheden. I tilfælde af aggregater med størrelser mellem 200-300 μm, bør det brugte medium erstattes med differentiering medium, og neurale induktion med FGF2 bør startes efter 2 dage i kultur. På dette tidspunkt bør omrøringshastigheden også reduceres en smule for at forhindre overdreven celledød, fordi cellerne er mere følsomme over for forskydningsstress ved tilstedeværelse af differentieringsmedium. Derudover kan populationens homogenitet analyseres ved hjælp af variationskoefficienten (CV), som måler variabiliteten ved at korrelere standardafvigelsen med middelværdi af samlede diametre i henhold til ligningen
hvor δ repræsenterer standardafvigelsen for den samlede diameter, og μ er den gennemsnitlige diameter. I dette dynamiske system var det observerede gennemsnitlige CV 12,5 ± 3,3% (gennemsnitlig ± SD) for F002.1A.13 cellelinje og 19,0 ± 0,37% for iPSC6.2 cellelinjen på dag 2. I dette system forventes der således en homogen størrelsespopulation med et CV på under 0,2 (< 20 % af variationen). Efter 7 dages differentiering varierede den gennemsnitlige samlede diameter fra 300-360 μm, og omrøringshastigheden blev forhøjet til 30 omdrejninger i minuttet for at forhindre aggregater til at slå sig ned i bunden af 0,1 L VW-bioreaktoren.
Differentieringen af cerebellar organoids indtil dag 35 og analysen af den samlede størrelse under statiske forhold blev for nylig rapporteret21. Forfatterne viste, at 3D-aggregater dannet og vedligeholdt i plader (f.eks Aggrewell) indtil dag 7 af differentiering var homogene i størrelse og form21. Men efter overførsel af aggregater til ultra-lav vedhæftet fil 6 godt kultur plader, aggregaterne begyndte at variere i størrelse og morfologi21. På dag 35 under statiske forhold nåede nogle af 3D-aggregaterne 1.000 μm for forskellige cellelinjer, hvilket begrænsede udbredelsen af næringsstoffer og ilt. I modsætning hertil nåede aggregater ved hjælp af vores dynamiske forhold ikke mere end 800 μm i diameter om dag 35, med forbedret masseoverførsel på grund af den konstante omrøring af mediet fremmes af det lodrette hjul. Desuden blev de samlede størrelser opretholdt indtil slutningen af modningsprocessen, hvilket viste en samlet diameter på 646,6 ± 104,2 μm ved dag 90, den længste kultur udført i 0,1 L VW bioreaktorer.
Effektiv cerebellar induktion blev induceret ved sekventiel tilsætning af SB431542, FGF2, FGF19 og SDF1 i dette 3D dynamiske system. Protokollen starter med kombinationen af SB431542, som er en transformerende vækstfaktor beta (TGF-ß)-receptor blokker, der hæmmer mesendodermal differentiering, og FGF2, som har en stor effekt i årsagssammenhængen af neuroepithelial væv25. Derfor er tilsætning af disse to molekyler i løbet af de første dage af kulturen afgørende for at fremme celle differentiering til midten af hindhjernen, det område, der giver anledning til cerebellar væv. Efter indledende induktion til midten af hindhjernvæv, er det nødvendigt at tilføje FGF19 for at fremme den spontane generation af mid-hindbrain strukturer med dorsal-ventral polaritet, samt generering af forskellige cerebellar stamfader36,26. SDF1 letter tilrettelæggelsen af forskellige lag af cerebellar stamfader, som det ses på udviklingsstadiet, hvor cerebellar neurogeneseforekommer 27. Indtil dag 35, kan disse molekyler fremme tilrettelæggelsen af cerebellar organoids, der kan opsummere menneskelige cerebellar udvikling, hvilket svarer til den første trimester cerebellum. Efter organiseringen af cerebellar stamfader i forskellige lag, en defineret neuronal medium blev brugt til at fremme deres modning28. Andre medier, der anvendes til at opretholde neuronale celler kunne også testes, men lavere effektivitet forventes. Således, i denne protokol, BrainPhys blev brugt til at fremme differentiering af cerebellar-begået celler i cerebellar neuroner, fordi det er blevet rapporteret til bedre at efterligne den sunde neuronale miljø og til at støtte neurofysiologiske aktivitet af de genererede neuroner28.
Ved hjælp af disse dynamiske forhold, en mere effektiv diffusion af næringsstoffer, ilt, og vækstfaktorer kan opnås. Men nogle begrænsninger er forbundet med den agitation, der anvendes i differentieringsprotokollen. Nogle forskydningsstress kan indføres ved agitation proces, som kan påvirke overlevelse, spredning, og differentiering af celler. Derfor skal kulturen overvåges nøje under modningstrinnet, hvor cellerne er mere følsomme.
Differentieringen af cerebellar organoider, der minder om udvikling af human embryonal cerebellar , er allerede blevet rapporteret7. Men yderligere modning af disse embryonale cerebellar organoider i cerebellar neuroner ved hjælp af 3D-kulturer er fortsat en udfordring. Generering af funktionelle cerebellar neuroner blev kun opnået ved coculturing med granulatceller fra forskelligekilder 4,7,15. Denne protokol med succes opskaleret cerebellar engagement af menneskelige iPSCs; Derudover er dette den første protokol for differentiering af forskellige cerebellar neuroner i et 3D-kultursystem uden at coculturing med feeder celler. Specifikt kan følgende celletyper produceres i vores dynamiske kultursystem: Purkinje celler (Calbindin+), granulatceller (PAX6+/MAP2+), unipolar børsteceller (TBR2+), og dybe cerebellar kerner projektion neuroner (TBR1+), som blev opretholdt i suspension så længe 3 måneder.
Den skalerbare generation af cerebellar organoids udgør et værdifuldt redskab til at studere den embryonale udvikling af lillehjernen og de patologiske veje, der er involveret i degeneration af dette organ. Endvidere, høj-throughput screening for molekyler, der genopretter cerebellar funktion kan udføres ved hjælp af organoider opnået med denne skalerbare system. Samlet set opfylder denne metode et udækket behov for en skalerbar protokol til generering af cerebellarorganoider af høj kvalitet, som kan være vigtige for en række biomedicinske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere YH og SJ er ansatte i PBS Biotech. Forfatteren BL er CEO og medstifter af PBS Biotech, Inc. Disse samarbejdende forfattere deltog i udviklingen af de bioreaktorer, der anvendes i manuskriptet. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de politikker i tidsskriftet om deling af data og materialer. Alle andre forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 gennem Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, projekt N. 007317, PD/BD/105773/2014 til T.P.S og PD/BD/128376/2017 til D.E.S.N.), projekter, der samfinansieres af FEDER (POR Lisboa 2020–Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 12020) og FCT gennem tilskud PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 og CEREBEX Generation af Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Der blev også modtaget støtte fra Eu's Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftalen nummer 739572 – Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
