Summary
מוצג כאן פרוטוקול לביצוע מניפולציה גנטית במוח החמוס העוברי באמצעות באלקטרואידיות הרחם. שיטה זו מאפשרת מיקוד של תאי האבות העצביים בneocortex ב vivo.
Abstract
מניפולציה של ביטוי גנים ב vivo במהלך התפתחות עוברית היא שיטת הבחירה בעת ניתוח התפקיד של גנים בודדים במהלך התפתחות היונקים. באלקטרואידיות הרחם היא טכניקת מפתח למניפולציה של ביטוי גנים במוח היונק העוברי בvivio. פרוטוקול לאלקטרו-אידוי הרחם של הניאו-קורטקס העוברי של החמוסים, טורף קטן, מוצג כאן. החמוס משמש יותר ויותר כמודל להתפתחות neocortex, כי neocortex שלה מציג סדרה של תכונות אנטומיות, היסטולוגיות, תאיות, מולקולריות אשר נמצאים גם פרימטים אנושיים ולא אנושיים, אבל נעדר במודלים מכרסמים, כגון עכבר או חולדה. באלקטרו אידוי הרחם בוצע ביום העוברי (ה) 33, שלב midneurogenesis ב חמוס. באלקטרואידציה ברחם מטרות תאי האבות העצביים רירית החדרים הצדדיים של המוח. במהלך neurogenesis, תאים אלה של הצבי להוות את כל סוגי תאים עצביים אחרים. עבודה זו מציגה תוצאות וניתוחים מייצגים ב- E37, יום לאחר הלידה (P) 1 ו- P16, התואמים ל- 4, 9 ו- 24 ימים לאחר האלקטרואידציה של הרחם, בהתאמה. בשלבים מוקדמים יותר, הצטמיות של תאים ממוקדים מורכבת בעיקר של תת סוגים עצביים שונים, ואילו בשלבים מאוחרים יותר רוב התאים המסומנו הם נוירונים postmitotic. לכן, באלקטרואידיות הרחם מאפשרת לחקור את ההשפעה של מניפולציה גנטית על התכונות הסלולריות והמולקולריות של סוגים שונים של תאים עצביים. באמצעות השפעתו על אוכלוסיות תאים שונים, באלקטרופורציה ברחם יכול לשמש גם למניפולציה של תכונות היסטולוגיות ואנטומיות של neocortex החמוס. חשוב לציין, כל ההשפעות האלה הן אקוטיות ומבוצעות עם ספציפיות spatiotemporal שנקבע על ידי המשתמש.
Introduction
neocortex הוא הסדין החלקי של המוח היונקים ואת המושב של תפקודים קוגניטיביים גבוהיםיותר 1,,2,,3,,4,,5. על מנת להשיג מניפולציה גנטית חריפה neocortex היונקים ב vivo במהלך ההתפתחות העוברית, נחקרו שתי שיטות שונות: זיהוםנגיפי 6 ובאלקטרופורציהברחם 7. שתי השיטות מאפשרות פילוח יעיל של תאים ניאו-קליפטיים, אך סובלות ממגבלות מסוימות. היתרון העיקרי של אלקטרופורציה ברחם בהשוואה לזיהום נגיפי הוא היכולת להשיג ספציפיות מרחבית בתוך neocortex, אשר מושגת על ידי ויסות הכיוון של השדה החשמלי.
מאז אלקטרופורציה הוצגה לראשונה כדי להקל על הכניסה של DNA לתוך התאיםבמבחנה 8, זה הוחל כדי לספק DNA לתוך בעלי חוליות שונים ב vivo. במדעי המוח ההתפתחותיים, באלקטרו אידוי הרחם של neocortex העכבר דווח לראשונה ב 20019,10. שיטה זו מורכבת הזרקה של תערובת ה-DNA בחדר החוץ של המוח העוברי ויישום הבא של השדה החשמלי באמצעות אלקטרודות פינצטה, המאפשר דיוקמרחבי 7,11. באלקטרופורציה ברחם הוחל מאז כדי לספק חומצות גרעין על מנת לתמרן את הביטוי של גנים אנדוגניים או חוץ רחמים הוסיף neocortex העכבר. התקדמות חשובה נעשתה לאחרונה על ידי יישום המתודולוגיה של CRISPR / Cas9 בתיווך עריכת הגנום באמצעות אלקטרופורציה ברחם neocortex העכבר לבצע (1) הפרעה גנטית בנוירונים postmitotic12,,13 ותאי אבקדום עצבי 14,ו (2)גנום 15 ו אפיגנום16 עריכה.
זמן קצר לאחר הדיווח הראשון בעכבר, באלקטרופורציה של הרחם הוחל על neocortex חולדהעוברית 17,18. לא מכרסמים נותרו אתגר עד הראשון באלקטרו אידוי הרחם של חמוסים, טורף קטן, דווח ב 201219,20. מאז, באלקטרו אידוי הרחם של חמוסים הוחל כדי ללמוד את המנגנונים של התפתחות neocortex על ידי תיוג של פרוטוורים עצבייםונוירונים 20,21,2222,23, מניפולציה הביטוי של גנים אנדוגניים, כולל השימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas924, ועל ידי אספקת גנים חוץ רחמיים21 , 22,2522,כוללגנים ספציפיים לאדם 26. יתר על כן, באלקטרואידציה של רחם של חמוסים שימש כדי לטפל בתכונות של התפתחות neocortex אנושי בתנאיםפתולוגיים 27,28.
בהקשר של התפתחות neocortex, היתרונות של שימוש חמוסים כמו אורגניזם מודל לעומת עכברים הם בשל העובדה כי חמוסים טוב יותר לסכם סדרה של תכונות דמויי אדם. ברמה האנטומית, חמוסים מציגים תבנית אופיינית של קיפול קליפתי, אשרקיים גםבפרימטים אנושיים ורוב האחרים, אבל נעדר לחלוטין בעכברים אוחולדות 4,29,30,31. ברמה ההיסטולוגית יש שני אזורי נבט תת-ורטרליים נפרדים, המכונים האזורים התת-ורטרליים הפנימיים והפנימיים (ISVZ ו-OSVZ, בהתאמה)32,33,המופרדים על ידי שכבת הסיביםהפנימית 23. תכונות אלה משותפות גם עם פרימטים, כולל בני אדם, אך לא עם עכברים34. ISVZ ו OSVZ ב חמוסים ובני אדם מאוכלסים בשפע תאים עצביים אב אדם, בעוד האזור subventricular (SVZ) של עכברים מכיל רק אבות עצבייםדליל 21,32,35,36. ברמה התאית, חמוסים להפגין שיעור גבוה של תת סוג של אבות עצביים המכונה גליה בסיס או רדיאלית החוצה (bRG או oRG, בהתאמה), אשר נחשבים אינסטרומנטליים עבור ההתרחבות האבולוציונית של neocortexיונקים 34,37,38. bRG הם מכאן מאוד בשפע neocortex חמוס העוברי העוברי, אבל הם נדירים מאוד neocortex העכברהעוברי 35,36. יתר על כן, חמוס bRG מראה הטרוגניות מורפולוגית דומה לזה של bRG אנושי, הרבה יותר טוב עכבר bRG21. לבסוף, ברמה המולקולרית, פיתוח neocortex חמוס מראה דפוסי ביטוי גנים דומים מאוד לאלה של neocortex אנושי עוברי, אשר נחשבים לשלוט בהתפתחות של קיפול קליפתי, בין היתר39.
המאפיינים הביולוגיים והמולקולריים של החמוס bRG הופכים אותם לתווססים מאוד, בדומה ל-bRG האנושי. התוצאה היא ייצור מוגבר של נוירונים ופיתוח של neocortex מורחב ומורכב מאוד34. מאפיינים אלה הופכים חמוסים אורגניזמים מודל מעולה לחקר תכונות דמויי אדם של התפתחות neocortex כי לא ניתן לדגמןבעכברים 26,40. כדי לנצל את מלוא היתרונות של החמוס כאורגניזם מודל השיטה שהוצגה פותחה. הוא מורכב באלקטרו-אידוי רחם של עוברי חמוס E33 עם פלסמיד המביע GFP (pGFP) תחת שליטה של מקדם בכל מקום, CAG. לאחר מכן ניתן לנתח את העוברים המאלקטרו-אידויים באופן עוברי או לאחר הלידה. על מנת להפחית את מספר בעלי החיים שהוקרבו, חמוסים נקבה (ג'יל) מחטאים על ידי כריתת רחם ותרמו לאימוץ כחיות מחמד. אם העוברים המיויעדים נקטפים בשלבים עובריים, מתבצע ניתוח שני ועוברים מוסרים על ידי ניתוח קיסרי, בעוד שהנוברים עוברים כריתת רחם. אם העוברים המיויעדים מנותחים בשלבים שלאחר הלידה, ג'יל עובר כריתת רחם לאחר שהגורים נ גנחו או הוקרבו. לפיכך, מוצג גם פרוטוקול כריתת הרחם של ג'יל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים התנהלו בהסכמה עם החקיקה הגרמנית לרווחת בעלי חיים לאחר אישור ה-Landesdirektion Sachsen (רישיונות TVV 2/2015 ו-TVV 21/2017).
1. הכנה לאלקטרואידציה ברחם
- הכן את תערובת הדי.אן.איי. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בריכוז סופי של 1 μg/μL של pGFP. להמיס DNA PBS ותוספת עם 0.1% ירוק מהיר כדי להקל על הדמיה. לאחר הכנתו, מערבבים את תערובת ה-DNA על ידי התפתלות למעלה ומטה מספר פעמים או על ידי הקשה על האצבע. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
הערה: עבור coelectroporations, תערובת ה-DNA מוכן להכיל ריכוז סופי של 1 μg / μL של קידוד פלסמיד גן של עניין יחד עם 0.5 μg/ μL של pGFP מדולל PBS. - הכן את שולחן הניתוח עם כל הכלים והמכשירים הנדרשים.
- משוך נימים מזכוכית באמצעות מושך המיקרופיפט. התאם את הקוטר של קצה נימות על-ידי חיתוך החלק הדיסטלי של נימות באמצעות מקציות כפי שתואר קודםלכן 41.
2. הכנת חמוסים לניתוח
- לשמור את jills בהריון עם עוברים ב E33 צום לפחות 3 שעות לפני הניתוח כדי להפחית את הסיכון להקאות.
- לפני הניתוח לחטא את כל הכלים על ידי autoclaving. לבצע את הניתוח בחדר שהוקצה במיוחד בתנאים aseptic כדי לחסל מקורות פוטנציאליים של זיהום.
- שים את ג'יל ההרה בתיבת נרקוזיס עם 4% איזולורן.
- כאשר הם ממברמים, מניחים את החמוס על שולחן הניתוח עם משטח חום וצרףו את מסכת הנרקוזיס עם זרימה קבועה של 2%-3% לאף. כדי להבטיח את רמת ההרדמה המתאימה, בדוק אם יש את המחסור בהרפלקסים הבאים:
- רפלקס פלורל על ידי נגיעה בעור פריקולרי
- רפלקס הגמיש על ידי צביטת העור בין 2ו 3 rd, או 3rd ו 4 בהון של שניהגפיים האחוריות
- אם רפלקס palpebral נעדר רפלקס כיפוף הוא מופחת בבירור, לבדוק את רפלקס הכאב על ידי צביטת בהון אחת של כל איבר אחורי.
הערה: ודא שיש סטטוסקופ בהישג יד כדי לפקח על קצב הלב והקצב במידת הצורך.
- להזריק את החמוס תת עורי עם משכך כאבים (0.1 מ"ל של מטאמיצול, 50 מ"ג/ק"ג של משקל גוף), אנטיביוטיקה (0.1 מ"ל/ק"ג של משקל גוף של 20 מ"ג/ק"ג של אמוקסיצילין + חומצה קלוולנית), וגלוקוז (10 מ"ל של 5% פתרון גלוקוז).
- מניחים טיפה של תמיסת משחה לעיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות עיניים במהלך הניתוח.
- לגלח את הבטן החמוס באמצעות גילוח.
- לנקות את העור עם מים וסבון, לחטא את הבטן עם 70% קרצוף אתנול, לחטא 2x עם יוד, ולתת לו להתייבש.
3. באלקטרו אידוי הרחם של חמוסים
- ודא כי האזור הכירורגי סטרילי: מניחים כלים כירורגיים סטריליים על רקמות סטריליות, ולהחליף מעיל וכפפות.
- מניחים וילונות כירורגיים סטריליים על החיה.
- באמצעות אזמל, לפתוח בניתוח את הבטן ב linea אלבה עם ~5 ס"מ ארוך לחתוך.
- חותכים את שכבת השריר באמצעות מספריים.
- מניחים דגימות גזה סביב אתר החתך ומרטיבים אותן ב-PBS. דגימות הגזה יספגו את ה-PBS הנוסף שיתווסף במהלך הניתוח.
הערה: לשמור על חום ותמיכה PBS לאורך כל הניתוח. - לחשוף את רחם החמוס ולמקם אותו על דגימות גזה.
- טען נמת זכוכית עם פתרון ההזרקה באמצעות פיפטה עם קצה טעינה ארוך. ודא כי נפח הטעינה הוא כ 5-20 μL בהתאם למספר העוברים ומספר תנאים ניסיוניים שונים. הנפח המוזרק הממוצע לכל עובר הוא 3-5 μL. חבר את נערך הזכוכית הטעון למחזיק וחבר את הצד השני של המחזיק לצינור ודובר.
- תבדוק את העובר הראשון ותמצא את הראש.
- מקם את מקור האור הסיב האופטי ליד ראשו של העובר כדי להקל על הדמיה.
הערה: קירות הרחם החמוסים כהים מאוד, וקשה לראות דרכם אלא אם כן האור נוצץ ישירות עליהם. - לבצע הזרקה תוך-ורטרלית אחת לתוך החדר של אחת מחצי הכדור המוח ולשמור על חצי הכדור השני ללא פגע כדי לשמש כשליטה פנימית. החדר עצמו אינו נבדל בקלות על ידי העין, כך מיקומו מוערך בהתבסס על המיקום של הקשתית פיגמנט, אשר נראה לעין. הזרקת תוך ורטרקולרית נעשית על ידי לקיחת המחזיק מחובר נימי הזכוכית ו חודר את העור, הגולגולת, ואת רקמת המוח עם קצה נימי הזכוכית.
הערה: הקפד לא לפגוע שליה, אשר כהה יותר מאשר שליות murine.- כאשר קצה נמת הזכוכית נמצא בחדר, להזריק כ 3-5 μL של פתרון ההזרקה על ידי פיות צינור באמצעות הפיה מחובר מחזיק נמת הזכוכית. מכיוון שהפתרון המוזרק מכיל 0.1% מהיר ירוק, החדר המוזרק יהפוך כעת לירוק כהה, ויהיה גלוי כמבנה בצורת כליה.
- מניחים את אלקטרודות הפינצטה על הרחם מעל ראשו של העובר, כך שהמוט החיובי ממוקם מעל האזור שיהיה ממוקד והמוט השלילי מתחת לאזור המוזרק.
- הגדר את תנאי האלקטרואידציה הבאים באלקטרופורטור: אורך פולס = 50 השנייה; מתח פולס = 100 V; מרווח דופק = 1 s; מספר פולסים = 5. לאחר מכן,לחץ עלכפתור "דופק" על האלקטרופורטור.
- שחרר במהירות מספר טיפות של PBS 1x חם על העובר האלקטרואיד.
- חזור על ההליך עבור כל העוברים. לשמור על הרחם רטוב כל הזמן עם PBS חם.
הערה: אם העוברים הראשונים הפונים לנרתיק אינם נגישים בקלות, עדיף לא לחשמל אותם. - כאשר כל העוברים מתחשמלים, מניחים את הרחם בחזרה לחלל צק.
- תפר את שכבת השריר עם צפר באמצעות תפר 4-0.
- תפר את העור באותו עובי ולרסס את הפצע עם ספריי אלומיניום.
- מניחים את החיה בכלוב ולשמור אותו חם עם מקור חום. עקבו בזהירות אחר החיה עד שהיא מתעוררת.
4. טיפול לאחר הניתוח ודיור של בעלי חיים ממוקדים
- במשך 3 ימים לאחר הניתוח להבטיח כי בעלי החיים עוברים את הטיפול שלאחר הניתוח הבא: 20 מ"ג/ק"ג אמוקסיצילין (אנטיביוטיקה) 1x מדי יום; 25 מ"ג/ק"ג מטאמזול (משכך כאבים) 3 ים ביום.
- ודא כי החמוסים נמצאים בנפרד.
- ודא כי החמוסים נבדקים על ידי וטרינר לפחות 1x ליום.
- ודא כי החמוסים מופרעים מעט ככל האפשר במהלך הלידה.
- לאחר שהגורים נ גנחו או הוקרבו, הכינו את ג'יל לכריתת רחם.
5. כריתת רחם של חמוסים
הערה: כריתת רחם מתבצעת כדי להפחית את מספר בעלי החיים שהוקרבו כך בעלי החיים שעברו עיקור ניתן יהיה תרם לאימוץ כחיות מחמד. ההליך הקדם-כירורגי של כריתת רחם זהה לתהליך 2.
- לגלח ולחטא את הבטן החמוס כמתואר בשלבים 3.1 ו 3.2.
- פתח בניתוח את הבטן בליינה אלבה. חותכים את שכבת השריר. הרם את שכבת השריר והגן על הבטן באצבע תוך כדי פתיחת שכבת השריר במלואה.
- מניחים דגימות גזה סביב אתר החתך ומרטיבים אותן ב-PBS סטרילי. לחשוף את הרחם החמוס ואת השחלות ולמקם אותם על דגימות גזה.
- התחל את כריתת הרחם בצד אחד על ידי רצועות ovarica arteria ו- vena ovarica גולגולת mesovar. לשים מלחציים על כל צד של הרצועה ולבצע גולגולת קשירה אחרת למלחציים. חבר את המלחציים השלישיים בקצות הרצועה כדי להציל אותם. חזור על זה בצד השני.
- חותכים בין המלחציים ומנתקים את הרחם של הקרנואה מההסנטריה משני הצדדים.
- לתות את הרחם ארטריה משני צידי הרחם סיבתי לרחם ostium. ואז לתפור את הנרתיק ולתקן את הקשירה. חבר את המלחציים בקצות הליגות כדי להציל אותם. שים שני מלחציים גולגולתיים על הקשירה. חותכים בין המלחציים ותנתקו את הרחם מהנרתיק. מוציאים את הרחם והחלחלות ונפטרים מהם. לגרד את קרום הררית שיורית מהתחת הרחם.
- נתק את כל המלחציים הנותרים וקצר את קצוות הקשירה. הקפד לשלוט לדימום לאחר הסרת המלחציים.
- תפר את שכבת השריר ואת העור כמתואר בשלבים 3.16 ו 3.17. בצע את הפרוטוקול לאחר הניתוח כמו בשלבים 3.18 ו- 4.1-4.3. יש להשאיר את בעלי החיים במתקן בעלי החיים למשך שבועיים לפחות עם ביקורים וטרינריים קבועים. לאחר שהחיות יחלימו לחלוטין, ניתן יהיה להיתרמו לאימוץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באלקטרואידציה של רחם של חמוסים ב E33 הביא מיקוד של תאי אב עצבי רירית פני השטח בחדר של neocortex עוברי(איור 1). תאים אלה נקראים progenitors אפי והם מאוד משגשגים, מה שנוצר את כל סוגי התאים האחרים במהלך הפיתוח. על חלוקה אסימטרית, הצמרים apical יצרו עוד צווי אפי ותא מובדל יותר, בדרך כלל ציד בסיס (BP), אשר delaminated מפני השטח בחדר. BPs היגר לאזור הנביט המשני, SVZ. כאשר האלקטרואדידציה בוצעה ב- E33, BPs רבים שזה עתה נולדו היגרו לחלק הבאזל-רוב של SVZ, שם הם יצרו את OSVZ22.
כאשר ההשפעות של אלקטרואדאוציה נבדקו 4 ימים מאוחר יותר ב E37, רוב התאים המקודדים וצרי גופם היו עדיין באזורי הנביטה (VZ, ISVZ ו OSVZ, ראה איור 2A ) ותאיםהיו לעתים רחוקות נוכחים יותר בהתבססות בצלחת קליפתית (CP). הציקר של תאים ממוקדים כללה בעיקר סוגי ם עצביים ונוירונים שזה עתה נולדו. זהות האב הקדמון יכולה להיבדק על ידי immunofluorescence עבור סמנים של תאי רכיבה על אופניים, כגון PCNA26 (איור 2B, C), בעוד קבוצת משנה של אבותים העוברים מיטוזה יכול להיות מוצג על ידי סמנים כגון פוספוביסטון 3 (PH3)21 (איור 2D).
ב P0, 8 ימים לאחר האלקטרואידציה, הצד של תאים ממוקדים להתפשט בכל השכבות ההיסטולוגיות(איור 3A, ב). בשלב זה, BPs היו בשפע במיוחד bRG היו לזיהוי בקלות. באמצעות שילוב של סמני גורם שעתוק, אוכלוסיות BP שונות יכול להתגלות. Sox2 הוא סמן של תאים פרוביים משגשגים, כולל bRG26. Tbr2 הוא סמן של BPs נוירוגני, שהם בעיקר אבות ביניים26 (איור 3B). מכיוון שהעוברים היו מעורבים באלקטרואיד עם קידוד פלסמיד GFP, המורפולוגיה של האבות העצביות יכולה להיבדק על ידי מעקב אחר אות GFP. זה חשוב במיוחד בהקשר של BPs, אשר מגיעים בשני מורפוטיפים עיקריים: תאים רב קוטביים, שהם בעיקר םם, ותאים רדיאליים, שהם bRG21. לפיכך, Sox2+ Tbr2– תאים רדיאליים OSVZ הם אוכלוסיית התא מפתח של עניין ללימוד bRG26.
על ידי P16, רוב התאים ממוקדים הפסיקו לחלק ולהבדיל לתוך נוירונים וglia. לכן, סוגי תאים אלה נבחנים בצורה הטובה ביותר בשלב זה. בנוסף תת סוגים עצביים וגליאליים שונים, חמוס P16 neocortex הציג את דפוס המאפיינים של קיפול (איור 3C). בשלב זה רוב gyri העיקריים sulci כבר היו נוכחים, אזורי מוח פוטנציאליים ניתן לזהות31. מוח החמוס המשיך להתבגר לאחר P16, כאשר תהליכים כגון myelination ו סינפטוגנזה מתרחשים.
איור 1: מיקוד תאים עצביים על ידי באלקטרואידציה הרחם של neocortex החמוס. באלקטרופורציה של הרחם של neocortex חמוס ב E33 הביא מיקוד של אבות דופן. במהלך הפיתוח תאים אלה להוות את כל סוגי התאים האחרים. אבותו של בסיס נחקרו בצורה הטובה ביותר בשלבים מאוחרים יותר של עוברי (E37) ופרינטל (P0). נוירונים נחקרו בצורה הטובה ביותר בשלבים שלאחר הלידה, כגון P16. שכבות קליפתיות: VZ = אזור חדריים; ISVZ = אזור תת-וררי פנימי; OSVZ = אזור תת-ורטרריים; IZ = אזור ביניים; CP = צלחת קליפתית; GZ = אזורי נביטה (VZ+ SVZ); WM = חומר לבן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דוגמה של Neocortex חמוס E37 לאחר באלקטרואידציה ברחם ב E33. (א' ו-ב')קטע של הניאוקורטקס החמוס E37; ירוק, צידיד של תאים אלקטרואידים (GFP); גרעיניתא כחולים(A); מג'טנה (B), תאי רכיבה על אופניים (PCNA). תיבה (רוחב = 777 μm) מציינת אזור המוצג בהגדלה גבוהה יותר ב (C). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. שים לב לחוסר אות GFP בהפני כדור הארץ (חצי הכדור ללא פשרות), המשמש כפקד פנימי. (C ו-D)הגדלה גבוהה יותר של האזור המיועד; ירוק, צידיד של תאים אלקטרואידים (GFP); מג'טנטה (C), תאי רכיבה על אופניים (PCNA); אדום (D), תאים מיטוטיים (פוספוביסטון 3, PH3). שים לב כי רוב הצטיידות של תאים ממוקדים היה SVZ בשלב זה. שכבות קליפתיות כמו איור 1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: דוגמאות של P0 ו- P16 חמוס neocortex לאחר באלקטרואידיות הרחם ב E33. (א' ו-ב')קטע של הניאוקורטקס החמוס P0; ירוק, צידיד של תאים אלקטרואידים (GFP); גרעיניתא כחולים(A); ציאן (B), סוקס2; מג'נה (B), Tbr2. (ב)הגדלה גבוהה יותר של האזור האלקטרואידי. קשקשים = 1מ"מ( A ), 100 μm (B). שכבות קליפתיות כמו איור 1. (ג)קטע של הניאוקורטקס החמוס P16; ירוק, צידיד של תאים אלקטרואידים (GFP); אפור, גרעין תא (DAPI); מג'טנטה, אסטרוציטים (GFAP). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. נתון זה שונה מ- Kalebic ואח '25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באלקטרו אידוי הרחם חמוס היא טכניקה חשובה, עם יתרונות וחסרונות ביחס לשיטות אחרות. ישנם שלבים ומגבלות קריטיים לשיטה זו, כמו גם שינויים פוטנציאליים ויישומים עתידיים שיש לזכור.
מאז עבודתו החלוצית של ויקטור בורל ועמיתיו על מניפולציה גנטית של neocortex חמוס שלאחר הלידהבאמצעות אלקטרופורציה או הזרקהויראלית 35,42,43, החמוס הפך אורגניזם מודל נגיש גנטית. הקמת מניפולציה גנטית במהלך התפתחות עוברית באמצעותאלקטרואדוד רחם 19,20 פתח אפשרויות מחקר חדשות על ידי מתן פילוח של תאים עצביים בשלבים התפתחותיים מוקדמים יותר. בהשוואה למניפולציה שלאחר הלידה, באלקטרואידציה ברחם מאפשרת מיקוד של אזורים גדולים יותר של neocortex ופחות מובדילים עצביים הנבויים כי באופן רציפות ליצור את כל סוגי התאים האחרים של neocortex. חשוב לציין, בהשוואה ליקוד ויראלי, באלקטרו-אידוי ברחם מאפשר דיוק מרחבי של פילוח.
החלק הקריטי ביותר בשיטה הוא הניתוח עצמו. באלקטרופורקס הרחם של neocortex החמוס הוא באופן משמעותי יותר מורכב וקשה בהשוואה להליך בעכברים. קירות הרחם כהים יותר, וקשה יותר להבחין בין העוברים. בנוסף, חמוסים בוגרים יש גדל גדל ודרישות וטרינריות. מאתגרת במיוחד היא התקופה סביב לידת הגורים. החמוסים רגישים מאוד בתקופה זו ועדיף לא להפריע שלא לצורך. המגבלות העיקריות של הגישה עצמה קשורות ליעילות של פילוח. באלקטרואידיות הרחם תמיד גורמת מיקוד של פסיפס של קטורים עצביים. זה אידיאלי לחקר ההיבטים הביולוגיים של התא של אבות עצביים או נוירונים, אבל זה תת אופטימלי לגרימת הפרעות היסטולוגיות ואנטומיות גדולות, כגון שינוי קיפול neocortical. אם הדבר נדרש, הגישה הטובה ביותר היא להזיז את האלקטרודות לאורך ציר rostrocaudal במהלך ההליך על מנת לכסות חלקים גדולים של neocortex. עם זאת, עבור ניתוח איברים שלם הגישה הטובה ביותר היא דור של חמוסים טרנסגנים החל בשלב zygote44.
השלב העוברי שבו בוצעה אלקטרופורציה ברחם (E33) הוא אידיאלי לחקר אבותו של בסיס. אכן, אלקטרואדות ומיקוד ויראלי בשלב זה יושמו כדי לחשוף את התזמון של תחילת OSVZ22, כמו גם תכונות ביולוגיות תאים שונים של אבותיים בסיסים הרלוונטיים מורפולוגיה שלהםוהתפשטות 21,25,26. עם זאת, בהתאם למטרה המדעית של מחקר, ניתן לשנות בקלות את התזמון של אלקטרופורציה ללא שינוייםמשמעותיים בשיטה 19,20. מלבד ספציפיות זמנית, באלקטרואידציה ברחם מאפשר שינויים קלים של ספציפיות מרחבית. הניאו-קודקודקוד של דורסולאטרל במיקום הרוזסטרו-קדיאלי לאורך ציר הרוזטרוטוקאלי היה ממוקד, מה שהביא לסימון של האזורים המוטוריים והסומטו-חושיים. אזורים ניאו-קליפטיים אחרים יכולים להיות ממוקדים גם על ידי התאמת מיקום האלקטרודות וכיוון השדה החשמלי. בעכבר, neocortex מדיאלי45 ו telencephalonגקוי 46 היו ממוקדים באמצעות אלקטרופורציה הרחם, המצביע על כך גישות דומות יכול לשמש חמוסים.
לבסוף, באלקטרואידציה ברחם ניתן לשלב בקלות עם הגנום האחרון וטכניקות עריכה אפיגנום13,14,16,25, שם CRISPR / (d)רכיבי Cas9 ניתן להעביר כמו plasmid או כמורכב של חלבון Cas9 רקומביננטי ומדריך RNAs14, עם האחרון לקצר את הזמן הנדרש לעריכת הגנום כדי לבצע. סביר להניח כי שיפורים טכנולוגיים נוספים בעריכת הגנום ישולבו עם אלקטרופורציה ברחם בעכברים וחמוסים על מנת ליצור מוטציות גנומיות מדויקות חשובות להבנת התפתחות המוח נורמלית ובמיוחד כדי מודל תנאים פתולוגיים אנושיים. בהקשר זה, באלקטרואידיות הרחם משמש יותר ויותר כשיטת פילוח של בחירה עבור omics חד-תאי שונים הבאים גישות הדמיה חיה כדי להבין את החתימות המולקולריות ואת ההתנהגות הדינמית של התאים הממוקודים ואת הצביות שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה לשירותים ומתקנים של מכון מקס פלאנק לביולוגיה וגנטיקה של תאים מולקולריים על התמיכה יוצאת הדופן הניתנת, במיוחד כל הצוות של השירותים הביו-רפואיים (BMS) על גידול מצוין של חמוסים וג'יי פיכל וצוותו של מתקן המיקרוסקופיה הקלה. אנו אסירי תודה במיוחד קטין Reppe ואנה Pfeffer מ BMS לתמיכה וטרינרית יוצאת דופן ליי Xing מהקבוצה Huttner לסיוע עם ניתוחים חמוס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
