ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

פרוטוקול זה מאפשר לנו לבצע מניפולציה גנטית ב-vivo במודל בעלי חיים מרכזי המאפשר לנו לחקור את ההתרחבות והקיפול של ניאוקורטקס מתפתח. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא בשימוש בספציפיות מרחבית ותכובית גבוהה במיקוד אותם תאי גזע עצביים שהם סוג תא המפתח להתפתחות המוח. לפני תחילת ההליך, למשוך נימי זכוכית על מושך פיפטה מיקרו ולהשתמש מלקחיים לחתוך את החלק הדיסטלי של נימי כדי להתאים את הקוטר של קצה נימי.

ביום העוברי 33, הוסיפו את הריכוז המתאים של דנ”א ב-PBS, בתוספת 0.1% Fast Green עם ערבוב עדין, וה מניחים חמוס נקבה בהריון בצום של 3 שעות על שולחן ניתוחים עם כרית חום. אשר את רמת ההשמדה המתאימה על ידי נגיעה בעור הצחיחיני וצביטת העור בין בהונות השני והשלישי או השלישי והרביעי של שתי הגפיים האחוריות. Isoflurane יכול לגרום לתופעות לוואי, כולל בחילות וסחרחורת.

בעת טיפול isoflurane בצורה נוזלית, להשתמש בציוד מגן. במהלך הניתוח, השתמש במיכלים מתאימים כדי ללכוד את הגז. להזריק את החיה תת עורית עם משכך כאבים, אנטיביוטיקה, גלוקוז, ולהחדיר משחה על העיניים של החיה.

השתמש קוצץ כדי לגלח את הבטן, ולנקות את העור החשוף עם מים, סבון, ותו תות העונה יוד. לאחר מכן, לייבש את העור עם ספוגיות גזה לחטא עם אלכוהול וקרצוף יוד. עבור אלקטרופורציה ברחם, מניחים וילון סטרילי מעל החיה ולהשתמש אזמל לעשות חתך בעור כ 5 ס”מ באלבה linea.

השתמש מספריים כדי לחתוך דרך שכבת השריר ולה מניחים ספוגיות גזה סביב אתר החתך. הרטיבו את הגזה עם PBS וה מניחים את הרחם על ספוגיות. באמצעות פיפטה עם קצה ארוך, לטעון אחד נימי זכוכית משך עם 5 microliters של פתרון DNA לכל עובר להיות מוזרק.

חבר את נימי טעון למחזיק ולחבר את הצד השני של המחזיק לצינור ושופר. אתר את ראשו של העובר הראשון והצב מקור אור סיב אופטי ליד הראש. באמצעות הקשתית פיגמנט כנקודת התייחסות, לחדור את העור, הגולגולת, ואת רקמת המוח עם קצה נימי זכוכית ולהשתמש pipetting הפה כדי להקל על המסירה של 3-5 microliters של פתרון ההזרקה לתוך החדר של אחת ההמיספרות המוחיות.

מכיוון שהתובנה המוזרקת מכילה 0.1% Fast Green, הזרקה מוצלחת תגרום לכתמים ירוקים כהים של החדר המוזרק, שכעת יהיה גלוי כמבנה בצורת כליה. לאחר ההזרקה, מניחים את אלקטרודות פינצטה על הרחם מעל ראש העובר עם הקוטב החיובי מעל האזור להיות ממוקד ואת הקוטב השלילי מתחת לאזור מוזרק. הגדר את אורך הדופק של האלקטרופורט ל-50 אלפיות שנייה, את מתח הדופק ל-100 וולט, את מרווח הדופק לשנייה אחת ואת מספר הפולסים לחמש.

כאשר כל הפרמטרים נקבעו, לחץ על Pulse”ושחרר במהירות כמה טיפות של PBS חם על העובר האלקטרופול. כאשר כל העוברים כבר אלקטרופולציה, להחזיר את הרחם לחלל צפי ולהשתמש תפר 4-0 כדי לסגור את שכבת השריר עם צדת. סוגרים את העור באופן דומה ומכסים את הפצע בתרסיס אלומיניום.

ואז להחזיר את החיה לכלוב שלה עם מקור חום וניטור עד חקירה מלאה. ארבעה ימים לאחר אלקטרופוזיה ביום העוברי 37, רוב התאים הממוקדים וצאצאיהם עדיין נמצאים באזורים הנביטתיים והתאים נצפו לעתים רחוקות עוד יותר בבסאלי בתוך הלוח קליפת המוח. זהות אב יכולה להיבדק על ידי immunofluoresence עבור סמנים של תאי רכיבה על אופניים, כגון PCNA, ואילו תת קבוצה של אבים שעברו מיטוזה יכול להיות מוצג על ידי סמנים כגון פוספו-histone 3.

ביום שלאחר הלידה אפס, שמונה ימים לאחר אלקטרופורציה, צאצאי התאים הממוקדים התפשטו לכל השכבות ההיסטולוגיות. באמצעות שילוב של סמני גורם שעתוק, ניתן לחשוף אוכלוסיות שונות של חותם בסיס. לדוגמה, Sox2 הוא סמן של תאים מולדים שגשוג, כולל גליה רדיאלי בסיס.

וחלבון מוח T-box 2 הוא סמן של אגניטורים בזלית נוירוגניים, שהם בעיקר בני-אצאים בינוניים. ביום שלאחר הלידה 16, רוב התאים הממוקדים מפסיקים להתחלק ולהבדיל לנוירונים וגליה, עם חמוס לאחר לידה יום 16 neocortex המציג את דפוס הקיפול האופייני. אלקטרופורציה ברחם של עוברי חמוס היא שיטה רבת עוצמה ללמוד את הפונקציה של גנים.

היא אפשרה לנו לחקור גנים שהיו מעורבים בהתפשטות הניאוקורטקס באבולוציה, כולל גנים ספציפיים לבני אדם. ובשיטתו רבת העוצמה הזו, אכן הצלחנו לגלות מאפיינים מרכזיים של האופן שבו ההתפשטות האבולוציונית של הניאוקורטקס האנושי ככל הנראה עבדה.