عالية الإنتاجية المقايسة من الحدود الحرارية الحرجة في الحشرات
Summary
الحدود الحرارية يمكن التنبؤ البيئات التي تتسامح مع الكائنات الحية، وهي معلومات قيمة في مواجهة التغير المناخي السريع. يتم وصفها هنا بروتوكولات عالية الإنتاجية لتقييم الحد الأدنى الحراري الحرج ووقت الضربة القاضية للحرارة في الحشرات. البروتوكولين تكبير الإنتاجية وتقليل تكلفة المقايسات.
Abstract
والحدود الحرارية العليا والدنيا للنباتات والحيوانات هي مؤشرات هامة لأدائها وبقائها وتوزيعاتها الجغرافية، وهي ضرورية للتنبؤ بالاستجابات لتغير المناخ. يصف هذا العمل بروتوكولين عاليي الإنتاجية لقياس الحدود الحرارية للحشرات: أحدهما لتقييم الحد الأدنى الحراري الحرج (CTmin)والآخر لتقييم الحرارة يهدم الوقت (KDT) استجابةً لجهد حراري ثابت. فيالمقايسة الدقيقة CT، يتم وضع الأفراد في عمود أكريليك سترة، تخضع لتراجع درجة الحرارة المنحدر، وتحسب لأنها تقع من قعقعتهم باستخدام جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء. في اختبار KDT الحرارة ، يتم احتواء الأفراد في لوحة 96 بئرًا ، توضع في حاضنة تم تعيينها إلى درجة حرارة ساخنة ومجهدة ، والفيديو المسجل لتحديد الوقت الذي لم يعد بإمكانهم البقاء فيه منتصبين والتحرك. توفر هذه البروتوكولات مزايا على التقنيات الشائعة الاستخدام. كل من المقايسات هي منخفضة التكلفة ويمكن أن تكتمل بسرعة نسبيا (~ 2 ح). المقايسة الدقيقة CT يقلل من خطأ المجرب ويمكن قياس عدد كبير من الأفراد في وقت واحد. يولد بروتوكول KDT الحرارة سجل فيديو لكل مقايسة وبالتالي يزيل التحيز المجرب والحاجة إلى مراقبة الأفراد باستمرار في الوقت الحقيقي.
Introduction
الحدود الحرارية للحشرات
الاختلاف في الظروف البيئية، بما في ذلك درجة الحرارة، هو عامل رئيسي يؤثر على الأداء واللياقة البدنية والبقاء على قيد الحياة والتوزيع الجغرافي للكائنات الحية1،2. تحدد الحدود الحرارية العليا والدنيا النطاق النظري للبيئات التي يمكن أن يتسامح معها الكائن الحي ، وبالتالي ، فإن هذه الحدود هي تنبؤات مهمة لتوزيع النباتات والحيوانات ، خاصة في مواجهة تغير المناخ3،4. وهكذا، فإن البروتوكولات لقياس الحدود الحرارية بدقة هي أدوات مهمة لعلماء البيئة، وعلم وظائف الأعضاء، وعلماء الأحياء التطورية، وعلماء الأحياء المحافظة، من بين آخرين.
كما الحيوانات البرية الأكثر وفرة وتنوعا، وغالبا ما تستخدم الحشرات لقياس الحدود الحرارية. ويشيع استخدام الحد الأقصى الحراري الحرج (CTmax)وصغر حجم الحرارة الحرجة (CTmin)لتقييم الاختلاف داخل وفيما بين القطاعات في التسامح الحراري5،6،7. في حينيمكن قياس الحدالأقصى للأشعة المقطعية و المقطعية للنوعات الظاهرية متعددة، بما في ذلك النمو، والإخراج الإنجابي، والسلوك، يتم تطبيقها الأكثر شيوعاً على وظيفة الحركي5،6،7. وهكذا ، فإن الحد الأقصى للتصويرالمقطعي (يسمى أيضا الحرارة المنهزة) وMasctmin غالبا ما يتم تعريفه على أنه درجات الحرارة العالية والمنخفضة التي تفقد فيها الحشرات الوظيفة الحركية وغير قادرة على البقاء منتصبة5،6،7،8،9،10،11. CTmin يتزامن مع بداية الغيبوبة الباردة، وهو شلل عكسي الناجمة عن درجات الحرارة الباردة6. في حين أن الشلل عند الحدود الحرارية غالبا ما يكون عكسها، استمرار التعرض لهذه درجات الحرارة يؤدي إلى الموت الإيكولوجي5.
طرق مشتركة لقياس الحدود الحرارية
وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الأجهزة لقياس الحدود الحرارية (ملخصة في Sinclair et al.) 6.لفترة وجيزة، يتم تسخين الحشرات أو تبريدها في الحاضنات12،13، حاويات مغمورة في حمامات السوائل11،14،15،16، كتل الألومنيوم10،17، أو حاويات مغطاة18، ومراقبتها حتى تتوقف الحركة. لرصد الحشرات أثناء الفحص ، فإن الطريقة الأكثر شيوعًا هي المراقبة المباشرة ، حيث يتم مراقبة الأفراد بشكل مستمر في الوقت الفعلي أو بأثر رجعي مع الفيديو المسجل6،9،10،11،15،17. وفي حين أن أساليب المراقبة المباشرة لديها الحد الأدنى من متطلبات المعدات، إلا أنها تتطلب كثافة في العمالة والحد من الإنتاجية. بدلا من ذلك ، يمكن ملاحظة الحشرات بشكل غير مباشر عن طريق جمع الأفراد في أوقات منفصلة لأنها تقع من جثم6،19،20،21 أو استخدام رصد النشاط13.
11- إن الطرق غير المباشرة لقياس الحدود الحرارية هي عموماً أعلى إنتاجية وربما تكون أقل عرضة للخطأ من طرق المراقبة المباشرة. الأسلوب الأكثر شيوعاً للرصد غير المباشر يستخدم العمود سترة درجة الحرارة التي تسيطر عليها6،8،19،20،21. يتم وضع الحشرات داخل عمود مع الجثم ، ويتم التحكم في درجة حرارة الغرفة الداخلية عن طريق ضخ السوائل من حمام السوائل التي يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة من خلال البطانة المبسترة للعمود. الأفراد الذين يصلون إلى حد الحرارة يسقطون من جثمهم ويتم جمعهم في درجات حرارة منفصلة أو فترات زمنية. في حين أن هذه الطريقة تعمل بشكل جيد للتصويرالمقطعي دقيقة، فقد وجد غير مناسبللأشعة المقطعية ماكس، لأن الذباب يمشي طوعا من الجزء السفلي من العمود عندما تزيد درجة الحرارة. والطريقة الجديدة الموصوفة هنا تتحايل على هذه المسألة من خلال احتواء الذباب بشكل فردي أثناء القياسات الآلية.
وبالإضافة إلى طريقة المراقبة، يشيع استخدام نوعين من نظم الحرارة لتقييم الحدود الحرارية العليا. تتكون الأقوال الديناميكية من زيادة درجة الحرارة تدريجياً حتى يتم فقدان وظيفة المحرك. أن درجة الحرارة هي دينامية CTماكس7،8،9،13. في المقابل، تتكون المقايسات الثابتة من درجة حرارة مرهقة ثابتة حتى يتم فقدان الوظيفة الحركية. أن نقطة الوقت هي الحرارة ضربة قاضية الوقت (KDT الحرارة)، وتسمى أيضاماكس CT ثابت(sCT ماكس)في ورقة حديثة من قبل يورغنسن وآخرون7،,8،,9،,16،,22. على الرغم من أنCT ماكس والحرارة المقايسات الضربة القاضية (الحرارة KD المقايسات) تنتج المقاييس مع وحدات مختلفة، النمذجة الرياضية من الصفات اثنين يشير إلى أنها تعطي معلومات قابلة للمقارنة على التسامح الحرارة وكلاهما ذات الصلة بيئيا8،9. تؤدي المقايسات الديناميكية إلى درجة حرارة يمكن مقارنتها بالظروف البيئية ، وهي أفضل عندما تكون هناك اختلافات كبيرة في تحمل الحرارة ، مثل المقارنات بين الأنواع ذات المنافذ الحرارية المختلفة على نطاق واسع. ومع ذلك ، بسبب Q10 عالية لتراكم إصابات الحرارة ، قد يكون من الأفضل إجراء فحص ثابت للكشف عن أحجام التأثير الصغيرة ، مثل الاختلاف داخل معينة في تحمل الحرارة9. أيضا ، من الناحية العملية ، يتطلب الفحص الثابت معدات أقل تطورا من الفحص الديناميكي.
الهدف
الهدف من هذه الورقة هو إضفاء الطابع الرسمي على أساليب المقايساتالمقطعية الدقيقة والحرارة KD التي يمكن استخدامها في البحوث المستقبلية لتقييم الحدود الحرارية للحشرات المتحركة. ويتم تكييف البروتوكولات من منهجيات سبق وضعها، وهي مصممة بحيث تكون عالية الإنتاجية، وآلية، وفعالة من حيث التكلفة. يمكن إتمام كل من الأقوال في فترة زمنية قصيرة (~2 ساعة)، مما يعني أنه يمكن إجراء تجارب متعددة في يوم واحد، مما ينتج كميات كبيرة من البيانات دون التضحية بالتكرار أو الدقة. مع هذا الإعداد، يمكن قياس تحمل الحرارة من 96 الذباب في وقت واحد، في حينأن العمود ل دقيقة CT يمكن أن تعقد أكثر من 100 الذباب، شريطة أن يكون هناك مساحة سطحية كافية لتجثم.
طريقة عالية الإنتاجية لمراقبة CTmin بتعديل منهجية العمود المبستر المشترك مع إضافة مستشعر الأشعة تحت الحمراء لحساب الذباب تلقائيًا. وقد اقترح شومان وآخرون استخدام جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء للعد لأول مرة في عام 199623 ولكن لم يتم اعتماده على نطاق واسع. إضافة جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء يسمح لتوليد البيانات المستمرة بدلا من جمع البيانات على فترات منفصلة. كما يقلل هذا البروتوكول من خطأ المجرب عن طريق التخلص من إدخال البيانات اليدوي والحاجة إلى تبديل أنابيب التجميع يدويًا أسفل العمود المُقَدَّد عند نقاط زمنية منفصلة.
يتم تعديل طريقة عالية الإنتاجية لتسجيل KDT الحرارة من دراستين سابقتين من التسامح الحراري في الحشرات10،12. يتم تخزين الذباب الفردي في لوحة 96 بئر في حاضنة درجة الحرارة يتم تسجيل الفيديو. يقلل هذا البروتوكول من تحيز المجرب في تحديد KDT الحرارة لأنه يمكن مراجعة التجارب والتحقق من ذلك عن طريق تشغيل التسجيل مرة أخرى. كما يوفر هذا البروتوكول مجموعة من البرامج النصية Python المخصصة التي يمكن استخدامها لتسريع تحليل الفيديو. استخدام الآبار الفردية يزيل التداخل الذي يمكن أن يحدث عندما يتحرك الأفراد الآخرين أو يسقطون ، والتي يمكن أن تكون مشكلة عندما يتم ملاحظة مجموعات من الأفراد في نفس الساحة10،17. وعلاوة على ذلك، فإن الحاضنة التي يتم التحكم فيها بدرجة حرارة توفر درجة حرارة مستقرة عبر جميع الآبار الـ 96، على عكس تدرج درجة الحرارة الذي لوحظ أحيانًا عبر كتلة ألمنيوم يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة10. لاحظ أيضاً أنه يمكن تكييف طريقة تسجيل 96 جيداً لقياسالحد الأقصى الديناميكي للتصوير المقطعي المحوسب ويحتمل أن يكون CTmin (انظر المناقشة).
لإثبات كل بروتوكول، تم مقارنة الحدود الحرارية للإناث الزميل Drosophila الكبار من خطوط مختارة من الفريق المرجعي الوراثي Drosophila melanogaster (DGRP)24. وقد تم اختيار هذه الخطوط لأن التجارب الأولية أشارت إلى اختلافات كبيرة في التسامح الحراري. وقد أثبتت هذه الأقوال أنها أساليب قوية للتمييز بين الاختلافات في التسامح الحراري. البروتوكولين التاليين ، عالية الإنتاجية CTmin المقايسة (القسم 1) وعالية الإنتاجية الحرارة KD مقايسة (القسم 2) ، ووصف الإجراءات اللازمة لإنتاج CTmin والحرارة KDT البيانات عن أي مرحلة حياة الحشرات motile قادرة على تركيب في الأجهزة ، مثل Drosophilaالكبار . للتصويرالمقطعي دقيقة من الضروري أيضا أن تكون الحشرة قادرة على جثم. هنا, كل مقايسة هو موضح في الكبار Drosophila melanogaster. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات لـ “تصنيف” آخر أو مراحل الحياة6. قد تشمل التغييرات الطفيفة استخدام مواد جثم مع فتحات أكبر لاستيعاب عينات أكبر فيمقايسة دقيقة CT أو استخدام كاميرا ذات جودة أعلى لتمييز KDT خفية من حشرة بطيئة الحركة أو مرحلة الحياة في اختبار KD الحرارة. هذا البروتوكول لا يصف أساليب إعداد الذباب ، ولكن من المهم توحيد بروتوكولات تربية لضمان تكرار25 (انظر غارسيا وتيتس26 وتيتس وهان27). وتشمل البروتوكولات المقدمة معلومات عن كيفية بناء الأجهزة وإعدادها، وكيفية تسجيل القياسات، ووصف موجز لتحليل البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقتان المفصلتان أعلاه تولدان بيانات عالية الإنتاجية للمقاييس ذات الصلة من الناحية الإيكولوجية للحدود الحرارية العليا والدنيا. وتستند هذه البروتوكولات إلى منهجيات سبق وضعها في البحوث المتعلقة بالقيود الحرارية للحشرات (ملخصة في Sinclair et al.) 6.يمكن الانتهاء من كل من البروت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر (إيلي مكابي) على مساعدتها في تربية الذبابة ويدعم هذا العمل من قبل وزارة الزراعة الأمريكية المعهد الوطني للأغذية والزراعة مشروع منحة 1010996 والمؤسسة الوطنية للعلوم منحة OIA -1826689 لN.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
