Analisi ad alta velocità di produzione dei limiti termici critici negli insetti
Summary
I limiti termici possono prevedere gli ambienti che gli organismi tollerano, che sono informazioni preziose di fronte al rapido cambiamento climatico. Qui descritti sono protocolli ad alto rendimento per valutare il minimo termico critico e il tempo di abbattimento del calore negli insetti. Entrambi i protocolli massimizzano la velocità effettiva e riducono al minimo il costo dei test.
Abstract
I limiti termici superiori e inferiori di piante e animali sono importanti predittori delle loro prestazioni, sopravvivenza e distribuzioni geografiche e sono essenziali per prevedere le risposte ai cambiamenti climatici. Questo lavoro descrive due protocolli ad alto rendimento per misurare i limiti termici degli insetti: uno per la valutazione della minima termica critica (CTmin)e l’altro per la valutazione del tempo di down del calore (KDT) in risposta a uno stress termico statico. Nelsaggio min CT, gli individui sono collocati in una colonna acrilica-jacketed, sottoposti a una rampa di temperatura decrescente, e contati come cadono dai loro posatoi utilizzando un sensore a infrarossi. Nel saggio termico KDT, gli individui sono contenuti in una piastra di 96 porri, collocata in un’incubatrice impostata su una temperatura stressante e calda e video registrato per determinare il momento in cui non possono più rimanere in posizione verticale e muoversi. Questi protocolli offrono vantaggi rispetto alle tecniche di uso comune. Entrambi i test sono a basso costo e possono essere completati relativamente rapidamente (2 h). Il saggioCT min riduce l’errore dello sperimentatore e può misurare un gran numero di individui contemporaneamente. Il protocollo termo-KDT genera una registrazione video di ogni saggio e quindi rimuove la distorsione dello sperimentatore e la necessità di monitorare continuamente gli individui in tempo reale.
Introduction
Limiti termici degli insetti
La variazione delle condizioni ambientali, compresa la temperatura, è un fattore importante che influenza le prestazioni, la forma fisica, la sopravvivenza e la distribuzione geografica degliorganismi 1,2. I limiti termici superiori e inferiori determinano la gamma teorica di ambienti che un organismo può tollerare e, pertanto, questi limiti sono importanti predittori delle distribuzioni vegetali e animali, soprattutto di fronte ai cambiamenticlimatici 3,4. Pertanto, i protocolli per misurare con precisione i limiti termici sono strumenti importanti per ecologisti, fisiologi, biologi evoluzionisti e biologi della conservazione, tra gli altri.
Come gli animali terrestri più abbondanti e diversi, gli insetti sono spesso utilizzati per misurazioni dei limiti termici. Le maxima termiche critiche (CTmax) e la minima termica critica (CTmin)sono comunemente utilizzate per valutare le variazioni intra e interspecifiche nella tolleranzatermica 5,6,7. Mentre CTmax e CTmin possono essere misurati per più fenotipi, tra cui la crescita, la produzione riproduttiva e il comportamento, sono più comunemente applicati alla funzione locomotore5,6,7. Così, CTmax (chiamato anche temperatura di knockdown di calore) e CTmin sono spesso definiti come le alte e basse temperature a cui gli insetti perdono la funzione motoria e non sono in grado di rimanere in posizioneverticale 5,6,7,8,9,10,11. CTmin coincide con l’insorgenza del coma freddo, una paralisi reversibile causata da temperature fredde6. Mentre la paralisi ai limiti termici è spesso reversibile, l’esposizione continua a queste temperature porta alla morte ecologica5.
Metodi comuni per misurare i limiti termici
Una varietà di apparati sono stati utilizzati per misurare i limiti termici (riepilogo in Sinclair et al.) 6. Brevemente, gli insetti vengono riscaldati o raffreddati in incubatrici12,13, contenitori sommersi in bagni fluidi11,14,15,16, blocchi di alluminio10,17, o contenitori con giubbotto18, e monitorati fino a quando la locomozione cessa. Per monitorare gli insetti durante il test, il metodo più comune è l’osservazione diretta, in cui gli individui sono continuamente monitorati in tempo reale o retrospettivamente con videoregistrati 6,9,10,11,15,17. Mentre i metodi di osservazione diretta hanno requisiti minimi di equipaggiamento, sono ad alta intensità di manodopera e limitano la produttività. In alternativa, gli insetti possono essere osservati indirettamente raccogliendo individui in momenti discreti quando cadono dai posatoi6,19,20,21 o utilizzando monitor di attività13.
I metodi indiretti per la misurazione dei limiti termici sono generalmente più elevati e potenzialmente meno soggetti a errori rispetto ai metodi di osservazione diretta. Il metodo più comune per il monitoraggio indiretto utilizza una colonna con temperaturacontrollata 6,8,19,20,21. Gli insetti sono posizionati all’interno di una colonna con posatoi, e la temperatura della camera interna è controllata da pompaggio di liquido da un bagno fluido a temperatura controllata attraverso il rivestimento con la giacca della colonna. Gli individui che raggiungono il loro limite termico cadono dal loro tresico e vengono raccolti a temperature discrete o intervalli di tempo. Mentre questo metodo funziona bene per CTmin, è stato trovato inadatto per CTmax, perché le mosche camminano volontariamente fuori dal fondo della colonna quando la temperatura aumenta. Il nuovo metodo qui descritto elude questo problema mediante la condilenza individuale dei mosche durante le misurazioni automatizzate.
Oltre al metodo di osservazione, due tipi di regimi di temperatura sono comunemente utilizzati per valutare i limiti termici superiori. I saggi dinamici consistono nell’aumentare gradualmente la temperatura fino alla perdita della funzione motoria; che la temperatura è la dinamica CTmax7,8,9,13. Al contrario, i saggi statici consistono in una temperatura costante stressante fino alla perdita della funzione motoria; quel punto di tempo è il tempo di knockdown di calore (heat KDT), chiamato anche il CTmax statico (sCTmax) in un recente documento di J’rgensen et al.7,8,9,16,22. Anche sei test di TC max e heat knockdown (analisi di calore KD) producono metriche con unità diverse, la modellazione matematica dei due tratti indica che danno informazioni comparabili sulla tolleranza al calore e sono entrambi ecologicamenterilevanti 8,9. I saggi dinamici producono una temperatura che può essere paragonata alle condizioni ambientali, e sono preferibili quando ci sono grandi differenze nella tolleranza al calore, come i confronti tra specie con nicchie termiche molto diverse. Tuttavia, a causa dell’elevato Q10 per l’accumulo di lesioni termico, un saggio statico può essere preferibile per rilevare piccole dimensioni di effetto, come la variazione intraspecifica nella tolleranza alcalore 9. Inoltre, in pratica, un saggio statico richiede attrezzature meno sofisticate di un saggio dinamico.
Obiettivo
L’obiettivo di questo documento è formalizzare i metodi per i testTC min e heat KD che possono essere utilizzati nella ricerca futura per valutare i limiti termici degli insetti motile. I protocolli sono adattati da metodologie precedentemente stabilite e sono progettati per essere ad alta velocità effettiva, automatizzati e convenienti. Entrambi i test possono essere completati in un breve lasso di tempo (2 h), il che significa che più esperimenti possono essere condotti in un solo giorno, producendo grandi quantità di dati senza sacrificare ripetibilità o precisione. Con questa configurazione, la tolleranza al calore di 96 mosche può essere misurata contemporaneamente, mentre la colonna per CTmin può contenere più di 100 mosche, a condizione che vi sia una superficie adeguata per appollaiare.
Il metodo ad alta velocità effettiva per osservare CTmin modifica la metodologia comune delle colonne con l’aggiunta di un sensore a infrarossi per contare automaticamente le mosche. L’uso di un sensore a infrarossi per il conteggio è stato23 proposto per la prima volta da Shuman et al. L’aggiunta del sensore a infrarossi consente la generazione di dati continui anziché la raccolta di dati a intervalli discreti. Questo protocollo riduce anche al minimo l’errore dello sperimentatore eliminando l’immissione manuale dei dati e la necessità di passare manualmente i tubi di raccolta sotto la colonna jacked in punti di tempo discreti.
Il metodo ad alto rendimento per la registrazione del KDT termico viene modificato da due studi precedenti sulla tolleranza al calore negliinsetti 10,12. Le singole mosche vengono conservate in una piastra di 96 po ‘in un’incubatrice a temperatura controllata e viene registrato il video. Questo protocollo riduce al minimo la distorsione dello sperimentatore nel determinare il KDT termico perché gli esperimenti possono essere rivisti e verificati eseguendo la riproduzione della registrazione. Questo protocollo fornisce anche una serie di script Python personalizzati che possono essere utilizzati per velocizzare l’analisi video. L’uso di singoli pozzi elimina le interferenze che possono verificarsi quando altri individui si muovono o cadono, che può essere un problema quando gruppi di individui sono osservati nella stessa arena10,17. Inoltre, l’incubatrice a temperatura controllata fornisce una temperatura stabile in tutti i 96 pozzi, a differenza del gradiente di temperatura talvolta osservato in un blocco di alluminio controllato dallatemperatura 10. Si noti inoltre che il metodo di registrazione dei 96 well può essere adattato per misurare la CTmax dinamica e potenzialmente LA CTmin (vedi Discussione).
Per dimostrare ogni protocollo, i limiti termici delle femmine adulte di Drosophila melanogaster da alcune linee del Pannello di riferimento genetico drosophila melanogaster (DGRP) sono staticonfrontati 24. Queste linee sono state selezionate perché gli esperimenti preliminari hanno indicato differenze significative nella tolleranza termica. Questi saggi si sono rivelati metodi robusti per discriminare le differenze nella tolleranza termica. I seguenti due protocolli, il saggio CTmin ad alta velocità (sezione 1) e il saggio KD termico ad alta velocità (sezione 2), descrivono le azioni necessarie per produrre dati KDT TCmin e heat per qualsiasi fase di vita degli insetti motile in grado di adattarsi agli apparati, come la Drosophilaadulta. Per CTmin è anche essenziale che l’insetto sia in grado di persico. Qui, ogni saggio è dimostrato in adulto Drosophila melanogaster. Tuttavia, possono essere necessarie modifiche per altre fasi di taxa o di vita6. Piccoli cambiamenti potrebbero includere l’utilizzo di materiale appollaiato con aperture più grandi per ospitare campioni piùgrandi nel saggio min CT o l’utilizzo di una fotocamera di qualità superiore per discernere il sottile KDT di un insetto in movimento lento o di una fase di vita nel saggio KD di calore. Questo protocollo non descrive i metodi per la preparazione dei mosche, ma è importante standardizzare i protocolli di allevamento per garantire la ripetibilità25 (vedi Garcia e Teets26 e Teets e Hahn27). I protocolli forniti includono informazioni su come costruire e impostare gli apparati, come registrare le misurazioni e una breve descrizione dell’analisi dei dati.
Protocol
Representative Results
Discussion
I due metodi descritti in precedenza generano dati ad alta velocità di produzione di metriche ecologicamente rilevanti per i limiti termici superiori e inferiori. Questi protocolli si basano su metodologie precedentemente stabilite comuni alla ricerca sui limiti termici degli insetti (riepilogati in Sinclair et al.) 6. Entrambi i protocolli possono essere completati in un breve lasso di tempo (2 h ciascuno), produrre set di dati con grandi dimensioni del campione, non sacrificare la ripetibil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Ellie McCabe per l’assistenza con l’allevamento a mosca. Questo lavoro è sostenuto dal Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti National Institute of Food and Agriculture Hatch Project grant 1010996 e dalla National Science Foundation grant OIA-1826689 a N.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
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