Tests à haut débit des limites thermiques critiques chez les insectes
Summary
Les limites thermiques peuvent prédire les environnements que les organismes tolèrent, ce qui est une information précieuse face au changement climatique rapide. Décrits ici sont des protocoles à haut débit pour évaluer les minima thermiques critiques et le temps de choc thermique chez les insectes. Les deux protocoles maximisent le débit et minimisent le coût des tests.
Abstract
Les limites thermiques supérieures et inférieures des plantes et des animaux sont d’importants prédicteurs de leur performance, de leur survie et de leur répartition géographique, et sont essentielles pour prédire les réponses au changement climatique. Ce travail décrit deux protocoles à haut débit pour mesurer les limites thermiques des insectes : l’un pour l’évaluation des minima thermiques critiques (CTmin),et l’autre pour évaluer le temps d’arrêt de la chaleur (KDT) en réponse à un facteur de stress thermique statique. Dans le test ctmin, les individus sont placés dans une colonne à veste acrylique, soumis à une rampe de température décroissante, et comptés comme ils tombent de leurs perchoirs à l’aide d’un capteur infrarouge. Dans le test de chaleur KDT, les individus sont contenus dans une plaque de puits 96, placé dans un incubateur réglé à une température stressante et chaude, et vidéo enregistrée pour déterminer l’heure à laquelle ils ne peuvent plus rester debout et se déplacer. Ces protocoles offrent des avantages par rapport aux techniques couramment utilisées. Les deux essais sont peu coûteux et peuvent être effectués relativement rapidement (~2 h). Le test CTmin réduit l’erreur de l’expérimentateur et peut mesurer un grand nombre d’individus à la fois. Le protocole KDT de chaleur génère un enregistrement vidéo de chaque essai et supprime ainsi le biais d’expérimentateur et la nécessité de surveiller en permanence les individus en temps réel.
Introduction
Limites thermiques des insectes
La variation des conditions environnementales, y compris la température, est un facteur important influençant la performance, la condition physique, la survie et la répartition géographique des organismes1,2. Les limites thermiques supérieures et inférieures déterminent l’éventail théorique des environnements qu’un organisme peut tolérer et, par conséquent, ces limites sont d’importants prédicteurs des distributions végétales et animales, en particulier face au changement climatique3,4. Ainsi, les protocoles de mesure des limites thermiques sont des outils importants pour les écologistes, les physiologistes, les biologistes évolutionnistes et les biologistes de la conservation, entre autres.
En tant qu’animaux terrestres les plus abondants et les plus diversifiés, les insectes sont fréquemment utilisés pour mesurer les limites thermiques. Les maxima thermiques critiques (CTmax)et les minima thermiques critiques (CTmin)sont couramment utilisés pour évaluer les variations intra- et interspécifiques de la tolérance thermique5,,6,7. Bien que CTmax et CTmin puissent être mesurés pour plusieurs phénotypes, y compris la croissance, la production reproductrice et le comportement, ils sont le plus souvent appliqués à la fonction locomotrice5,,6,7. Ainsi, CTmax (également appelé température de la chaleur knockdown) et CTmin sont souvent définis comme les températures élevées et basses à laquelle les insectes perdent la fonction motrice et sont incapables de rester debout5,6,7,8,9,10,11. CTmin coïncide avec le début du coma froid, une paralysie réversible provoquée par des températures froides6. Alors que la paralysie aux limites thermiques est souvent réversible, l’exposition continue à ces températures conduit à la mort écologique5.
Méthodes courantes de mesure des limites thermiques
Une variété d’appareils ont été utilisés pour mesurer les limites thermiques (résumé dans Sinclair et al.) 6. En bref, les insectes sont chauffés ou refroidis dans des incubateurs12,13, conteneurs immergés dans des bains fluides11,14,15,16, blocs d’aluminium10,17, ou conteneurs à veste18, et surveillés jusqu’à ce que la locomotion cesse. Pour surveiller les insectes pendant l’essai, la méthode la plus courante est l’observation directe, dans laquelle les individus sont surveillés en permanence en temps réel ou rétrospectivement avec la vidéo enregistrée6,9,10,11,15,17. Bien que les méthodes d’observation directe aient des exigences minimales en matière d’équipement, elles exigent beaucoup de main-d’œuvre et limitent le débit. Alternativement, les insectes peuvent être observés indirectement en recueillant des individus à des moments discrets comme ils tombent de perchoirs6,19,20,21 ou en utilisant des moniteurs d’activité13.
Les méthodes indirectes de mesure des limites thermiques sont généralement plus élevées et potentiellement moins sujettes aux erreurs que les méthodes d’observation directe. La méthode la plus courante de surveillance indirecte utilise une colonne à température contrôléeveste 6,,8,19,20,21. Les insectes sont placés à l’intérieur d’une colonne avec des perchoirs, et la température de la chambre intérieure est contrôlée par le pompage du liquide d’un bain fluide à température contrôlée à travers la doublure veste de la colonne. Les individus qui atteignent leur limite thermique tombent de leur perchoir et sont recueillis à des températures discrètes ou à des intervalles de temps. Bien que cette méthode fonctionne bien pour CTmin, il a été jugé inapproprié pour CTmax, parce que les mouches volontairement sortir du fond de la colonne lorsque la température augmente. La nouvelle méthode décrite ici contourne ce problème en contenant individuellement des mouches lors de mesures automatisées.
En plus de la méthode d’observation, deux types de régimes de température sont couramment utilisés pour évaluer les limites thermiques supérieures. Les essais dynamiques consistent à augmenter progressivement la température jusqu’à ce que la fonction motrice soit perdue; cette température est la dynamique CTmax7,8,9,13. En revanche, les tests statiques se composent d’une température stressante constante jusqu’à ce que la fonction motrice soit perdue; ce point de temps est le temps de la chaleur knockdown (chaleur KDT), également appelé le statique CTmax (sCTmax) dans un article récent par Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Bien que les tests de CTmax et de knockdown thermique (essais de chaleur KD) produisent des métriques avec des unités différentes, la modélisation mathématique des deux traits indique qu’ils donnent des informations comparables sur la tolérance à la chaleur et sont tous deux écologiquement pertinents8,9. Les essais dynamiques donnent une température qui peut être comparée aux conditions environnementales, et ils sont préférables lorsqu’il y a de grandes différences dans la tolérance à la chaleur, comme les comparaisons entre les espèces ayant des niches thermiques très différentes. Toutefois, en raison du Q10 élevé pour l’accumulation de blessures par la chaleur, un test statique peut être préférable pour détecter de petites tailles d’effet, telles que la variation intraspécifique de la tolérance thermique9. En outre, pratiquement parlant, un test statique nécessite un équipement moins sophistiqué qu’un test dynamique.
Objectif
L’objectif de cet article est de formaliser les méthodes de ctmin et de tests de chaleur KD qui peuvent être utilisés dans des recherches futures pour évaluer les limites thermiques des insectes motiles. Les protocoles sont adaptés à partir de méthodologies établies précédemment et sont conçus pour être à haut débit, automatisés et rentables. Les deux essais peuvent être effectués en peu de temps (~2 h), ce qui signifie que plusieurs expériences peuvent être menées en une seule journée, produisant de grandes quantités de données sans sacrifier la répétabilité ou la précision. Avec cette configuration, la tolérance thermique de 96 mouches peut être mesurée simultanément, tandis que la colonne de CTmin peut contenir plus de 100 mouches, à condition qu’il y ait une surface adéquate pour se percher.
La méthode de haut débit pour observer CTmin modifie la méthodologie commune de colonne de veste avec l’ajout d’un capteur infrarouge pour compter automatiquement les mouches. L’utilisation d’un capteur infrarouge pour le comptage a été proposée pour la première fois par Shuman et coll. en 199623, mais n’a pas été largement adoptée. L’ajout du capteur infrarouge permet la production de données continues plutôt que de recueillir des données à intervalles distincts. Ce protocole minimise également l’erreur de l’expérimentateur en éliminant la saisie manuelle des données et la nécessité de commuter manuellement les tubes de collecte sous la colonne jacked à des points de temps discrets.
La méthode à haut débit pour l’enregistrement de la chaleur KDT est modifiée à partir de deux études antérieures de tolérance à la chaleur chez les insectes10,12. Les mouches individuelles sont stockées dans une plaque de puits de 96 dans un incubateur à température contrôlée et la vidéo est enregistrée. Ce protocole minimise le biais de l’expérimentateur dans la détermination de la chaleur KDT parce que les expériences peuvent être examinées et vérifiées en jouant en arrière de l’enregistrement. Ce protocole fournit également un ensemble de scripts Python personnalisés qui peuvent être utilisés pour accélérer l’analyse vidéo. L’utilisation de puits individuels élimine les interférences qui peuvent se produire lorsque d’autres personnes se déplacent ou tombent, ce qui peut être un problème lorsque des groupes d’individus sont observés dans le même aréna10,17. En outre, l’incubateur à température contrôlée fournit une température stable sur les 96 puits, contrairement au gradient de température parfois observé à travers un bloc d’aluminium à température contrôlée10. Notez également que la méthode d’enregistrement 96 puits peut être adaptée pour mesurer la dynamique CTmax et potentiellement CTmin (voir Discussion).
Pour démontrer chaque protocole, les limites thermiques des femelles adultes Drosophila melanogaster de certaines lignes du Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) ont été comparées24. Ces lignes ont été sélectionnées parce que les expériences préliminaires ont indiqué des différences significatives dans la tolérance thermique. Ces essais se sont avérés être des méthodes robustes pour discriminer les différences dans la tolérance thermique. Les deux protocoles suivants, l’essai de CTmin à haut débit (section 1) et l’essai KD à haute chaleur (section 2), décrivent les mesures nécessaires pour produire des données CTmin et thermiques KDT pour tout stade de vie d’insecte motile capable de s’adapter aux appareils, tels que la Drosophilaadulte . Pour CTmin, il est également essentiel que l’insecte soit capable de se percher. Ici, chaque essai est démontré chez drosophila melanogasteradulte . Toutefois, des modifications peuvent être nécessaires pour d’autres taxons ou étapes de la vie6. Les changements mineurs peuvent inclure l’utilisation de matériaux de perchoir avec de plus grandes ouvertures pour accueillir de plus grands spécimens dans le testde CT min ou l’utilisation d’une caméra de meilleure qualité pour discerner le KDT subtil d’un insecte lent ou étape de vie dans le test de la chaleur KD. Ce protocole ne décrit pas les méthodes de préparation des mouches, mais il est important de normaliser les protocoles d’élevage pour assurer la répétabilité25 (voir Garcia et Teets26 et Teets et Hahn27). Les protocoles fournis comprennent des informations sur la façon de construire et de mettre en place les appareils, comment enregistrer les mesures et une brève description de l’analyse des données.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les deux méthodes détaillées ci-dessus génèrent des données à haut débit de mesures écologiquement pertinentes pour les limites thermiques supérieures et inférieures. Ces protocoles s’appuient sur des méthodologies déjà établies communes à la recherche sur les limites thermiques des insectes (résumées dans Sinclair et al.) 6. Les deux protocoles peuvent être complétés en peu de temps (~2 h chacun), produire des ensembles de données avec de grandes tailles d’échantill…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Ellie McCabe pour son aide à l’élevage des mouches. Ce travail est soutenu par la subvention 1010996 du National Institute of Food and Agriculture De l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture des États-Unis et la National Science Foundation accorde oia-1826689 à N.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
