High-Throughput-Tests kritischer thermischer Grenzwerte bei Insekten
Summary
Thermische Grenzwerte können die Umwelt, die Organismen tolerieren, vorhersagen, was angesichts des raschen Klimawandels wertvolle Informationen ist. Hier werden Protokolle mit hohem Durchsatz beschrieben, um kritische thermische Minima und Wärmeabstoßzeiten bei Insekten zu bewerten. Beide Protokolle maximieren den Durchsatz und minimieren die Kosten der Assays.
Abstract
Obere und niedrigere thermische Grenzwerte von Pflanzen und Tieren sind wichtige Prädiktoren für ihre Leistung, ihr Überleben und ihre geografische Verteilung und sind für die Vorhersage von Reaktionen auf den Klimawandel unerlässlich. Diese Arbeit beschreibt zwei Hochdurchsatzprotokolle zur Messung von thermischen Grenzwerten für Insekten: eines zur Beurteilung kritischer thermischer Minima (CTmin)und das andere zur Beurteilung der Wärmeabschlagzeit (KDT) als Reaktion auf einen statischen Wärmestressor. ImCT-Min-Assay werden Individuen in einer Acryl-Mantelsäule platziert, einer abnehmenden Temperaturrampe ausgesetzt und mit einem Infrarotsensor von ihren Barschen gezählt. In der Hitze KDT Assay, Individuen sind in einer 96 Brunnenplatte enthalten, in einem Inkubator auf eine stressige, heiße Temperatur gesetzt, und Video aufgezeichnet, um die Zeit zu bestimmen, zu der sie nicht mehr aufrecht bleiben und bewegen können. Diese Protokolle bieten Vorteile gegenüber häufig verwendeten Techniken. Beide Assays sind kostengünstig und können relativ schnell abgeschlossen werden (ca. 2 h). Der CTmin Assay reduziert Experimentatorfehler und kann eine große Anzahl von Individuen auf einmal messen. Das Heat-KDT-Protokoll erzeugt eine Videoaufzeichnung jedes Assays und beseitigt somit die Voreingenommenheit der Experimentier und die Notwendigkeit, Personen kontinuierlich in Echtzeit zu überwachen.
Introduction
Thermische Grenzen von Insekten
Die Variation der Umgebungsbedingungen, einschließlich der Temperatur, ist ein wichtiger Faktor, der die Leistung, Fitness, das Überleben und die geografische Verteilung der Organismen1,2beeinflusst. Obere und untere thermische Grenzwerte bestimmen den theoretischen Bereich der Umgebungen, die ein Organismus tolerieren kann, und daher sind diese Grenzwerte wichtige Prädiktoren für Pflanzen- und Tierverteilungen, insbesondere angesichts des Klimawandels3,4. Daher sind Protokolle zur genauen Messung von thermischen Grenzwerten wichtige Werkzeuge unter anderem für Ökologen, Physiologen, Evolutionsbiologen und Naturschutzbiologen.
Als die am häufigsten vorkommenden und vielfältigsten Landtiere werden Insekten häufig für Messungen der thermischen Grenzwerte verwendet. Kritische thermische Maxima (CTmax) und kritische thermische Minima (CTmin) werden häufig verwendet, um intra- und interspezifische Variationen der thermischen Toleranz5,6,7zu bewerten. Während CTmax und CTmin für mehrere Phänotypen gemessen werden können, einschließlich Wachstum, Fortpflanzungsleistung und Verhalten, werden sie am häufigsten auf die Bewegungsfunktion5,6,7angewendet. So werden CTmax (auch Heat Knockdown Temperatur genannt) und CTmin oft definiert als die hohen und niedrigen Temperaturen, bei denen Insekten die Motorfunktion verlieren und nicht aufrecht bleiben können5,6,7,8,9,10,11. CTmin fällt mit dem Beginn des kalten Koma, eine reversible Lähmung durch kalte Temperaturen6. Während Lähmungen an den thermischen Grenzwerten oft reversibel sind, führt die fortgesetzte Exposition gegenüber diesen Temperaturen zum ökologischen Tod5.
Gemeinsame Methoden zur Messung thermischer Grenzwerte
Eine Vielzahl von Geräten wurden verwendet, um thermische Grenzwerte zu messen (zusammengefasst in Sinclair et al.) 6.Kurz gesagt, Insekten werden in Brutkästen12,13erhitzt oder gekühlt, Behälter in Fluidbädern11,,14,15,16, Aluminiumblöcke10,17oder ummantelte Behälter18, und überwacht, bis die Fortbewegung aufhört. Um Insekten während des Assays zu überwachen, ist die häufigste Methode die direkte Beobachtung, bei der Individuen kontinuierlich in Echtzeit oder retrospektiv mit aufgezeichnetem Video6,9,10,11,15,17überwacht werden. Direkte Beobachtungsmethoden haben zwar minimale Ausrüstungsanforderungen, sind aber arbeitsintensiv und begrenzen den Durchsatz. Alternativ können Insekten indirekt beobachtet werden, indem Individuen zu diskreten Zeiten gesammelt werden, wenn sie von Barsche6,,19,,20,21 oder mit Aktivitätsmonitoren13fallen.
Indirekte Methoden zur Messung thermischer Grenzwerte sind im Allgemeinen höher durchsatzweise und potenziell weniger fehleranfällig als direkte Beobachtungsmethoden. Die häufigste Methode für die indirekte Überwachung verwendet eine ummantelte temperaturgesteuerte Säule6,8,19,20,21. Insekten werden in einer Säule mit Barschen platziert, und die Temperatur der inneren Kammer wird durch Pumpen von Flüssigkeit aus einem temperaturgeregelten Flüssigkeitsbad durch das ummantelte Futter der Säule gesteuert. Personen, die ihre thermische Grenze erreichen, fallen von ihrem Barsch und werden in diskreten Temperaturen oder Zeitintervallen gesammelt. Während diese Methode gut für CTminfunktioniert, wurde es für CTmaxungeeignet gefunden, weil Fliegen freiwillig aus dem Boden der Säule gehen, wenn die Temperatur steigt. Die hier beschriebene neue Methode umgeht dieses Problem, indem fliegende Beimessungen einzeln eindämmen.
Neben der Beobachtungsmethode werden häufig zwei Arten von Temperaturregimen verwendet, um die oberen thermischen Grenzwerte zu bewerten. Dynamische Assays bestehen darin, die Temperatur schrittweise zu erhöhen, bis die Motorfunktion verloren geht; dass die Temperatur die dynamische CTmax7,8,9,13ist. Im Gegensatz dazu bestehen statische Assays aus einer konstanten Stresstemperatur, bis die Motorfunktion verloren geht; dieser Zeitpunkt ist die Wärme-Knockdown-Zeit (Wärme KDT), auch als statische CTmax (sCTmax) in einem aktuellen Papier von J.7,8,9,16,22. Obwohl CTmax und Heat Knockdown Assays (Heat KD Assays) Metriken mit unterschiedlichen Einheiten erzeugen, zeigt die mathematische Modellierung der beiden Merkmale an, dass sie vergleichbare Informationen über die Wärmetoleranz liefern und beide ökologisch relevant sind8,9. Dynamische Assays ergeben eine Temperatur, die mit Umgebungsbedingungen verglichen werden kann, und sie sind vorzuziehen, wenn es große Unterschiede in der Wärmetoleranz gibt, wie z. B. Vergleiche zwischen Arten mit sehr unterschiedlichen thermischen Nischen. Aufgrund des hohen Q10 für die Akkumulation von Wärmeverletzungen kann jedoch ein statischer Assay für die Erkennung kleiner Effektgrößen, wie z. B. intraspezifische Variationen der Wärmetoleranz9, vorzuziehen sein. Auch in der Praxis erfordert ein statischer Test weniger ausgeklügelte Ausrüstung als ein dynamischer Assay.
Ziel
Ziel dieses Papiers ist es, Methoden fürCT-Min- und Wärme-KD-Assays zu formalisieren, die in zukünftigen Forschungsarbeiten verwendet werden können, um die thermischen Grenzen von motilen Insekten zu bewerten. Die Protokolle sind an bereits etablierte Methoden angepasst und so konzipiert, dass sie mit hohem Durchsatz, automatisiert und kostengünstig sind. Beide Assays können in kurzer Zeit abgeschlossen werden (ca. 2 h), was bedeutet, dass mehrere Experimente an einem einzigen Tag durchgeführt werden können, wodurch große Datenmengen entstehen, ohne die Wiederholbarkeit oder Genauigkeit zu beeinträchtigen. Mit diesem Setup kann die Wärmetoleranz von 96 Fliegen gleichzeitig gemessen werden, während die Säule für CTmin mehr als 100 Fliegen aufnehmen kann, sofern eine ausreichende Oberfläche zum Perching vorhanden ist.
Die Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von CTmin ändert die übliche Jackensäulenmethodik mit einem Infrarotsensor, um Fliegen automatisch zu zählen. Die Verwendung eines Infrarotsensors zum Zählen wurde erstmals 1996 von23 Shuman et al. vorgeschlagen, aber nicht weit verbreitet. Die Zugabe des Infrarotsensors ermöglicht die Generierung kontinuierlicher Daten, anstatt Daten in diskreten Intervallen zu sammeln. Dieses Protokoll minimiert auch Experimentierfehler, indem die manuelle Dateneingabe und die Notwendigkeit, Sammelrohre unter der buchsenden Spalte manuell zu diskreten Zeitpunkten zu wechseln, eliminiert wird.
Die Hochdurchsatzmethode zur Wärmeerfassung KDT wird aus zwei früheren Studien zur Wärmetoleranz bei Insekten10,12modifiziert. Einzelne Fliegen werden in einer 96-Well-Platte in einem temperaturgeregelten Inkubator gelagert und Video aufgenommen. Dieses Protokoll minimiert die Voreingenommenheit der Experimentatoren bei der Bestimmung von Wärme-KDT, da Experimente durch Abspielen der Aufzeichnung überprüft und überprüft werden können. Dieses Protokoll bietet auch eine Reihe von benutzerdefinierten Python-Skripts, die verwendet werden können, um die Videoanalyse zu beschleunigen. Die Verwendung von einzelnen Brunnen eliminiert Interferenzen, die auftreten können, wenn andere Personen sich bewegen oder umfallen, was ein Problem sein kann, wenn Gruppen von Individuen in der gleichen Arena beobachtet werden10,17. Darüber hinaus bietet der temperaturgeregelte Inkubator eine stabile Temperatur über alle 96 Brunnen, im Gegensatz zu dem Temperaturgradienten, der manchmal über einen temperaturgeregelten Aluminiumblock10beobachtet wird. Beachten Sie auch, dass die 96-Well-Aufnahmemethode angepasst werden kann, um dynamische CTmax und potenziell CTmin zu messen (siehe Diskussion).
Um jedes Protokoll zu demonstrieren, wurden die thermischen Grenzen der erwachsenen Drosophila melanogaster Weibchen aus ausgewählten Linien des Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP)24verglichen. Diese Linien wurden ausgewählt, weil vorläufige Experimente auf signifikante Unterschiede in der thermischen Toleranz hindeuteten. Diese Assays erwiesen sich als robuste Methoden zur Unterscheidung von Unterschieden in der thermischen Toleranz. Die folgenden beiden Protokolle, Hochdurchsatz-CT-Min-Assay (Abschnitt 1) und Hochdurchsatz-Wärme-KD-Assay (Abschnitt 2), beschreiben die notwendigen Maßnahmen zur Herstellung vonCT-Min- und Wärme-KDT-Daten für jedes motile Insektenleben, das in die Geräte passen kann, wie z. B. erwachsene Drosophila.min Für CTmin ist es auch wichtig, dass das Insekt in der Lage zu barsch. Hier wird jeder Assay bei erwachsenen Drosophila melanogasternachgewiesen. Änderungen können jedoch für andere Taxa oder Lebensphasen erforderlich sein6. Kleinere Änderungen können die Verwendung von Perching-Material mit größeren Öffnungen sein, um größere Proben imCT-Min-Assay unterzubringen, oder die Verwendung einer höherwertigen Kamera, um die subtile KDT eines sich langsam bewegenden Insekts oder lebenserhaltenden Stadiums im KD-Wärmetest zu erkennen. Dieses Protokoll beschreibt keine Methoden zur Vorbereitung von Fliegen, aber es ist wichtig, Aufzuchtprotokolle zu standardisieren, um die Wiederholbarkeit25 zu gewährleisten (siehe Garcia und Teets26 und Teets und Hahn27). Die bereitgestellten Protokolle enthalten Informationen über den Aufbau und die Einrichtung der Geräte, die Aufzeichnung von Messungen und eine kurze Beschreibung der Datenanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beiden oben beschriebenen Methoden erzeugen Hochdurchsatzdaten ökologisch relevanter Metriken für obere und untere thermische Grenzwerte. Diese Protokolle bauen auf bereits etablierten Methoden auf, die für die Erforschung von Insektengrenzwerten üblich sind (zusammengefasst in Sinclair et al.) 6.Beide Protokolle können in kurzer Zeit (jeweils 2 h) abgeschlossen werden, erstellen Datensätze mit großen Stichprobengrößen, opfern keine Wiederholbarkeit oder Genauigkeit und minimieren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ellie McCabe für die Unterstützung bei der Fliegenzucht. Diese Arbeit wird vom United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project Grant 1010996 und National Science Foundation Grant OIA-1826689 an N.M.T. unterstützt.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
