Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos
Summary
Os limites térmicos podem prever os ambientes que os organismos toleram, que são informações valiosas diante das rápidas mudanças climáticas. Descritos aqui estão protocolos de alta produtividade para avaliar minima térmico crítico e tempo de knockdown de calor em insetos. Ambos os protocolos maximizam o rendimento e minimizam o custo dos ensaios.
Abstract
Limites térmicos superiores e inferiores de plantas e animais são importantes preditores de seu desempenho, sobrevivência e distribuições geográficas, e são essenciais para prever respostas às mudanças climáticas. Este trabalho descreve dois protocolos de alta produtividade para medir limites térmicos de insetos: um para avaliar minima térmica crítica (CTmin),e outro para avaliar o tempo de queda de calor (KDT) em resposta a um estressor de calor estático. No ensaiomin ct, os indivíduos são colocados em uma coluna com jaqueta acrílica, submetidos a uma rampa de temperatura decrescente, e contados à medida que caem de suas poltronas usando um sensor infravermelho. No ensaio de calor KDT, os indivíduos estão contidos em uma placa de 96 poços, colocados em uma incubadora definida a uma temperatura estressante, quente e vídeo gravado para determinar o tempo em que eles não podem mais permanecer eretos e se mover. Esses protocolos oferecem vantagens em relação às técnicas comumente utilizadas. Ambos os ensaios são de baixo custo e podem ser concluídos relativamente rapidamente (~2 h). O ensaiomin ct reduz o erro do experimentador e pode medir um grande número de indivíduos ao mesmo tempo. O protocolo de calor KDT gera um registro de vídeo de cada ensaio e, portanto, remove o viés do experimentador e a necessidade de monitorar continuamente os indivíduos em tempo real.
Introduction
Limites térmicos de insetos
A variação das condições ambientais, incluindo a temperatura, é um fator importante que influencia o desempenho, a aptidão, a sobrevivência e a distribuição geográfica dos organismos1,,2. Limites térmicos superiores e inferiores determinam a gama teórica de ambientes que um organismo pode tolerar e, portanto, esses limites são importantes preditores de distribuições vegetais e animais, especialmente diante das mudanças climáticas3,,4. Assim, os protocolos para medir com precisão os limites térmicos são importantes ferramentas para ecologistas, fisiologistas, biólogos evolucionários e biólogos de conservação, entre outros.
Como os animais terrestres mais abundantes e diversos, os insetos são frequentemente usados para medições de limites térmicos. Máxima térmica crítica (CTmax) e minima térmica crítica (CTmin) são comumente utilizadas para avaliar a variação intra e interespecífica na tolerância térmica5,,6,7. Enquanto a tomografiamáxima e aTC min podem ser medidas para fenótipos múltiplos, incluindo crescimento, produção reprodutiva e comportamento, eles são mais comumente aplicados à função locomotor5,,6,,7. Assim, a tomografiamáxima (também chamada de temperatura de knockdown de calor) e CTmin são muitas vezes definidas como as altas e baixas temperaturas em que os insetos perdem a função motora e são incapazes de permanecer em pé5,6,,7,,8,9,,10,11. Ctmin coincide com o início do coma frio, uma paralisia reversível provocada pelas temperaturas frias6. Embora a paralisia nos limites térmicos seja muitas vezes reversível, a exposição contínua a essas temperaturas leva à morte ecológica5.
Métodos comuns para medir limites térmicos
Uma variedade de aparelhos têm sido usados para medir limites térmicos (resumidos em Sinclair et al.) 6. Brevemente, os insetos são aquecidos ou resfriados em incubadoras12,13, recipientes submersos em banhos fluidos11,,14,15,,16, blocos dealumínio 10,,17ou recipientes cobertos18, e monitorados até que a locomoção cesse. Para monitorar insetos durante o ensaio, o método mais comum é a observação direta, na qual os indivíduos são continuamente monitorados em tempo real ou retrospectivamente com vídeo gravado6,,9,10,,11,,15,,17. Embora os métodos de observação direta tenham requisitos mínimos de equipamento, eles são intensivos em mão-de-obra e limitam o rendimento. Alternativamente, os insetos podem ser observados indiretamente coletando indivíduos em horários discretos à medida que caem dos poleiros6,,19,,20,,21 ou utilizando monitores de atividade13.
Os métodos indiretos para medir limites térmicos são geralmente mais elevados e potencialmente menos propensos a erros do que os métodos de observação direta. O método mais comum para monitoramento indireto utiliza uma coluna controlada pela temperatura6,,8,,19,20,21. Os insetos são colocados dentro de uma coluna com poltronas, e a temperatura da câmara interna é controlada pelo bombeamento do fluido de um banho de fluido controlado pela temperatura através do revestimento revestido da coluna. Indivíduos que atingem seu limite térmico caem de seu poleiro e são coletados a temperaturas discretas ou intervalos de tempo. Embora este método funcione bem para ctmin, foi encontrado inadequado para ctmax, porque moscas voluntariamente saem da parte inferior da coluna quando a temperatura aumenta. O novo método descrito aqui contorna esse problema contendo individualmente moscas durante medições automatizadas.
Além do método de observação, dois tipos de regimes de temperatura são comumente utilizados para avaliar limites térmicos superiores. Os ensaios dinâmicos consistem em aumentar gradualmente a temperatura até que a função motora seja perdida; que a temperatura é a ct dinâmicamáx7,,8,9,13. Em contraste, os ensaios estáticos consistem em uma temperatura estressante constante até que a função motora seja perdida; esse ponto de tempo é o tempo de knockdown de calor (calor KDT), também chamado de CT estáticomax (sCTmax) em um artigo recente por Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Embora os ensaiosde nocaute de TC max e heat knockdown (ensaios de KD de calor) produzam métricas com diferentes unidades, a modelagem matemática dos dois traços indica que eles dão informações comparáveis sobre tolerância ao calor e são ambos ecologicamente relevantes8,,9. Ensaios dinâmicos produzem uma temperatura que pode ser comparada às condições ambientais, e são preferíveis quando há grandes diferenças na tolerância ao calor, como comparações entre espécies com nichos térmicos amplamente diferentes. No entanto, devido ao alto Q10 para acúmulo de lesões térmicas, um ensaio estático pode ser preferível para detectar tamanhos de pequenos efeitos, como variação intraespecífica na tolerância ao calor9. Além disso, praticamente falando, um ensaio estático requer equipamentos menos sofisticados do que um ensaio dinâmico.
Objetivo
O objetivo deste artigo é formalizar métodos para ensaios de DCmin e heat KD que podem ser utilizados em pesquisas futuras para avaliar os limites térmicos dos insetos motile. Os protocolos são adaptados de metodologias previamente estabelecidas e são projetados para serem de alto rendimento, automatizados e econômicos. Ambos os ensaios podem ser concluídos em um curto espaço de tempo (~2 h), o que significa que vários experimentos podem ser realizados em um único dia, produzindo grandes quantidades de dados sem sacrificar a repetibilidade ou a precisão. Com esta configuração, a tolerância ao calor de 96 moscas pode ser medida simultaneamente, enquanto a coluna para CTmin pode conter mais de 100 moscas, desde que haja área de superfície adequada para empinamento.
O método de alta produtividade para observação dect min modifica a metodologia comum da coluna com a adição de um sensor infravermelho para contar automaticamente moscas. O uso de um sensor infravermelho para contagem foi proposto pela primeira vez por Shuman et al. em 199623, mas não foi amplamente adotado. A adição do sensor infravermelho permite a geração de dados contínuos em vez de coletar dados em intervalos discretos. Este protocolo também minimiza o erro do experimentador, eliminando a entrada manual de dados e a necessidade de alternar manualmente os tubos de coleta abaixo da coluna tomada em pontos de tempo discretos.
O método de alta produtividade para registro de KDT térmico é modificado a partir de dois estudos anteriores de tolerância ao calor em insetos10,12. Moscas individuais são armazenadas em uma placa de 96 poços em uma incubadora controlada pela temperatura e o vídeo é gravado. Este protocolo minimiza o viés do experimentador na determinação do KDT de calor porque os experimentos podem ser revisados e verificados reproduzindo a gravação. Este protocolo também fornece um conjunto de scripts Python personalizados que podem ser usados para acelerar a análise de vídeo. O uso de poços individuais elimina a interferência que pode ocorrer quando outros indivíduos se movem ou caem, o que pode ser um problema quando grupos de indivíduos são observados na mesma arena10,17. Além disso, a incubadora controlada pela temperatura fornece uma temperatura estável em todos os 96 poços, ao contrário do gradiente de temperatura às vezes observado em um bloco de alumínio controlado pela temperatura10. Observe também que o método de gravação do poço 96 pode ser adaptado para medir a tomografiadinâmica máxima e potencialmente CTmin (ver Discussão).
Para demonstrar cada protocolo, foram comparados os limites térmicos de fêmeas adultas de melanogaster Drosophila de linhas selecionadas do Painel de Referência Genética de Melanogaster Drosophila (DGRP) foram comparados24. Estas linhas foram selecionadas porque experimentos preliminares indicaram diferenças significativas na tolerância térmica. Estes ensaios provaram ser métodos robustos para discriminar diferenças na tolerância térmica. Os seguintes protocolos, ensaioct min de alta produtividade (seção 1) e ensaio de calor de alto rendimento KD (seção 2), descrevem as ações necessárias para produzir dados de CTmin e Heat KDT para qualquer estágio de vida de insetos motile capazes de se encaixar nos aparelhos, como drosophilaadulto . Para ctmin também é essencial que o inseto seja capaz de poleiro. Aqui, cada ensaio é demonstrado em Drosophila melanogasteradulto. No entanto, podem ser necessárias modificações para outras etapas tributárias ou de vida6. Pequenas alterações podem incluir o uso de material de empinamento com aberturas maiores para acomodar espécimes maiores no ensaiomin ct ou usar uma câmera de maior qualidade para discernir o KDT sutil de um inseto em movimento lento ou estágio de vida no ensaio de calor KD. Este protocolo não descreve métodos para preparar moscas, mas é importante padronizar protocolos de criação para garantir a repetibilidade25 (ver Garcia e Teets26 e Teets e Hahn27). Os protocolos fornecidos incluem informações sobre como construir e configurar os aparelhos, como registrar medições e uma breve descrição da análise de dados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os dois métodos detalhados acima geram dados de alto rendimento de métricas ecologicamente relevantes para limites térmicos superiores e inferiores. Esses protocolos baseiam-se em metodologias previamente estabelecidas comuns à pesquisa sobre limites térmicos de insetos (resumidas em Sinclair et al.) 6. Ambos os protocolos podem ser concluídos em um curto espaço de tempo (~2 h cada), produzir conjuntos de dados com grandes tamanhos de amostra, não sacrificar a repetibilidade ou a preci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Ellie McCabe pela ajuda na criação de moscas. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de Agricultura dos Estados Unidos do Projeto Hatch de Alimentos e Agricultura 1010996 e a National Science Foundation concede OIA-1826689 à N.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
