Hoge doorvoertesten van kritieke thermische grenzen bij insecten
Summary
Thermische grenzen kunnen voorspellen de omgevingen organismen tolereren, dat is waardevolle informatie in het gezicht van de snelle klimaatverandering. Hier beschreven zijn high-throughput protocollen om kritische thermische minima en warmte knockdown tijd bij insecten te beoordelen. Beide protocollen maximaliseren de doorvoer en minimaliseren de kosten van de tests.
Abstract
Hogere en lagere thermische grenzen van planten en dieren zijn belangrijke voorspellers van hun prestaties, overleving en geografische spreidingen, en zijn essentieel voor het voorspellen van reacties op klimaatverandering. Dit werk beschrijft twee high-throughput protocollen voor het meten van insecten thermische grenzen: een voor de beoordeling van kritische thermische minima (CTmin), en de andere voor de beoordeling van warmte knock down time (KDT) in reactie op een statische hittestressor. In de CTmin test, individuen worden geplaatst in een acryl-jas kolom, onderworpen aan een dalende temperatuur helling, en geteld als ze vallen uit hun zitstokken met behulp van een infrarood sensor. In de hitte KDT test, individuen zijn opgenomen in een 96 put plaat, geplaatst in een incubator ingesteld op een stressvolle, warme temperatuur, en video opgenomen om het tijdstip waarop ze niet meer rechtop kunnen blijven en bewegen te bepalen. Deze protocollen bieden voordelen ten opzichte van veelgebruikte technieken. Beide tests zijn lage kosten en kunnen relatief snel worden voltooid (~ 2 uur). De CTmin test vermindert experimenter fout en kan meten een groot aantal individuen tegelijk. De warmte KDT protocol genereert een video-record van elke test en dus verwijdert experimenter bias en de noodzaak om continu te controleren individuen in real time.
Introduction
Thermische grenzen van insecten
Variatie in omgevingsomstandigheden, met inbegrip van temperatuur, is een belangrijke factor die van invloed is op de prestaties, geschiktheid, overleving en geografische verspreiding van organismen1,2. Boven- en onderwarmtegrenzen bepalen het theoretische bereik van omgevingen die een organisme kan verdragen, en daarom zijn deze grenswaarden belangrijke voorspellers van planten- en dierdistributies, vooral in het licht van de klimaatverandering3,4. Zo zijn protocollen om de thermische grenswaarden nauwkeurig te meten belangrijke instrumenten voor onder andere ecologen, fysiologen, evolutiebiologen en conservatiebiologen.
Als de meest voorkomende en diverse landdieren worden insecten vaak gebruikt voor metingen van thermische limieten. Kritische thermische maxima (CTmax)en kritische thermische minima (CTmin) worden vaak gebruikt om intra- en interspecifieke variatie in thermische tolerantie5,6,7te beoordelen . Terwijl CTmax en CTmin kunnen worden gemeten voor meerdere fenotypes, waaronder groei, reproductieve output en gedrag, worden ze meestal toegepast op motorische functie5,6,7. Zo worden CTmax (ook wel warmte knockdown temperatuur genoemd) en CTmin vaak gedefinieerd als de hoge en lage temperaturen waarbij insecten de motorische functie verliezen en niet rechtop kunnen blijven5,6,7,8,9,10,11. CTmin valt samen met het begin van chill coma, een omkeerbare verlamming veroorzaakt door koude temperaturen6. Terwijl verlamming aan de thermische grenzen vaak omkeerbaar is, leidt voortdurende blootstelling aan deze temperaturen tot ecologische dood5.
Gemeenschappelijke methoden voor het meten van thermische grenswaarden
Er zijn verschillende apparaten gebruikt om thermische limieten te meten (samengevat in Sinclair et al.) 6.Kortom, insecten worden verwarmd of gekoeld in couveuses12,13, containers ondergedompeld in vloeistofbaden11,,14,,15,,16, aluminiumblokken10,,17of gejaste containers18, en bewaakt tot de bewegingsvrijheid ophoudt. Om insecten tijdens de test te monitoren, is de meest voorkomende methode directe observatie, waarbij individuen continu in real time of retrospectief worden gecontroleerd met opgenomen video6,9,10,11,15,17. Hoewel directe observatiemethoden minimale apparatuurvereisten hebben, zijn ze arbeidsintensief en beperken ze de doorvoer. Als alternatief kunnen insecten indirect worden waargenomen door individuen te verzamelen op discrete tijdstippen als ze uit zitstokken6,19,20,,21 vallen of activiteitenmonitorengebruiken 13.
Indirecte methoden voor het meten van thermische grenswaarden zijn over het algemeen een hogere doorvoer en mogelijk minder foutgevoelig dan directe observatiemethoden. De meest voorkomende methode voor indirecte monitoring maakt gebruik van een gejackte temperatuurgecontroleerde kolom6,8,19,20,21. Insecten worden in een kolom met zitstokken geplaatst en de temperatuur van de binnenkamer wordt gecontroleerd door vloeistof uit een temperatuurgestuurd vochtbad door de bekleding van de kolom te pompen. Personen die hun thermische limiet bereiken, vallen van hun baars en worden verzameld bij discrete temperaturen of tijdsintervallen. Hoewel deze methode goed werkt voor CTmin,is het ongeschikt bevonden voor CTmax,omdat vliegen vrijwillig uit de bodem van de kolom lopen wanneer de temperatuur stijgt. De nieuwe methode die hier wordt beschreven omzeilt dit probleem door individueel vliegen te bevatten tijdens geautomatiseerde metingen.
Naast de observatiemethode worden twee soorten temperatuurregimes vaak gebruikt om de bovenste thermische grenswaarden te beoordelen. Dynamische testen bestaan uit het geleidelijk verhogen van de temperatuur totdat de motorische functie verloren gaat; die temperatuur is de dynamische CTmax7,8,9,13. In tegenstelling, statische testen bestaan uit een constante stressvolle temperatuur totdat de motorische functie verloren gaat; dat tijdspunt is de heat knockdown time (heat KDT), ook wel de statische CTmax (sCTmax)genoemd in een recent artikel van Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Hoewel CTmax en warmte knockdown tests (warmte KD-testen) statistieken produceren met verschillende eenheden, geeft wiskundige modellering van de twee eigenschappen aan dat ze vergelijkbare informatie geven over warmtetolerantie en beide ecologisch relevant zijn8,9. Dynamische tests leveren een temperatuur op die kan worden vergeleken met de omgevingsomstandigheden, en ze hebben de voorkeur wanneer er grote verschillen zijn in warmtetolerantie, zoals vergelijkingen tussen soorten met zeer verschillende thermische niches. Vanwege het hoge Q10 voor de accumulatie van hitteletsel kan een statische test echter de voorkeur hebben voor het detecteren van kleine effectgroottes, zoals intraspecifieke variatie in warmtetolerantie9. Ook, praktisch gesproken, een statische test vereist minder geavanceerde apparatuur dan een dynamische test.
Doelstelling
Het doel van dit document is om methoden te formaliseren voor CTmin en warmte KD testen die kunnen worden gebruikt in toekomstig onderzoek om de thermische grenzen van motile insecten te beoordelen. De protocollen zijn aangepast aan de eerder vastgestelde methodologieën en zijn ontworpen om een hoge doorvoer, geautomatiseerd en kosteneffectief te zijn. Beide tests kunnen worden voltooid in een korte tijd (~ 2 uur), wat betekent dat meerdere experimenten kunnen worden uitgevoerd in een enkele dag, het produceren van grote hoeveelheden gegevens zonder in te boeten herhaalbaarheid of nauwkeurigheid. Met deze opstelling kan de warmtetolerantie van 96 vliegen tegelijkertijd worden gemeten, terwijl de kolom voor CTmin meer dan 100 vliegen kan bevatten, mits er voldoende oppervlakte is om te onderkomen.
De hoge doorvoermethode voor het observeren van CTmin wijzigt de gemeenschappelijke jaskolommethodologie met de toevoeging van een infraroodsensor om vliegen automatisch te tellen. Het gebruik van een infraroodsensor voor het tellen werd voor het eerst voorgesteld door Shuman et al. in 199623, maar is niet op grote schaal aangenomen. De toevoeging van de infraroodsensor maakt het mogelijk om continue gegevens te genereren in plaats van met discrete intervallen gegevens te verzamelen. Dit protocol minimaliseert ook experimenterfout door handmatige gegevensinvoer te elimineren en de noodzaak om handmatig van verzamelingsbuis onder de gevijzelde kolom op discrete tijdstippen te schakelen.
De hoge doorvoermethode voor het registreren van warmte KDT is gewijzigd uit twee eerdere studies naar warmtetolerantie bij insecten10,12. Individuele vliegen worden opgeslagen in een 96 put plaat in een temperatuur-gecontroleerde incubator en video wordt opgenomen. Dit protocol minimaliseert de bias van de experimentator bij het bepalen van warmte KDT omdat experimenten kunnen worden beoordeeld en geverifieerd door de opname af te spelen. Dit protocol biedt ook een set aangepaste Python-scripts die kunnen worden gebruikt om video-analyse te versnellen. Het gebruik van individuele putten elimineert interferentie die kan optreden wanneer andere personen bewegen of omvallen, wat een probleem kan zijn wanneer groepen individuen worden waargenomen in dezelfde arena10,17. Bovendien zorgt de temperatuurgecontroleerde incubator voor een stabiele temperatuur in alle 96 putten, in tegenstelling tot de temperatuurgradiënt die soms wordt waargenomen in een temperatuurgestuurd aluminiumblok10. Merk ook op dat de 96 goed opname methode kan worden aangepast aan dynamische CTmax en potentieel CTmin (zie Discussie) te meten.
Om elk protocol aan te tonen, werden de thermische grenzen van volwassen Drosophila melanogaster vrouwtjes uit geselecteerde lijnen van het Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) vergeleken24. Deze lijnen werden geselecteerd omdat voorlopige experimenten significante verschillen in thermische tolerantie aangaven. Deze tests bleken robuuste methoden te zijn om verschillen in thermische tolerantie te discrimineren. De volgende twee protocollen, high-throughput CTmin assay (sectie 1) en high-throughput heat KD-test (sectie 2), beschrijven de noodzakelijke acties om CTmin en warmte KDT-gegevens voor elke motile insect levensfase geschikt voor montage in de apparaten, zoals volwassen Drosophila. Voor CTmin is het ook essentieel dat het insect kan baars. Hier wordt elke test aangetoond in volwassen Drosophila melanogaster. Voor andere taxa – of levensfasen6kunnen echter wijzigingen nodig zijn . Kleine veranderingen kunnen onder meer het gebruik van perching materiaal met grotere openingen om grotere exemplaren in de CTmin test of met behulp van een hogere kwaliteit camera om de subtiele KDT van een langzaam bewegende insect of levensfase in de warmte KD test te onderscheiden. Dit protocol beschrijft geen methoden voor het voorbereiden van vliegen, maar het is belangrijk om opfokprotocollen te standaardiseren om herhaalbaarheid te garanderen25 (zie Garcia en Teets26 en Teets en Hahn27). De verstrekte protocollen bevatten informatie over het bouwen en opzetten van de apparaten, het registreren van metingen en een korte beschrijving van de gegevensanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De twee hierboven beschreven methoden genereren gegevens met een hoge doorvoer van ecologisch relevante statistieken voor hogere en lagere thermische limieten. Deze protocollen bouwen voort op eerder vastgestelde methoden die gemeenschappelijk zijn voor onderzoek naar insectenthermische grenswaarden (samengevat in Sinclair et al.) 6. Beide protocollen kunnen worden voltooid in een korte tijd (~ 2 uur per stuk), produceren gegevenssets met grote steekproefgroottes, niet opofferen herhaalbaarhei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Ellie McCabe voor hulp bij het grootbrengen. Dit werk wordt ondersteund door het United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project grant 1010996 en National Science Foundation subsidie OIA-1826689 aan N.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
