Böceklerde Kritik Termal Limitlerin Yüksek İş Gücü Tahlilleri
Summary
Termal sınırlar organizmaların tolere ettiği ortamları tahmin edebilir, ki bu da hızlı iklim değişikliği karşısında değerli bilgilerdir. Burada açıklanan böceklerde kritik termal minima ve ısı nakavt süresini değerlendirmek için yüksek iş gücü protokolleri vardır. Her iki protokol de iş hacmini en üst düzeye çıkarır ve tahlillerin maliyetini en aza indirir.
Abstract
Bitki ve hayvanların üst ve alt ısısınırları performanslarının, hayatta kalmalarının ve coğrafi dağılımlarının önemli belirleyicileridir ve iklim değişikliğine tepkileri tahmin etmek için gereklidir. Bu çalışma, böcek ısı limitlerini ölçmek için iki yüksek iş gücü protokolünü açıklar: biri kritik termal minima (CTmin)değerlendirmek için, diğeri ise statik ısı gerilme durumuna tepki olarak ısı yıkma süresini (KDT) değerlendirmek için. CTmin teşpinde, bireyler akrilik ceketli bir kolona yerleştirilir, azalan bir sıcaklık rampasına maruz kalırlar ve bir kızılötesi sensör kullanarak tüneklerinden düştükleri için sayılırlar. Isı KDT tsay, bireylerin bir 96 kuyu plaka, stresli, sıcak sıcak bir sıcaklık ayarlanmış bir kuluçka makinesi ne yerleştirilir ve video hangi artık dik ve hareket süresini belirlemek için kaydedilir. Bu protokoller yaygın olarak kullanılan tekniklere göre avantajlar sunar. Her iki tahliller düşük maliyetli ve nispeten hızlı (~ 2 saat) tamamlanabilir. CTmin tsur, deneyci hatasını azaltır ve aynı anda çok sayıda bireyi ölçebilir. Isı KDT protokolü her bir testin bir video kaydı oluşturur ve böylece deneyci önyargısını ve bireyleri sürekli olarak gerçek zamanlı olarak izleme ihtiyacını ortadan kaldırır.
Introduction
Böceklerin Termal sınırları
Sıcaklık da dahil olmak üzere çevre koşullarındaki değişim, organizmaların performansını, fitnessını, hayatta kalma ve coğrafi dağılımını etkileyen önemli bir faktördür1,2. Üst ve alt ısı sınırları bir organizmanın tolere edebileceği ortamların teorik aralığını belirler ve bu nedenle, bu sınırlar özellikle iklim değişikliği karşısında bitki ve hayvan dağılımlarının önemli belirleyicileridir3,4. Bu nedenle, termal limitleri doğru bir şekilde ölçmeprotokolleri ekolojistler, fizyologlar, evrimbiyologları ve koruma biyologları için önemli araçlardır.
En bol ve çeşitli karasal hayvanlar olarak, böcekler sık sık termal sınırların ölçümleri için kullanılır. Kritik termal maksima (CTmax)ve kritik termal minima (CTmin)termal tolerans5,6,,7’dekiintra-ve interspesifik değişimi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. CTmax ve CTmin büyüme, üreme çıkışı ve davranış dahil olmak üzere birden fazla fenotip için ölçülebilir iken, en sık lokomotor fonksiyon5uygulanır,6,7. Böylece, CTmax (Ayrıca ısı nakavt sıcaklığı denir) ve CTmin genellikle böcekler motor fonksiyonunu kaybetmek ve dik kalmak mümkün değildir yüksek ve düşük sıcaklıklar olarak tanımlanır5,6,7,8,9,10,11. CTmin soğuk koma başlangıcı ile çakışıyor, soğuk sıcaklıklar tarafından getirilen bir geri dönüşümlü felç6. Termal sınırlarda felç genellikle geri dönüşümlü iken, bu sıcaklıklara sürekli maruz kalma ekolojik ölüme yol açar5.
Termal limitleri ölçmek için ortak yöntemler
Termal limitleri ölçmek için çeşitli aparatlar kullanılmıştır (Sinclair vd.)’de özetlenmiştir. 6. Kısaca, böcekler ısıtılır veya kuvözlerde soğutulur12,13, sıvı banyoları 11batıkkaplar11,14,15,16, alüminyum bloklar10,17, veya ceketli kaplar18, ve locomotion sona erene kadar izlenir. Tsursırasında böcekleri izlemek için, en yaygın yöntem, bireylerin sürekli olarak gerçek zamanlı olarak veya geriye,dönük olarak kaydedilen video6,9,10,11,15,,17ile izlendiği doğrudan gözlemdir. Doğrudan gözlem yöntemleri minimum ekipman gereksinimlerine sahip olmakla birlikte, emek yoğun ve limit iş gücü. Alternatif olarak, böcekler perçin6,19,,20,,21 veya aktivite monitörleri13kullanarak düşmek gibi ayrık zamanlarda bireylerin toplayarak dolaylı olarak görülebilir.
Termal limitleri ölçmek için dolaylı yöntemler genellikle daha yüksek-iş gücü ve doğrudan gözlem yöntemleri daha potansiyel olarak daha az hata eğilimli. Dolaylı izleme için en yaygın yöntem ceketli sıcaklık kontrollü sütunkullanır 6,8,19,20,21. Böcekler tünekli bir sütunun içine yerleştirilir ve iç haznenin sıcaklığı, sütunun ceketli astarı aracılığıyla sıcaklık kontrollü sıvı banyosundan sıvı pompalayarak kontrol edilir. Termal sınırına ulaşan bireyler levreklerinden düşer ve ayrı sıcaklıklarda veya zaman aralıklarında toplanır. Bu yöntem CTminiçin iyi çalışıyor olsa da , CTmaxiçin uygun bulunmuştur , çünkü sinekler gönüllü olarak sıcaklık artar sütunun alt dışarı yürümek. Burada açıklanan yeni yöntem, otomatik ölçümler sırasında tek tek sinekler içeren bu sorunu aşar.
Gözlem yöntemine ek olarak, üst ısı limitlerini değerlendirmek için iki tür sıcaklık rejimi kullanılır. Dinamik tahliller motor fonksiyonu kaybolana kadar giderek artan sıcaklık oluşur; bu sıcaklık dinamik CTmax7,8,,9,13. Buna karşılık, statik tahliller motor fonksiyonu kaybolana kadar sabit stresli sıcaklık oluşur; bu zaman noktası ısı nakavt süresi (ısı KDT), ayrıca statik CTmax (sCTmax)Jørgensen ve ark.7,8,9,16,22tarafından yeni bir kağıt olarak adlandırılır . CTmax ve ısı nakavt tahlilleri (ısı KD tahlilleri) farklı birimleri ile ölçümler üretmek rağmen, iki özelliğin matematiksel modelleme onlar ısı toleransı hakkında karşılaştırılabilir bilgi vermek gösterir ve her ikisi de ekolojik ilgili8,9. Dinamik tahliller, çevre koşullarına kıyasla karşılaştırılabilir bir sıcaklık verim, ve ısı toleransı büyük farklılıklar olduğunda tercih edilir, yaygın olarak farklı termal nişler ile türler arasında karşılaştırmalar gibi. Ancak, ısı yaralanması birikimi için yüksek Q10 nedeniyle, statik bir tetkik ısı toleransı intraspesifik varyasyon gibi küçük etki boyutları, tespit etmek için tercih edilebilir9. Ayrıca, pratik konuşma, statik bir test dinamik bir test daha az gelişmiş ekipman gerektirir.
Amaç
Bu makalenin amacı, hareketli böceklerin termal sınırlarını değerlendirmek için gelecekteki araştırmalarda kullanılabilecek CTmin ve ısı KD tahlilleri için yöntemleri resmileştirmektir. Protokoller daha önce kurulmuş metodolojilerden uyarlanmıştır ve yüksek iş ortası, otomatik ve uygun maliyetli olacak şekilde tasarlanmıştır. Her iki tahlil de kısa bir süre içinde (~2 saat) tamamlanabilir, bu da birden fazla denemenin tek bir günde yapılabileceği ve tekrarlanabilirlik veya doğrudan ödün vermeden büyük miktarda veri üretülebilir. Bu kurulum ile, 96 sineğin ısı toleransı aynı anda ölçülebilir, CTdk için kolon 100’den fazla sinek tutabilir, tüneme için yeterli yüzey alanı olması koşuluyla.
CTmin’i gözlemlemek için kullanılan yüksek iş yapma yöntemi, sinekleri otomatik olarak saymak için bir kızılötesi sensör eklenmesiyle ortak ceketli sütun metodolojisini değiştirir. Sayım için kızılötesi sensör kullanımı ilk olarak 199623 yılında Shuman ve ark. tarafından önerilmiştir, ancak yaygın olarak benimsenmemiştir. Kızılötesi sensörün eklenmesi, ayrı aralıklarla veri toplamak yerine sürekli veri üretimine olanak tanır. Bu protokol ayrıca, el ile veri girişini ve ayrık zaman noktalarında jakuzi sütunun altında toplama tüplerini el ile değiştirme gereksinimini ortadan kaldırarak deneyci hatasını en aza indirir.
ısı KDT kayıt için yüksek iş yapma yöntemi böceklerde ısı toleransı iki önceki çalışmalardan değiştirilir10,12. Bireysel sinekler sıcaklık kontrollü bir kuluçka makinesinde 96 kuyu plakasında saklanır ve video kaydedilir. Bu protokol, denemeler kaydı nisbeten oynatılarak gözden geçirilip doğrulanabildiği için ısı KDT’yi belirlemede deneyci önyargısını en aza indirir. Bu protokol ayrıca video çözümlemesi hızlandırmak için kullanılabilecek özel Python komut dosyaları kümesi sağlar. Bireysel kuyuların kullanımı, diğer bireylerin hareket veya düşme zaman oluşabilir girişim ortadan kaldırır, bireylerin grupları aynı arenada gözlendiğinde bir sorun olabilir10,17. Ayrıca, sıcaklık kontrollü inkübatör tüm 96 kuyular arasında istikrarlı bir sıcaklık sağlar, sıcaklık gradyanı bazen bir sıcaklık kontrollü alüminyum blok10arasında gözlenen aksine. Ayrıca, 96 iyi kayıt yönteminin dinamik CTmax ve potansiyel OLARAK CTmin ölçmek için uyarlanabileceğini unutmayın (Bkz. Tartışma).
Her protokolü göstermek için, Drosophila melanogaster genetik referans paneli (DGRP) belirli satırları yetişkin Drosophila melanogaster kadınların termal sınırları karşılaştırıldı24. Ön deneyler termal toleransta önemli farklılıklar gösterdiği için bu çizgiler seçilmiştir. Bu tahliller, termal tolerans farklılıkları nı ayırt etmek için sağlam yöntemler olduğunu kanıtlamıştır. Aşağıdaki iki protokol, yüksek verimli CTmin test (bölüm 1) ve yüksek verimli ısı KD test (bölüm 2), herhangi bir hareketli böcek yaşam evresi için CTmin ve ısı KDT verileri üretmek için gerekli eylemleri açıklamak, cihazlar sığabilecek yeteneğine sahip, yetişkin Drosophilagibi. CTmin için de böcek tünemek mümkün olması esastır. Burada, her bir titreyen yetişkin Drosophila melanogastergösterilmiştir. Ancak, değişiklikler diğer takson veya yaşam aşamaları6için gerekli olabilir. Küçük değişiklikler, CTmin teşrinindeki daha büyük numuneleri yerleştirmek için daha büyük açıklıklara sahip tüneme malzemesi kullanmak veya Yavaş hareket eden bir böceğin ince KDT’sini veya ısı KD tamortasındaki yaşam aşamasını ayırt etmek için daha kaliteli bir kamera kullanmak olabilir. Bu protokol sinek hazırlama yöntemlerini tanımlamaz, ancak tekrarlanabilirlik sağlamak için yetiştirme protokollerini standartlaştırmak önemlidir25 (Garcia ve Teets26 ve Teets ve Hahn27’yebakınız). Sağlanan protokoller, cihazların nasıl inşa edilip kurulaaçıklanacağını, ölçümlerin nasıl kaydedilene ve veri analizinin kısa bir açıklamasını içerir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda ayrıntılı olarak kullanılan iki yöntem, üst ve alt ısı sınırları için ekolojik olarak ilgili ölçümlerin yüksek verimli verilerini oluşturur. Bu protokoller böcek Termal limitleri üzerinde araştırma için daha önce kurulmuş metodolojiler üzerine inşa (Sinclair vd.) 6. Her iki protokol de kısa bir süre içinde tamamlanabilir (her biri~2 saat), büyük örnek boyutlarına sahip veri setleri üretebilir, tekrarlanabilirlik veya doğruluktan ödün vermez ve man…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ellie McCabe’e sinek yetiştirme konusunda yardım ları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü Ambar Projesi hibe 1010996 ve Ulusal Bilim Vakfı hibe OIA-1826689 n.M.T tarafından desteklenir.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
