昆虫の臨界熱限界のハイスループットアッセイ
Summary
熱制限は、急速な気候変動に直面した場合に貴重な情報である生物が許容する環境を予測することができます。ここでは、昆虫の重要な熱ミニマと熱ノックダウン時間を評価するためのハイスループットプロトコルを説明します。両方のプロトコルは、スループットを最大化し、アッセイのコストを最小限に抑えます。
Abstract
動植物の上下の熱制限は、その性能、生存、および地理的分布の重要な予測変数であり、気候変動への応答を予測するために不可欠です。この研究は、昆虫の熱限界を測定するための2つのハイスループットプロトコルを説明します:1つは臨界熱ミニマ(CT分)を評価し、もう1つは静的熱ストストレスに応じて熱ノックダウン時間(KDT)を評価するためのものです。CT分 アッセイでは、個人はアクリルジャケットのカラムに入れられ、温度ランプが低下し、赤外線センサーを使用して止まり木から落ちるとカウントされます。熱KDTアッセイでは、個人は96ウェルプレートに含まれ、ストレスの多い高温温度に設定されたインキュベーターに入れられ、ビデオは直立したままで動かなくなった時間を決定します。これらのプロトコルは、一般的に使用される技術よりも優れた利点を提供します。どちらのアッセイも低コストで、比較的迅速に完了できます(〜2時間)。CT分 アッセイは実験者の誤差を減らし、多数の個体を一度に測定できる。熱KDTプロトコルは、各アッセイのビデオ記録を生成し、実験者のバイアスとリアルタイムで個人を継続的に監視する必要性を除去します。
Introduction
昆虫の熱制限
温度を含む環境条件の変動は、生物の性能、フィットネス、生存、および地理的分布に影響を与える主要な要因である 1,,2。上下の熱限界は、生物が許容できる環境の理論的範囲を決定し、したがって、これらの限界は、特に気候変動33、44に直面して、植物および動物の分布の重要な予測値である。したがって、熱限界を正確に測定するためのプロトコルは、生態学者、生理学者、進化生物学者、および保全生物学者にとって重要なツールです。
最も豊富で多様な陸上動物として、昆虫は熱限界の測定に頻繁に使用されます。臨界熱最大(CTmax)および臨界熱小量体(CTmin)は、熱,公差5、6、76における内比および間比比変動を評価するために一般的に使用される。5CTmaxおよびCT最小は、成長、生殖出力、および挙動を含む複数の現象タイプについて測定することができるが、それらは最も一般的に、locomotor関数55、6、76,7に適用される。,7,8,9,10,11したがって、CTmax(ヒートノックダウン温度とも呼ばれる)とCT最小は、しばしば、昆虫が運動機能を失い、6直立状態を保つことができない高温と低温と定義される。CT分は寒冷昏睡の発症と一致し、寒い温度6によってもたらされる可逆性麻痺である。熱限界での麻痺はしばしば可逆的であるが、これらの温度への継続的な暴露は生態学的死に至る5.
熱制限の測定方法の一般的な方法
様々な装置が熱制限を測定するために使用されてきた(Sinclairらで要約されている)。6.簡単に言えば、昆虫は、インキュベーター12、13、液体浴に沈められた容器,1311、14、15、16、アルミニウム1614,15ブロック,1110、17、またはジャケット付き容器18で加熱または冷却され、移動が停止するまで監視される。10,17アッセイ中の昆虫を監視するために、最も一般的な方法は、個人が記録された,ビデオ6、9、10、11、15、179,10,でリアルタイムまたは遡及的に連続的に監視される直接観察15である17。611直接観察方法は、最小限の機器要件を持っていますが、それらは労働集約的であり、スループットを制限します。あるいは、昆虫は、止まり木6、19、20、2119,20から落ちる離6散時に個体を収集することによって間接的に観察することができるか、21または活動モニター13を使用する。
熱制限を測定する間接的な方法は、一般的に、直接観察方法よりも高いスループットと潜在的にエラーが発生しにくい方法です。間接監視の最も一般的な方法では、ジャケット温度制御カラム686、8、19、20、2119,20,21を使用します。,昆虫は止まり木のある柱の中に置かれ、内室の温度はカラムのジャケット付きの裏地を通って温度制御された流体浴から流体をポンピングすることによって制御される。熱限界に達した個人は止まり木から落ち、離散的な温度または時間間隔で収集されます。この方法はCTminに適していますが、温度が上昇するとハエが自発的にカラムの底から出て行くので、CTmaxには適していません。ここで説明する新しい方法は、自動測定中にハエを個別に含めることによって、この問題を回避します。
観測方法に加えて、2種類の温度レジームが一般的に、温度制限の上限を評価するために使用されます。動的アッセイは、モータ機能が失われるまで徐々に温度を上昇させることから成ります。温度は動的CTの最高77、8、9、138,9,13である。これに対して、静的アッセイは、モータ機能が失われるまで一定のストレス温度で構成されています。その時点は熱ノックダウン時間(熱KDT)であり、ヨルゲンセンら,,,77、8、9、16、22による最近の論文では静的CTマックス(sCTmax)とも呼ばれる。,891622CTの最大および熱ノックダウンアッセイ(熱KDアッセイ)は、異なる単位を持つメトリックを生成するが、2つの形質の数学的モデルは、それらが熱耐性に関する同等の情報を与え、両方とも生態学的に関連する8、99であることを示す。8動的アッセイは、環境条件と比較できる温度を生み出し、熱ニッチが大きく異なる種間の比較など、熱耐性に大きな違いがある場合に好ましい。しかしながら、熱損傷蓄積のためのQ10が高いため、熱耐性9の特異性変化などの小さな効果サイズを検出するために静的アッセイが好ましい場合がある。また、実際には、静的なアッセイは、動的なアッセイよりも洗練された装置を必要としません。
目的
本論文の目的は、今後の研究で使用できるCT分 および熱KDアッセイの方法を形式化し、運動性昆虫の熱限界を評価することです。プロトコルは、以前に確立された方法論から適応され、高スループット、自動化、およびコスト効率が高いように設計されています。どちらのアッセイも短時間(〜2時間)で完了することができ、反復性や精度を犠牲にすることなく、1日に複数の実験を行い、大量のデータを生成することができます。この設定により、96ハエの熱耐熱度を同時に測定することができ、CT最小 のカラムは、止まり木に十分な表面積があれば、100以上のハエを保持することができます。
CT分 を観察するためのハイスループット方法は、ハエを自動的にカウントするために赤外線センサーを追加して、共通のジャケットカラム方法論を変更します。計数用赤外線センサの使用は、1996年23 年にShumanらの最初の提案であったが、広く採用されていない。赤外線センサーの追加は、離散間隔でデータを収集するのではなく、連続的なデータを生成することができます。このプロトコルは、手動でのデータ入力を排除し、離散した時点でジャッキ列の下のコレクションチューブを手動で切り替える必要をなくすことで、実験者のエラーを最小限に抑えます。
熱KDTを記録するためのハイスループット方法は、昆虫10,12,12における熱耐性の2つの以前の研究から改変される。個々のハエは温度制御されたインキュベーターの96の井戸の版で貯られ、ビデオは記録される。このプロトコルは、実験を再生して確認できるため、熱KDTを決定する際の実験者のバイアスを最小限に抑えます。このプロトコルは、ビデオ分析を高速化するために使用できるカスタム Python スクリプトのセットも提供します。個々のウェルの使用は、他の個人が移動または転倒したときに発生する可能性のある干渉を排除し、これは、個体群が同じアリーナ10、17,17で観察されたときに問題になる可能性がある。さらに、温度制御インキュベーターは、温度制御されたアルミニウムブロック10にわたって時々観察される温度勾配とは異なり、96のウェル全体にわたって安定した温度を提供する。また、96ウェル記録方式は、動的CTマックスおよびCT最小の測定に適応することができることに注意してください(議論参照)。
各プロトコルを実証するために、ショウジョウバエメラノガスターの一部のラインから成体ショウジョウバエメラノガスターメスの熱限界を遺伝学的参照パネル(DGRP)と比較し、24を比較した。予備的な実験は熱耐性の有意な差を示したので、これらのラインが選択されました。これらのアッセイは、熱耐性の違いを識別するための堅牢な方法であることが判明した。以下の2つのプロトコルは、ハイスループットCT分アッセイ(セクション1)および高スループット熱KDアッセイ(セクション2)、成人よ性ショウジョウバエなどの装置に収まり得る任意のモチル昆虫寿命段階に対してCT分および加熱KDTデータを生成するために必要な行動を記述する。CT分の場合は、昆虫が止まり木にできることも不可欠です。ここでは、各アッセイが成人ショウジョウバエメラノガスターで実証されています。しかし、他の分類またはライフステージ6に変更が必要な場合があります。小さな変更には、CT分アッセイでより大きな標本を収容するために大きな開口部を持つ止まり材を使用するか、より高品質のカメラを使用して、ゆっくりと動く昆虫の微妙なKDTまたは熱KDアッセイのライフステージを識別することが含まれる場合があります。このプロトコルでは、ハエを準備する方法は記述されていませんが、反復性25を確保するために、飼育プロトコルを標準化することが重要です (ガルシアとティーツ26とティーツと Hahn27を参照)。提供されるプロトコルには、装置の構築とセットアップ方法、測定を記録する方法、およびデータ分析の簡単な説明が含まれます。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記の2つの方法は、温度制限の上限と下限に関する生態学的に関連する指標のハイスループットデータを生成します。これらのプロトコルは、昆虫の熱限界に関する研究に共通する以前に確立された方法論に基づいて構築される(Sinclairらにまとめた)。6.両方のプロトコルは、短時間(〜2時間)で完了し、大きなサンプルサイズのデータセットを生成し、再現性や精度を犠?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
エリー・マッケイブのフライ飼育に対する支援に感謝します。この研究は、米国農務省食品農業ハッチプロジェクト助成金1010996と国立科学財団がOIA-1826689をN.M.T.に付与することによって支援されています。
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
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