Высокая пропускная способность анализ критических тепловых пределов у насекомых
Summary
Тепловые ограничения могут предсказывать терпимые к окружающей среде организмы, что является ценной информацией перед лицом быстрого изменения климата. Описаны здесь протоколы высокой пропускной способности для оценки критических тепловых минимумов и теплового нокдауна у насекомых. Оба протокола максимизируют пропускную способность и минимизируют стоимость анализов.
Abstract
Верхние и нижние тепловые пределы растений и животных являются важными предикторами их эффективности, выживания и географического распределения и имеют важное значение для прогнозирования реакции на изменение климата. В этой работе описаны два протокола высокой пропускной способности для измерения тепловых пределов насекомых: один для оценки критических тепловых минимумов (CTmin),а другой для оценки времени стука тепла (KDT) в ответ на статический тепловой стрессор. В анализе CTmin, индивидуалы помещены в acrylic-jacketed колонку, подверглись к уменьшая пандусу температуры, и подсчитаны по мере того как они падают от их окуней используя инфракрасный датчик. В жару KDT анализ, лица, содержащиеся в 96 хорошо пластины, помещены в инкубатор установлен на стрессовой, горячей температуры, и видео, записанные, чтобы определить время, в котором они больше не могут оставаться в вертикальном положении и двигаться. Эти протоколы предлагают преимущества по сравнению с широко используемыми методами. Оба анализа являются недорогими и могут быть завершены относительно быстро (2 ч). Анализ CTmin уменьшает ошибку экспериментатора и может измерять большое количество людей одновременно. Протокол тепла KDT генерирует видеозапись каждого анализа и, таким образом, устраняет предвзятость экспериментатора и необходимость непрерывного мониторинга людей в режиме реального времени.
Introduction
Тепловые пределы насекомых
Изменение состояния окружающей среды, включая температуру, является основным фактором, влияющим на производительность, фитнес, выживание и географическоераспределение организмов 1,,2. Верхние и нижние тепловые пределы определяют теоретический диапазон сред, которые организм может переносить, и, следовательно, эти пределы являются важными предикторами распределения растений и животных, особенно вусловиях изменения климата 3,,4. Таким образом, протоколы точного измерения тепловых пределов являются важными инструментами для экологов, физиологов, эволюционных биологов и биологов-экологов.
Как наиболее распространенные и разнообразные наземные животные, насекомые часто используются для измерения тепловых пределов. Критические тепловые максимы (CTmax)и критическая тепловая минима (CTmin)обычно используются для оценки внутри- и межвидового изменениятеплотерпимости 5,,6,,7. ХотяКТ макс иКТ мин могут быть измерены для нескольких фенотипов, в том числе роста, репродуктивного производства и поведения, они чаще всего применяются клокомотивной функции 5,,6,7. Таким образом,КТ макс (также называемый температурой теплового нокдауна) иКТ мин часто определяются как высокие и низкие температуры, при которых насекомые теряют двигательнуюфункцию и не могут оставаться в вертикальном положении 5,,6,,7,,8,,9,,10,,11. КТ мин совпадает с наступлением холодовой комы, обратимый паралич вызван холодными температурами6. Хотя паралич на тепловых пределов часто обратимым, продолжающееся воздействие этих температур приводит к экологической смерти5.
Общие методы измерения тепловых пределов
Различные аппараты были использованы для измерения тепловых пределов (обобщено в Sinclair et al.) 6.Кратко, насекомые нагреваются илиохлаждаются в инкубаторах 12,,13,контейнеры погружены вжидкие ванны 11,,14,,15,,16,алюминиевые блоки 10,17, иликуртки контейнеры 18, и контролируется до тех пор, пока движение прекращается. Для мониторинга насекомых во время анализа наиболее распространенным методом является прямое наблюдение, в котором люди постоянно контролируются в режиме реального времени или ретроспективно сзаписанным видео6,9,,10,,11,,15,,17. Хотя методы прямого наблюдения имеют минимальные требования к оборудованию, они являются трудоемкими и ограничивают пропускную способность. Кроме того, насекомые могут наблюдаться косвенно, собирая людей в дискретное время, как онипадают с окуней 6,,19,,20,21 или с помощью мониторовактивности 13.
Косвенные методы измерения тепловых пределов, как правило, имеют более высокую пропускную способность и потенциально менее подвержены ошибкам, чем методы прямого наблюдения. Наиболее распространенным методом для косвенного мониторинга используется куртка с температурнымконтролем колонки 6,,8,,19,,20,,21. Насекомые помещаются внутри колонны с окунями, а температура внутренней камеры контролируется путем перекачки жидкости из контролируемой температурой жидкой ванны через куртку подкладка колонны. Лица, достигаемые своего теплового предела, падают со своего окуня и собираются при дискретных температурах или интервалах времени. Хотя этот метод хорошо работает дляКТ мин, было установлено, непригодным дляКТ макс, потому что мухи добровольно выйти из нижней части колонки, когда температура повышается. Новый метод, описанный здесь, обходит эту проблему, индивидуально содержащий мух во время автоматизированных измерений.
В дополнение к методу наблюдения, два типа температурных режимов обычно используются для оценки верхних тепловых пределов. Динамические анализы состоят из постепенного повышения температуры до тех пор, пока двигательная функция не будет утрачена; что температура динамическаяКТ макс7,8,9,13. В отличие от этого, статические анализы состоят из постоянной стрессовой температуры до тех пор, пока двигательная функция не будет потеряна; этот момент времени является тепло нокдаун время (тепло KDT), также называемыйстатический КТ макс (sCTмакс)в недавней работе по J’rgensen и др.7,8,9,16,22. Хотя CTмакс и тепло нокдаун анализы (тепло KD анализы) производят метрики с различными единицами, математическое моделирование двух черт указывает, что они дают сопоставимую информацию о теплотерпимости и оба экологически актуальны8,9. Динамические анализы дают температуру, которую можно сравнить с условиями окружающей среды, и они предпочтительнее, когда существуют большие различия в теплотерпимости, такие как сравнения между видами с широко различными тепловыми нишами. Однако, из-за высокого No 10 для накопления тепловой травмы, статический анализ может быть предпочтительнее для обнаружения небольших размеров эффекта, таких как внутриспецифические различия втеплотерпимости 9. Кроме того, практически говоря, статический анализ требует менее сложного оборудования, чем динамический анализ.
Цель
Цель данной работы заключается в формализации методовКТ мин и тепла KD анализы, которые могут быть использованы в будущих исследованиях для оценки тепловых пределов пестрых насекомых. Протоколы адаптированы из ранее установленных методологий и предназначены для высокой пропускной способности, автоматизированы и экономически эффективны. Оба анализа могут быть завершены в течение короткого периода времени (2 ч), что означает, что несколько экспериментов могут быть проведены в течение одного дня, производя большие объемы данных без ущерба для повторяемости или точности. С помощью этой установки, теплоносимость 96 мух могут быть измерены одновременно, в то время как столб дляКТ мин может ввести более 100 мух, при условии, что есть адекватная площадь поверхности для окуня.
Метод высокой пропускной способности для наблюдения заКТ мин изменяет общую методологию колонки пиджака с добавлением инфракрасного датчика для автоматического подсчета мух. Использование инфракрасного датчика для подсчета голосов было впервые предложено Shuman et al. в 1996году 23, но не было широко принято. Добавление инфракрасного датчика позволяет создавать непрерывные данные, а не собирать данные через дискретные промежутки времени. Этот протокол также сводит к минимуму ошибку экспериментатора, устраняя ручной ввод данных и необходимость вручную переключать трубки сбора ниже вытехаемой колонки в дискретных точках времени.
Метод высокой пропускной способности для записи тепла KDT изменяется из двух предыдущих исследований теплоносимости унасекомых 10,12. Отдельные мухи хранятся в пластине 96 хорошо в температуре контролируемых инкубатор и видео записывается. Этот протокол сводит к минимуму предвзятость экспериментатора в определении тепла KDT, потому что эксперименты могут быть рассмотрены и проверены, отывав запись. Этот протокол также предоставляет набор пользовательских скриптов Python, которые могут быть использованы для ускорения видео-анализа. Использование отдельных скважин устраняет помехи, которые могут возникнуть, когда другие люди перемещаются или падают, что может быть проблемой, когда группы людей наблюдаются в тойже арене 10,17. Кроме того, контролируемый температурой инкубатор обеспечивает стабильную температуру во всех 96 скважинах, в отличие от температурного градиента, иногда наблюдаемого в контролируемом температуройалюминиевом блоке 10. Также обратите внимание, что метод записи 96 хорошо может быть адаптирован для измерения динамическогоКТ макс и потенциально КТмин (см. Обсуждение).
Чтобы продемонстрировать каждый протокол, тепловые пределы взрослых drosophila меланогастер женщин из избранных линий Drosophila меланогастер генетической справочной панели (DGRP)были сравнены 24. Эти линии были выбраны потому, что предварительные эксперименты показали значительные различия в термической толерантности. Эти анализы оказались надежными методами распознавания различий в термической толерантности. Следующие два протокола, высокой пропускной способностиКТ мин анализ (раздел 1) и высокой пропускной способности тепла KD анализ (раздел 2), описывают необходимые действия для производстваКТ мин и тепла KDT данных для любого подвижного насекомого стадии жизни способны установки в аппаратах, таких как взрослый Drosophila. ДляКТ мин также важно, чтобы насекомое было в состоянии окуня. Здесь каждый анализ демонстрируется у взрослого Drosophila melanogaster. Тем не менее, изменения могут потребоваться для других такс или этапов жизни6. Незначительные изменения могут включать в себя использование окуня материал с большими отверстиями для размещения крупных образцов вКТ мин анализа или с помощью камеры более высокого качества, чтобы различить тонкие KDT медленно движущихся насекомых или стадии жизни в тепловой анализ KD. Этот протокол не описывает методы подготовки мух, но важно стандартизировать протоколы воспитания для обеспечения повторяемости25 (см. Гарсия и Teets26 и Teets и Хан27). Представленные протоколы включают информацию о том, как создавать и настроим аппараты, как записывать измерения, а также краткое описание анализа данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эти два метода, описанные выше, генерируют высокотемпутные данные экологически релевантных метрик для верхних и нижних тепловых пределов. Эти протоколы основаны на ранее установленных методологиях, общих для исследования тепловых пределов насекомых (обобщенные в Sinclair et al.) <sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Элли Маккейб за помощь в воспитании мух. Эта работа поддерживается Министерством сельского хозяйства США Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства Hatch проекта гранта 1010996 и Национальный научный фонд грант OIA-1826689 В.М.Т.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
