Ensayos de alto rendimiento de límites térmicos críticos en insectos
Summary
Los límites térmicos pueden predecir los ambientes que toleran los organismos, que es información valiosa frente al rápido cambio climático. Aquí se describen protocolos de alto rendimiento para evaluar el mínimo térmico crítico y el tiempo de derribo del calor en los insectos. Ambos protocolos maximizan el rendimiento y minimizan el costo de los ensayos.
Abstract
Los límites térmicos superiores e inferiores de plantas y animales son importantes predictores de su rendimiento, supervivencia y distribuciones geográficas, y son esenciales para predecir las respuestas al cambio climático. Este trabajo describe dos protocolos de alto rendimiento para medir los límites térmicos de insectos: uno para evaluar el mínimo térmico crítico (CTmin)y el otro para evaluar el tiempo de desmoción de calor (KDT) en respuesta a un factor de estrés térmico estático. En el ensayomínimo de TC, los individuos son colocados en una columna con camisa de acrílico, sometidos a una rampa de temperatura decreciente, y contados a medida que caen de sus perchas usando un sensor infrarrojo. En el ensayo de KDT de calor, los individuos están contenidos en una placa de 96 pozos, colocada en una incubadora ajustada a una temperatura estresante, caliente, y vídeo grabado para determinar el tiempo en el que ya no pueden permanecer erguidos y moverse. Estos protocolos ofrecen ventajas sobre las técnicas de uso común. Ambos ensayos son de bajo costo y se pueden completar con relativa rapidez (2 h). El ensayomínimo de TC reduce el error del experimentador y puede medir un gran número de individuos a la vez. El protocolo KDT de calor genera un registro de vídeo de cada ensayo y, por lo tanto, elimina el sesgo del experimentador y la necesidad de monitorear continuamente a las personas en tiempo real.
Introduction
Límites térmicos de insectos
La variación en las condiciones ambientales, incluida la temperatura, es un factor importante que influye en el rendimiento, la aptitud, la supervivencia y la distribución geográfica de los organismos1,,2. Los límites térmicos superiores e inferiores determinan el rango teórico de ambientes que un organismo puede tolerar, y, por lo tanto, estos límites son importantes predictores de las distribuciones vegetales y animales, especialmente frente al cambio climático3,,4. Por lo tanto, los protocolos para medir con precisión los límites térmicos son herramientas importantes para ecologistas, fisiólogos, biólogos evolutivos y biólogos de conservación, entre otros.
Como los animales terrestres más abundantes y diversos, los insectos se utilizan con frecuencia para las mediciones de los límites térmicos. Los máximos térmicos críticos (CTmax)y los mínimos térmicos críticos (CTmin)se utilizan comúnmente para evaluar la variación intra e interespecífica en la tolerancia térmica5,6,7. Mientras que la TCmax y la TCmin se pueden medir para múltiples fenotipos, incluyendo el crecimiento, la producción reproductiva y el comportamiento, se aplican más comúnmente a la función locomotora5,,6,7. Por lo tanto, CTmax (también llamada temperatura de derribo de calor) y CTmin se definen a menudo como las altas y bajas temperaturas a las que los insectos pierden la función motora y son incapaces de permanecer erguidos5,6,7,8,9,10,11. CTmin coincide con la aparición del coma frío, una parálisis reversible provocada por temperaturas frías6. Si bien la parálisis en los límites térmicos es a menudo reversible, la exposición continua a estas temperaturas conduce a la muerte ecológica5.
Métodos comunes para medir los límites térmicos
Se han utilizado diversos aparatos para medir los límites térmicos (resumidos en Sinclair et al.) 6.Brevemente, los insectos se calientan o enfrían en incubadoras12,13, recipientes sumergidos en baños fluidos11,14,15,16, bloques de aluminio10,17, o contenedores enchatados18, y monitoreados hasta que cesa la locomoción. Para controlar los insectos durante el ensayo, el método más común es la observación directa, en la que los individuos son monitoreados continuamente en tiempo real o retrospectivamente con vídeo grabado6,,9,10,11,15,17. Si bien los métodos de observación directa tienen requisitos mínimos de equipo, consumen mucha mano de obra y limitan el rendimiento. Alternativamente, los insectos pueden ser observados indirectamente mediante la recolección de individuos en momentos discretos ya que caen de las perchas6,19,20,21 o utilizando monitores de actividad13.
Los métodos indirectos para medir los límites térmicos son generalmente de mayor rendimiento y potencialmente menos propensos a errores que los métodos de observación directa. El método más común para el monitoreo indirecto utiliza una columna con camisa de temperatura controladacolumna 6,8,19,20,21. Los insectos se colocan dentro de una columna con perchas, y la temperatura de la cámara interior se controla bombeando líquido desde un baño de fluidos con temperatura controlada a través del revestimiento enchacado de la columna. Los individuos que alcanzan su límite térmico caen de su percha y se recogen a temperaturas discretas o intervalos de tiempo. Mientras que este método funciona bien para CTmin,se ha encontrado inadecuado para CTmax,porque las moscas salen voluntariamente de la parte inferior de la columna cuando la temperatura aumenta. El nuevo método descrito aquí elude este problema al contener individualmente moscas durante las mediciones automatizadas.
Además del método de observación, se utilizan comúnmente dos tipos de regímenes de temperatura para evaluar los límites térmicos superiores. Los ensayos dinámicos consisten en aumentar gradualmente la temperatura hasta que se pierde la función motora; que la temperatura es la TC dinámicamáxima7,8,9,13. Por el contrario, los ensayos estáticos consisten en una temperatura estresante constante hasta que se pierde la función motora; ese punto de tiempo es el tiempo de derribo de calor (calor KDT), también llamado CTestático max (sCTmax) en un artículo reciente por J-rgensen et al.7,8,9,16,22. Aunque los ensayos CTmax y heat knockdown (ensayos de KD térmico) producen métricas con diferentes unidades, el modelado matemático de los dos rasgos indica que proporcionan información comparable sobre la tolerancia al calor y ambos son ecológicamente relevantes8,,9. Los ensayos dinámicos producen una temperatura que se puede comparar con las condiciones ambientales, y son preferibles cuando hay grandes diferencias en la tolerancia al calor, como las comparaciones entre especies con nichos térmicos muy diferentes. Sin embargo, debido al alto Q10 para la acumulación de lesiones por calor, un ensayo estático puede ser preferible para detectar tamaños de efectos pequeños, como la variación intraespecífica en la tolerancia al calor9. Además, prácticamente hablando, un ensayo estático requiere un equipo menos sofisticado que un ensayo dinámico.
Objetivo
El objetivo de este artículo es formalizar métodos para ensayosde KD de CT min y calor que se pueden utilizar en futuras investigaciones para evaluar los límites térmicos de los insectos móviles. Los protocolos se adaptan a partir de metodologías previamente establecidas y están diseñados para ser de alto rendimiento, automatizados y rentables. Ambos ensayos se pueden completar en un corto período de tiempo (2 h), lo que significa que se pueden llevar a cabo varios experimentos en un solo día, produciendo grandes cantidades de datos sin sacrificar la repetibilidad ni la precisión. Con esta configuración, la tolerancia al calor de 96 moscas se puede medir simultáneamente, mientras que la columna para CTmin puede contener más de 100 moscas, siempre que haya una superficie adecuada para posarse.
El método de alto rendimiento para observar CTmin modifica la metodología común de columnas encapuchadas con la adición de un sensor infrarrojo para contar automáticamente las moscas. El uso de un sensor infrarrojo para el recuento fue propuesto por primera vez por Shuman et al. en 199623, pero no ha sido ampliamente adoptado. La adición del sensor infrarrojo permite la generación de datos continuos en lugar de recopilar datos a intervalos discretos. Este protocolo también minimiza el error del experimentador al eliminar la entrada manual de datos y la necesidad de cambiar manualmente los tubos de recolección por debajo de la columna jacked en puntos de tiempo discretos.
El método de alto rendimiento para el registro de calor KDT se modifica de dos estudios previos de tolerancia al calor en insectos10,,12. Las moscas individuales se almacenan en una placa de 96 pozos en una incubadora con temperatura controlada y se graba vídeo. Este protocolo minimiza el sesgo del experimentador para determinar el KDT de calor porque los experimentos se pueden revisar y verificar reproduciendo la grabación. Este protocolo también proporciona un conjunto de scripts de Python personalizados que se pueden utilizar para acelerar el análisis de vídeo. El uso de pozos individuales elimina la interferencia que puede ocurrir cuando otros individuos se mueven o caen, lo que puede ser un problema cuando se observan grupos de individuos en la misma arena10,,17. Además, la incubadora de temperatura controlada proporciona una temperatura estable en los 96 pozos, a diferencia del gradiente de temperatura que a veces se observa en un bloque de aluminio10con temperatura controlada. También tenga en cuenta que el método de grabación de pozos 96 se puede adaptar para medir la TC dinámicamáxima y potencialmente CTmin (ver Discusión).
Para demostrar cada protocolo, se compararon los límites térmicos de las hembras Drosophila melanogaster adultas de líneas selectas del Panel de Referencia Genética de Drosophila melanogaster (DGRP)24. Estas líneas se seleccionaron porque los experimentos preliminares indicaban diferencias significativas en la tolerancia térmica. Estos ensayos demostraron ser métodos robustos para discriminar las diferencias en la tolerancia térmica. Los dos protocolos siguientes, el ensayomínimo de CT de alto rendimiento (sección 1) y el ensayo de KD térmico de alto rendimiento (sección 2), describen las acciones necesarias para producir datos de KDTmin y de calor para cualquier etapa de vida de insectos móviles capaz de encajar en los aparatos, como Drosophilaadulta. Para CTmin también es esencial que el insecto sea capaz de posarse. Aquí, cada ensayo se demuestra en Drosophila melanogasteradulto. Sin embargo, pueden ser necesarias modificaciones para otros taxones o etapas de vida6. Los cambios menores pueden incluir el uso de material de posado con aberturas más grandes para acomodar especímenes más grandes en el ensayomin ct o el uso de una cámara de mayor calidad para discernir el KDT sutil de un insecto en movimiento lento o etapa de vida en el ensayo de KD de calor. Este protocolo no describe los métodos para preparar moscas, pero es importante estandarizar los protocolos de cría para garantizar la repetibilidad25 (véase García y Teets26 y Teets y Hahn27). Los protocolos proporcionados incluyen información sobre cómo construir y configurar los aparatos, cómo registrar mediciones y una breve descripción del análisis de datos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los dos métodos detallados anteriormente generan datos de alto rendimiento de métricas ecológicamente relevantes para los límites térmicos superior e inferior. Estos protocolos se basan en metodologías previamente establecidas comunes a la investigación sobre los límites térmicos de insectos (resumidas en Sinclair et al.) 6.Ambos protocolos se pueden completar en un corto período de tiempo (2 h cada uno), producir conjuntos de datos con grandes tamaños de muestra, no sacrificar la r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Ellie McCabe por la ayuda con la cría de moscas. Este trabajo es apoyado por la subvención 1010996 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos del Proyecto Hatch del Departamento de Agricultura y la Subvención OIA-1826689 a N.M.T.
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
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