昆虫关键热极限的高通量测定
Summary
热极限可以预测生物体所容忍的环境，这是面对快速气候变化的宝贵信息。此处描述的高通量协议用于评估昆虫的关键热最小和热敲取时间。两种协议都最大限度地提高了吞吐量，并最大限度地降低测定的成本。
Abstract
植物和动物的上下热限是预测其性能、生存和地理分布的重要指标，对于预测对气候变化的反应至关重要。这项工作描述了测量昆虫热极限的两种高通量协议：一种用于评估临界热最小值（CTmin），另一种用于评估热敲落时间（KDT）以响应静态热能器。在 CTmin 测定中，个体被放置在丙烯酸套柱中，受到温度下降的斜坡的影响，并使用红外传感器从栖息体上下降时进行计数。在热 KDT 测定中，个体被包含在 96 井板中，放置在培养箱中，温度压力大，并录制视频，以确定他们不能再直立和移动的时间。与常用技术相比，这些协议具有优势。这两种检测成本都很低，可以较快完成（+2小时）。CT最小 测定可减少实验者误差，并可同时测量大量个体。热 KDT 协议生成每个检测的视频记录，从而消除实验者偏差和实时持续监控个体的需要。
Introduction
昆虫的热极限
环境条件的变化，包括温度，是影响生物体1，2的性能，健身，生存和地理分布的主要因素2。上部和下热限决定了生物体能够容忍的环境的理论范围，因此，这些限制是植物和动物分布的重要预测因素，特别是在气候变化面前。,4因此，精确测量热极限的协议是生态学家、生理学家、进化生物学家和保护生物学家等的重要工具。
昆虫作为最丰富、最多样化的陆地动物，经常用于测量热极限。临界热最大值（CT最大值）和临界热最小值（CTmin）通常用于评估热公差,5、6、7,6中特异性和特异性变化。虽然CT最大值和CT最小值可以测量多种表型，包括生长，生殖输出和行为，它们最常应用于运动功能5，6，7。,6,7因此，CT最大值（也称为热敲降温度）和CTmin通常被定义为高低温，昆虫失去运动功能，无法保持直立5，6，7，8，9，10，11。6,7,8,9,10,115CTmin与冷昏迷的开始相吻合，冷温6带来的可逆瘫痪。虽然在热极限下瘫痪通常是可逆的，但持续暴露在这些温度下会导致生态死亡5。
测量热极限的常用方法
各种仪器被用来测量热极限（如辛克莱等人）6.简言之，昆虫在12、13、,浸于液体浴池中的容器12、13、11、14、15、16、,14,15,16铝块1310、17,17或带套的容器18中加热或冷却，并监测直至运动停止。在分析过程中监测昆虫，最常见的方法是直接观察，其中对个体进行实时或回顾性监测，并录下6、9、10、11、15、17。,10,11,15,176,虽然直接观测方法对设备要求最低，但都是劳动密集型的，限制了吞吐量。或者，昆虫可以通过收集个体在离散时间，因为他们,从栖息6，19，20，21,19,20或使用活动监测13间接观察。
与直接观测方法相比，测量热极限的间接方法通常比吞吐量高，而且可能不太容易出错。最常见的间接监测方法使用带衣水的温度控制列6、8、19、20、21。6,8,19,20,21昆虫被放置在带栖息的柱内，内室的温度通过从温度控制流体浴中泵送液体通过柱的套管衬里进行控制。达到其热极限的个人从栖息处下降，并在离散的温度或时间间隔内被收集。虽然这种方法适用于CT分钟，但它已被发现不适合CT最大值，因为当温度升高时，苍蝇会自愿走出柱底。此处描述的新方法通过在自动测量过程中单独包含苍蝇来规避此问题。
除了观察方法外，两种类型的温度制度通常用于评估热上限。动态测定包括逐渐升高的温度，直到运动功能丧失;温度是动态CT最大值max7，8，9，13。,8,9,13相比之下，静态测定由恒定的压力温度组成，直到运动功能丧失;时间点是热敲落时间（热KDT），也被称为静态CT最大值（sCT最大值）在最近的论文由Jürgensen等人,7，8，9，16，22。8,16,2279虽然CT最大值和热敲制测定（热KD测定）产生具有不同单位的指标，但两个特性的数学建模表明它们提供了热耐受性方面可比的信息，并且两者都与生态相关8,8，9。动态测定产生的温度可以与环境条件进行比较，当耐热性差异很大时，例如具有广泛不同热散位物种之间的比较，则更可取。然而，由于热损伤积累的Q10值很高，静态测定对于检测小效应尺寸（如热公差9的特异性变化）可能更可取。此外，实际上，静态检测需要的设备不如动态检测。
目的
本文的目的是正式确定CT最小 和热KD测定的方法，可用于未来的研究，以评估动虫的热极限。这些协议根据以前建立的方法进行改编，设计为高吞吐量、自动化且具有成本效益。这两项测定都可以在短时间内完成（±2小时），这意味着可以在一天中进行多个实验，在不牺牲可重复性或准确性的情况下产生大量数据。通过此设置，可以同时测量 96 只苍蝇的耐热性，而 CTmin 的柱 可以容纳 100 多只苍蝇，前提是有足够的表面积进行栖息。
用于观察 CT min 的高通量方法 通过添加红外传感器来自动计数苍蝇，修改了常见的套护柱方法。Shuman等人于1996年23 日首次提议使用红外传感器进行计数，但一直未得到广泛采用。红外传感器的添加允许生成连续数据，而不是以离散的时间间隔收集数据。该协议还通过消除手动数据输入和在离散时间点手动切换千斤列下方的收集管，最大限度地减少了实验者错误。
从之前对昆虫10、12的耐热性两项研究中，对记录热KDT的高通量方法进行了修改。单个苍蝇储存在温度控制培养箱中的 96 井板中，并录制视频。该协议最大限度地减少了实验者在确定热 KDT 时的偏差，因为可以通过播放录制来审查和验证实验。该协议还提供一组自定义 Python 脚本，可用于加快视频分析速度。使用单个井消除了当其他个体移动或摔倒时可能发生的干扰，当在同一竞技场10、17中观察到个体群体时，可能会造成问题。此外，温度控制培养箱在所有96孔中提供稳定的温度，这与有时在温度控制铝块10上观察到的温度梯度不同。另请注意，96 井记录方法可以调整为测量动态 CT最大值和潜在的 CT最小值（请参阅讨论）。
为了证明每个方案，比较了来自 果蝇 黑色素杆菌遗传参考 小组 （DGRP）选择线的成年果蝇黑色素杆菌女性的热极限。之所以选择这些线，是因为初步实验表明热公差存在显著差异。这些测定证明是区分热公差的强健方法。以下两种协议，高通 量CT最小测定（第1节）和高通量热KD测定（第2节），描述了为能够适应 任何可安装于仪器（如成人果蝇）的昆虫生命阶段生成CT最小值和热KDT数据 的必要操作。对于CT 分钟，昆虫能够栖息也是必不可少的。在这里，每个测定都证明在 成人果蝇黑色素。但是，对于其他分类或生命阶段6可能需要修改。细微的变化可能包括使用具有较大开口的栖息材料，以容纳 CTmin 测定 中更大的样本，或使用更高质量的摄像机来识别慢移动昆虫的细微 KDT 或热 KD 测定中的生命阶段。该协议没有描述准备苍蝇的方法，但重要的是要标准化饲养协议，以确保可重复性25（ 见加西亚和蒂茨26和 Teets和Han27）。提供的协议包括有关如何构建和设置设备、如何记录测量以及数据分析的简要说明的信息。
Protocol
Representative Results
Discussion
上面详述的两种方法生成高通量数据，用于最高和较低的热限的生态相关指标。这些协议以以前确立的昆虫热极限研究共同方法为基地（辛克莱等人总结）。6. 两个协议都可以在短时间内完成（每个协议±2小时），生成具有较大样本量的数据集，不牺牲重复性或准确性，并通过消除手动数据记录和输入（CTmin检测 ）或创建每次检测的备份视频记录（热 KD 测定）来最大…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢艾莉·麦卡比在饲养苍蝇方面提供的援助。这项工作得到了美国农业部国家粮食和农业研究所哈奇项目赠款1010996和国家科学基金会赠款OIA-1826689对N.M.T.的支持。
Materials
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing – 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. . Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
